本發(fā)明涉及一種表達菜豆環(huán)氧化物水解酶的工程菌及應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

環(huán)氧化物水解酶(epoxidehydrolases,ehs)能水解動力學拆分和對映歸一性水解外消旋環(huán)氧化物生成具有光學活性的環(huán)氧化物或單一構型的鄰二醇，因其來源廣泛，全細胞即可催化且不需要金屬離子和輔酶的參與等優(yōu)點而受到廣泛關注。手性環(huán)氧化物和鄰二醇是合成手性化合物的重要中間體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能性材料的合成等方面有著重要的應用價值如對氯環(huán)氧苯乙烷((r)-pcso)和對氯苯基乙二醇((r)-pcped)是合成神經(jīng)保護劑依利羅地的重要中間體,依利羅作為一種谷氨酸拮抗劑對缺血性腦中風有很好的效果。

目前生產(chǎn)手性環(huán)氧化物和鄰二醇的方法主要有化學法、酶法和化學-酶法，但化學方法存在化學試劑昂貴，后處理復雜及對環(huán)境會造成危害等問題。ehs催化的外消旋環(huán)氧化物的動力學拆分和歸一性水解具有很明顯的優(yōu)勢：1、來源廣，廣泛存在于植物、動物和微生物中。2、不需要金屬離子和輔酶的參與。3、對不同底物表現(xiàn)出不同的立體選擇性。已有多種來源的編碼環(huán)氧化物水解酶的基因被克隆并實現(xiàn)了異源表達，其中對映選擇性高的環(huán)氧化物水解酶多被應用于外消旋環(huán)氧化物的動力學拆分，其理論產(chǎn)率僅為50％，對映和區(qū)域選擇性高且互補的雙酶或單酶催化的對映歸一性水解的理論產(chǎn)率可高達100％。單酶催化的對映歸一性水解是制備高產(chǎn)率手性鄰二醇的最理想途徑，但目前僅有少數(shù)的ehs對特定的某種或某類底物具備此特性。不同來源的ehs的活性及對不同環(huán)氧化物底物的對映選擇性有很大的差異，因此尋找更高活性，更好催化特性的新型ehs依然是目前研究發(fā)展的趨勢。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種環(huán)氧化物水解酶，如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有環(huán)氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發(fā)明的第二個目的是提供編碼所述環(huán)氧化物水解酶的基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種基因工程菌，所述基因工程菌以大腸桿菌為宿主，表達seqidno.1所示基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌以pet-28a(+)為載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌按如下步驟構建：(1)將seqidno.1所示基因片段與pucm-t連接，構建重組質粒pucm-t-pveh3；(2)將pucm-t-pveh3與pet-28a(+)質粒用ndei和noti進行雙酶切，在t4dna連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pet-28a(+)-pveh3；(3)將pet-28a(+)-pveh3轉化入宿主中。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種制備環(huán)氧化物水解酶的方法，是將所述基因工程菌接種至含100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，按2～5％的接種量接種至lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃、轉速220rpm，時間為2～2.5h,od600為0.6～0.8，加iptg至終濃度為0.05～0.1mm進行誘導，16～35℃條件下誘導表達8～10h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將誘導后的菌體離心，收集菌體，用100mm磷酸鹽緩沖液進行懸浮，制備成100～200mg/ml的菌懸液。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種制備(r)-pcped的方法，是將所述環(huán)氧化物水解酶以25～40u/mmol底物的添加量加入至外消旋pcso中，于18～22℃反應1～10h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是以酶液、酶粉或基因工程菌細胞的形式進行反應。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是以所述的基因工程菌為催化劑，每950μl的菌懸液中加入50μl終濃度10mmol/l的外消旋pcso，在20℃反應；所述菌懸液的濃度為200mg/ml。

本發(fā)明還提供所述環(huán)氧化物水解酶在食品、醫(yī)藥、化工領域的應用。

有益效果：本發(fā)明的環(huán)氧化物水解酶能夠催化外消旋對氯環(huán)氧苯乙烷(rac-pcso)生成(r)-對氯苯基乙二醇(pcped)，在轉化率達99.7％時產(chǎn)物對映體過剩值為85.1％eep。與其它植物來源的環(huán)氧化物水解酶相比提高了10倍。

