本發(fā)明涉及基因工程領域，特別是涉及基于金黃色葡萄球菌crispr/cas9(crispr/sacas9)系統特異性敲除人cxcr4基因的方法，以及用于特異性靶向人cxcr4基因的sgrna。

背景技術：

人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)歸屬于逆轉錄病毒科慢病毒屬中的人類慢病毒組，是一種感染人類免疫系統細胞的慢病毒，屬反轉錄病毒的一種，又稱為艾滋病毒，其感染引起的獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)又稱艾滋病，是一種危害性極大的傳染病。自發(fā)現的三十多年來，aids已累計導致兩千余萬人死亡，一直是一個巨大的公眾健康難題，影響著全球3,530萬人的生活。

hiv可分為hiv-1和hiv-2兩種亞型，hiv-1的致病力強，是引起艾滋病的主要病原體。cd4+t細胞是hiv-1病毒感染過程的首要靶點。隨后研究又發(fā)現僅有cd4分子并不能介導hiv-1病毒的侵入，同時還需要一種或幾種輔助受體(coreceptor)。1996年證實，趨化因子受體cxcr4和ccr5是hiv-1病毒感染的輔助受體。t細胞向性x4hiv-1使用cd4和cxcr4進入細胞，而巨噬細胞向性r5hiv-1使用cd4和ccr5。雙向性的毒株能使用cxcr4和ccr5作為共受體。其他趨化因子受體中的ccr3、ccr2、ccr8、cxcr6、cxcr7、cx3cr1能作為更限制亞群的hiv株的共受體發(fā)揮作用。

目前對艾滋病的治療手段主要是控制hiv-1病毒的感染以及阻礙aids的發(fā)展，稱為高效抗逆轉錄病毒治療法(highlyactiveantiretroviraltherapy，haart)，包括一系列抑制病毒各個繁殖階段的化合物。haart是能很大程度上減少細胞內病毒的繁殖和血漿病毒血癥的發(fā)生，但對于新的宿主細胞不被hiv-1感染沒有作用。為了從源頭上預防健康的細胞被hiv-1感染，新的治療方案需要徹底地破壞病毒的入侵途徑，因而以ccr5和cxcr4為靶點的hiv-1受體拮抗劑越來越受關注，主要有趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體、肽類化合物等。如sdf-1(cxcr4的天然配體)以及ccr5的ccl3、ccl4、ccl4-l1和ccl5配體能夠抑制不同株hiv-1引起的細胞融合和感染。

盡管輔助受體拮抗劑可有效預防hiv-1感染，遏制艾滋病的流行，但是此類抑制劑的發(fā)展也面臨著挑戰(zhàn)。長期使用一種抑制劑，最終會使hiv-1產生耐藥性。隨著耐藥性的不斷出現，使得現有的抗hiv-1藥物難以達到理想的治療效果。因此，從基因組層面失活ccr5或cxcr4具有重要的治療價值。

2008年，sangamo成功的利用engineeredzincfingernucleases(zfns)在cd4+t細胞上實現ccr5的敲除。如今這項名為sb-728-t的項目已被嘗試應用于hiv感染人群的基因治療，并已進入臨床二期階段。這一基因編輯產品通過敲除分離到病人的cd4+t細胞的ccr5，然后自體回輸到病人，可以用于hiv感染的治療。但如前面所提及的ccr5受體是巨噬細胞向性r5hiv-1的主要共受體，而t細胞向性x4hiv-1的主要共受體是cxcr4，敲除ccr5并不能治療被雙向性hiv-1感染的患者或者被t細胞向性x4hiv-1感染的患者。因此，通過基因層面敲除cxcr4在x4-向性和雙向性hiv感染的患者中擴展此類治療有明確的醫(yī)學需求。

規(guī)律成簇間隔短回文重復系統(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，crispr-associated，crispr/cas9)是一種具有核酸內切酶活性的復合體，是細菌和古細菌在進化過程中形成的一種免疫防御體系，用以對抗外來病毒和外源dna入侵。crispr/cas9系統通過整合外源dna片段到crispr中，利用crisprrna(crispr-derivedrna，crrna)和反式作用rna(trans-activatingrna，tracrrna)特異性地識別靶向序列，并對序列靶位點進行切割。在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連接(non-homologousendjoining，nhej)，nhej修復的過程中往往會產生dna的插入或缺失(indel)，造成移碼突變，導致基因敲除?；蛘呤窃谟型茨０宓那闆r下，可通過另一條同源重組(homologousrecombination，hr)的修復途徑進行修復，可實現對靶向基因的精確編輯，如引入特異突變或定點轉基因?，F在已經把兩種小rna(crrna和tracrrna)融合成一條rna鏈，簡稱sgrna(singleguiderna)，因此，能夠設計、制備出精確性和特異性靶向目標基因的sgrna也成為crispr/cas9基因敲除的關鍵。

這一技術由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關注，在2012年開始像爆炸一般流行開來。研究人員優(yōu)先選擇改造了來自化膿鏈球菌的cas9酶(streptococcuspyogenescas9,spcas9)來改變高等生物的dna，并已成為一系列高度通用的基因組修飾技術的基礎。最近的一些研究利用crispr/spcas9系統在cd4+t細胞或者cd34+干細胞對艾滋病毒的輔助受體ccr5進行基因修飾，在一定的程度上可以抑制hiv-1病毒的侵入，但是也存在著一定的脫靶率。

最近發(fā)現了一種新的crispr/cas9系統，它是一種是來自金黃色葡糖球菌的cas9酶(staphylococcusaureuscas9,sacas9)，其基因敲除效率與之前的crispr/spcas9系統相當，但是其大小卻減少了25％。腺相關病毒(aav)是基因治療的最佳載體，但是由于其負載能力有限，使其包裝spcas9酶和其他必須的基因元件進入單個病毒顆粒存在一定的難度，而sacas9的出現為這一問題的解決帶來了新的希望。

sacas9與spcas9存在著不同之處，sacas9主要識別5’-nngrrt-3’特征區(qū)域的nggrrt位點，然后對與sgrna互補的dna序列進行剪切，被剪切后斷裂的dna雙鏈通過非同源末端直接連接(non-homologousendjoining，nhej)或者同源重組(homology-directedrepair，hdr)的修補方法進行修復，修復后的dna會由于某些堿基的隨機插入、缺失、突變等使基因的序列發(fā)生改變從而抑制了基因的表達，由此在dna水平上對基因進行定向敲除。而spcas9的識別位點為pam序列5’-ngg-3’，然后再對靶位點進行剪切。

使用spcas9靶向cxcr4進行艾滋病治療，存在以下問題：1)spcas9基因較大，不能方便地利用aav載體進行基因治療；2)spcas9在靶向精確性上有所不足。

sacas9與spcas9相比具有很多優(yōu)點：1)sacas9在哺乳動物體內具有很高的剪切效率，其所帶有的sgrna的長度范圍為21-23個堿基，其本身的大小比spcas9小25％，更有利于aav載體攜帶其它相關基因進入單個病毒顆粒，經驗證其與spcas9可以達到相當的效率。2)在sacas9系統中，把其sgrna的第一個堿基替換成鳥嘌呤，使得sacas9酶的活性大大提高，從而提高了其在機體內的剪切效率。3)sacas9在靶向精確性上效率更高。

技術實現要素：

本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種用于特異性靶向人cxcr4基因的sgrna。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的用于特異性靶向人cxcr4基因的sgrna，其靶序列為seqidno:1～4所示序列中的任意一條序列。

所述sgrna的靶序列優(yōu)選為seqidno:3或seqidno:4所示的序列。

本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種crispr/sacas9特異性敲除人cxcr4基因的方法，該方法用于非診斷和治療目的，步驟包括：

1)在所述sgrna的靶序列的5’端加上用于形成粘性末端的序列，得到正向寡核苷酸；在所述sgrna的靶序列的互補鏈的兩端加上用于形成粘性末端的序列，得到反向寡核苷酸；合成所述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，變性、退火，形成帶有粘性末端的雙鏈sgrna寡聚核苷酸；

2)線性化腺相關病毒載體aav-crispr/sacas9，將所述雙鏈sgrna寡聚核苷酸連入線性化的aav-crispr/sacas9載體，轉化感受態(tài)細胞，篩選獲得陽性克隆，搖菌，抽提質粒；

3)將步驟2)提取的含有所述雙鏈sgrna寡聚核苷酸的aav-crispr/sacas9載體包裝成腺相關病毒；

4)用步驟3)包裝的腺相關病毒感染目的細胞，培養(yǎng)，收集被感染的目的細胞，進行酶切檢測和克隆測序，確定cxcr4基因的敲除效率，并獲得基因敲除的細胞。

本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供一種特異性敲除人cxcr4基因的crispr/sacas9系統，該系統包含有上述特異性靶向人cxcr4基因的sgrna。

本發(fā)明通過將特異性靶向人cxcr4基因的sgrna與aav-crispr/sacas9質粒連接成載體，包裝成aav感染細胞，實現了cxcr4基因的敲除，相比現有使用spcas9靶向cxcr4進行艾滋病治療的方法，本發(fā)明的方法不僅簡便、高效，而且特異性高。

附圖說明

圖1為px601質粒的結構示意圖。

圖2是t7e1酶切鑒定crispr/sacas9介導的人cxcr4基因特異性切割。

圖3是crispr/sacas9介導的基因位點特異性人cxcr4基因切割測序結果。其中，箭頭表示cas9切割位點，下劃線序列為pam序列，(-)表示敲除。

具體實施方式

為對本發(fā)明的技術內容、特點與功效有更具體的了解，現結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細的說明。

1.特異性靶向人cxcr4基因的sgrna的設計

以hiv-1的輔助受體蛋白即宿主蛋白cxcr4(ncbi基因號：nm_001008540.2)作為靶標，依據sacas9編輯規(guī)則(f.annranetal.2015)，在cxcr4基因上選擇符合5’-(20n)nngrrt-3’的序列。

sgrna在cxcr4基因上的靶向位點位于不同剪切形式的共有外顯子上的編碼區(qū)(靶向位點位于基因外顯子上的編碼區(qū)，更容易引起基因的移碼框突變，達到基因完全失活的目的)，避開cpg島的區(qū)域。

在ucsc數據庫中用blat，或ncbi數據庫中用blast，確定sgrna的靶序列是否唯一，以減少潛在的脫靶位點。

最后設計出4個靶向人cxcr4基因的sgrna，序列分別為：

gatgatttccaggaggatga(seqidno:1)

ggaaatcatcaagcaagggt(seqidno:2)

ggaatagtcagcaggagggc(seqidno:3)

gacaggatgacaataccagg(seqidno:4)

2.特異性靶向人cxcr4基因的sgrna的選擇

根據以下兩個原則：

1)靶向cxcr4基因的sgrna的靶序列在cxcr4基因上不能離atg起始子太近，以避免轉錄會合下游另一個atg開始，而出現一個被截短的基因形式，導致不能保證基因完全失活。

2)sgrna在cxcr4基因上的靶向位點位于整個基因的前中段部分。

從上述4個靶向人cxcr4基因的sgrna中挑選出2個sgrna(序列如seqidno:3～4所示)進行后續(xù)實驗。

3.特異性靶向人cxcr4基因的sgrna寡聚核苷酸的合成和構建

分別在上述挑選出的2個sgrna(序列如seqidno:3～4所示)的5’端加上caccg得到正向寡核苷酸(forwardoligo)。

分別在上述挑選出的2個sgrna(序列如seqidno:3～4所示)的互補鏈的5’端加上aaac，3’端加上c，得到反向寡核苷酸(reverseoligo)。

序列分別如下所示：

正向寡核苷酸：5’-caccgggaatagtcagcaggagggc-3’(seqidno:5)

反向寡核苷酸：5’-aaacgccctcctgctgactattccc-3’(seqidno:6)

正向寡核苷酸：5’-caccggacaggatgacaataccagg-3’(seqidno:7)

反向寡核苷酸：5’-aaaccctggtattgtcatcctgtcc-3’(seqidno:8)

分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，然后成對變性、退火，形成帶有bsai酶切位點、可以連入腺相關病毒載體aav-crispr/sacas9(px601，addgene公司)的粘性末端小片段(即雙鏈sgrna寡聚核苷酸)。

變性、退火體系為：100μm正向寡核苷酸2.5μl，100μm反向寡核苷酸2.5μl，2×neb緩沖液1μl，滅菌水4μl。

變性、退火的pcr程序為：95℃，5min；95～85℃，-2℃/s；85～25℃，-0.1℃/s；4℃保持。

4.利用crispr/sacas9特異性敲除人cxcr4基因

1)用bsai核酸內切酶切割aav-crispr/sacas9，使aav-crispr/sacas9質粒線性化(序列如seqidno:9所示)。

酶切體系為：400ng/μlpx6012μg，1μlcutsmart緩沖液，1μlbsai核酸內切酶(neb，r0535l)，補水至50μl。

酶切條件為：37℃孵育3～4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心，以防液滴蒸發(fā)至管蓋上。

酶切完成后，用axypreppcrcleanupkit(ap-pcr-250)純化試劑盒純化回收至20～40μl滅菌水中。

2)將上述變性、退火之后獲得的可以連入px601載體的雙鏈sgrna寡聚核苷酸與線性化的px601質粒相連，分別獲得px601-sghcxcr4#3質粒和px601-sghcxcr4#4質粒。

連接體系和條件為：50μm雙鏈sgrna寡聚核苷酸3μl，25ng/μl線性化的px601質粒1μl，t4連接緩沖液1μl，t4連接酶(neb，m0202s)0.5μl，滅菌水4.5μl。16℃孵育1小時。

3)將上述獲得的連接產物轉化dh5α感受態(tài)細胞(transgen，cd201)，并涂amp+平板(50μg/ml)，挑取克隆。用u6通用引物，經常規(guī)測序方法鑒定獲得陽性克隆。

u6通用引物為：ggactatcatatgcttaccg(seqidno:10)

4)37℃搖床搖菌過夜，培養(yǎng)陽性克隆，并用axyprepplasmidminiprepkit(ap-mn-p-250)試劑盒抽提質粒，獲得px601-sghcxcr4#3質粒(序列如seqidno:11所示)和px601-sghcxcr4#4質粒(序列如seqidno:12所示)。

5.包裝含有sgrna的腺相關病毒獲得cxcr4基因敲除細胞

按照aavhelper-freesystem(aglilenttechnologies,#240071)，將上述設計構建的含有識別人cxcr4基因的sgrna的aav-crispr/sacas9載體包裝成腺相關病毒。具體過程如下：

1)轉染前24小時鋪aav-293細胞(購自cctcc)于一個直徑10cm的細胞培養(yǎng)皿中；

2)待細胞密度細胞達到80～90％時，以標準的lipofectamine3000轉染，將上述質粒共轉染細胞，轉染后6～8小時換液。

轉染體系為：2xopti-mem500μl，1μg/μlpaav-rc質粒10μl(購于agilenttechnologies)，1μg/μlphelper質粒10μl(購于agilenttechnologies)，1μg/μlpx601-sghcxcr4#3或px601-sghcxcr4#4質粒10μl，lipidreagent(脂質體試劑)30μl。

在500μlopti-mem中加入三種不同量的質粒dna，同樣用500μlopti-mem稀釋lipidreagent，將稀釋后的dna按1:1的比例加入到轉染試劑中，混勻靜止放置20min后，加入到培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)7小時后換液。

3)轉染后72小時收集病毒(細胞上清和細胞裂解液)過濾，然后對病毒上清進行濃縮，在4℃，70000rpm，超速離心2小時，棄去上清后加入一定量的培養(yǎng)基重懸，分裝后-80℃保存。

4)病毒滴度檢測：將病毒上清以10倍梯度稀釋，利用病毒計數儀進行病毒滴度的初步測定。將病毒分別感染293t細胞，48小時之后藥物檢測陽性細胞比率，并以比率在0.1～10％之間的稀釋度進一步精確計算出病毒滴度。

6.利用crispr/sacas9重組腺相關病毒特異敲除人cxcr4基因

用上述包裝的腺相關病毒以moi為100(1ml病毒上清加到含4mldmem細胞中)感染hek-293t細胞，72小時后收集細胞，做t7e1酶切檢測和ta克隆測序，檢測cxcr4基因的敲除效率，以確認cxcr4基因已敲除。

t7e1酶切檢測方法如下：

1)將收集的細胞在裂解液(10μmtris-hcl，0.4mnacl，2μmedta，1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去離子水中。

2)以步驟1)提取的hek293t細胞基因組為模板，使用hcxcr4-test-f和hhcxcr4-test-r為引物進行pcr擴增，得到444bppcr產物，用axypreppcrcleanupkit試劑盒純化獲得pcr回收產物，取200ng統一稀釋到20μl，進行變性、退火，程序為：95℃，5min；95～85℃，-2℃/s；85～25℃，-0.1℃/s；4℃保持。

hcxcr4-test-f：acagtcaacctctacagcag(seqidno:13)

hhcxcr4-test-r：gaaggagtcgatgctgatcc(seqidno:14)

3)在20μl體系中加入t7e10.3μl，37℃酶切30分鐘，然后加入2μl10xloadingbuffer，用2.5％的瓊脂糖膠電泳檢測。

發(fā)生斷裂末端連接修復的基因組由于與原基因組不完全匹配，會被t7e1切割，在瓊脂糖膠電泳圖上顯示出較小的條帶，如圖2所示，加入針對人cxcr4的sgrna的樣品都出現了切割條帶，而且具有很高的效率。

ta克隆測序方法如下：

1)將t7e1酶切檢測步驟2)獲得的pcr回收產物用rtaq進行加a反應。

加a反應體系為：700～800ngpcr，回收產物，10x緩沖液(無mg²⁺)5μl，mg²⁺3μl，dntp4μl，0.5μlrtaq(takara，r001am)，補水至50μl。

加a反應條件為：37℃溫育30分鐘，取1μl產物與pmd19-tvector(takara，3271)連接并轉化dh5α感受態(tài)細胞(transgen，cd201)。

2)挑取單克隆，使用hcxcr4-test-f引物(seqidno:13)測序。

測序結果發(fā)現：靶基因cxcr4在編碼區(qū)缺失了2個堿基或8個堿基，形成移碼框突變，提前出現終止密碼子，基因敲除成功(如圖3所示)。

<110>上海捷易生物科技有限公司

<120>crispr/sacas9特異性敲除人cxcr4基因的方法

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