附圖說明

圖1為環(huán)氧化物水解酶催化(r,s)-pcso反應進程曲線。

圖2為不同ph下環(huán)氧化物水解酶的活性。

圖3為重組環(huán)氧化物水解酶對外消旋pcso的水解反應進程。

具體實施方式

(r,s)-pcso由本實驗室合成；(r)-pcped和(s)-pcped購自上海tci公司；流動相均購自美國tedia天地試劑公司，手性液相色譜柱as-h(4.6×250mm,5μm)購自大賽璐藥物手性技術(上海)有限公司。

環(huán)氧化物水解酶的測定及酶活性單位定義：500μl的反應體系中，450μl100mg/ml的菌懸液與25μl的底物(r,s)-pcso反應，精確反應20min后取樣60μl于1ml乙酸乙酯中萃取，干燥過膜后通過高效液相色譜儀檢測。本測定條件下，以每分鐘水解1μmolrac-pcso所需的酶量定義為1個環(huán)氧化物水解酶的活性單位(u)。

底物、產(chǎn)物測定方法：采用高效液相色譜儀、chiralcelas-h和紫外檢測器分析，流動相為正己烷/異丙醇(80:20,v/v)，流速為0.8ml/min，檢測波長為220nm，柱溫為30℃，(r)-pcso、(s)-pcso、(r)-pcped和(s)-pcped的出峰時間分別為6.240、6.967、7.909和8.923min。

底物ees＝[(ra-sa)/(ra+sa)]×100％；產(chǎn)物eep＝[(rb-sb)/(rb+sb)]×100％；e＝ln[(1-c)×(1-ees)]/ln[(1-c)×(1+ees)]。其中ra和sa分別表示(r)-pcso和(s)-pcso濃度，rb和sb分別表示(r)-pcped和(s)-pcped濃度。c表示底物轉化率。

實施例1菜豆環(huán)氧化物水解酶基因的獲得及表達質粒的構建

根據(jù)ncbi所公布cdna序列設計特異性引物，pveh2-f:catatgatggagggaatacacagcacaaag，含ndei酶切位點，pveh2-r：ctagagtcaaaacttgttgataaaatcataaaatgt，含noti酶切位點。提取菜豆胚芽總rna。以菜豆總rna為模板，oligodt-adaptor為引物，逆轉錄合成cdna第一鏈；以該鏈為模板、pveh2-f和m13primerm4為引物，進行第一輪pcr：94℃變性2min，30個循環(huán)(94℃30s、50℃30s和72℃70s)；再以第一輪pcr產(chǎn)物為模板、pveh3-f和pveh3-r為引物，進行第二輪pcr：94℃變性2min，30個循環(huán)(94℃30s、52℃30s和72℃70s)，72℃延長10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析、割膠回收目的基因，與pucm-t連接，轉化e.colijm109，經(jīng)藍白斑篩選、sacⅰ酶切鑒定和dna測序。將測序正確的重組質粒命名為pucm-t-pveh3。將測序正確的pucm-t-pveh3與pet-28a(+)質粒均用ndei和noti進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在t4dna連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pet-28a(+)-pveh3，并對重組質粒進行序列測定；將pet-28a(+)-pveh3轉化入e.colibl21(de3)中。

實施例2重組菌的誘導表達

將e.colibl21-pveh3單菌落接種于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃、220r/min培養(yǎng)過夜；取2ml培養(yǎng)液轉接于100ml相同的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600為0.6～0.8時，添加iptg(終濃度0.05mmol/l)，25℃誘導8h。收集菌體，按每g濕菌體用5ml磷酸鉀緩沖液(k2hpo4-kh2po4,100mmol/l,ph7.0)懸浮得到菌濃為200mg/ml的菌懸液。

實施例3重組菌的誘導表達溫度優(yōu)化

按實施例2的方法，區(qū)別在于，調(diào)整誘導溫度為16～35℃。如圖1所示，當溫度從16℃升高到22℃時，相對酶活性也隨之增加。當溫度繼續(xù)增加時，相對酶活性開始降低，當溫度為35℃時，相對酶活性僅為22℃時的60％。說明最適誘導溫度為22℃。

實施例4磷酸鹽ph的優(yōu)化

按實施例2的方法，區(qū)別在于，調(diào)整磷酸鉀緩沖液的ph為3.0～10.0。如圖2所示，當ph從3.0提高到7.0時，相對酶活也隨之提高。但是當ph從7.0提高到10.0時，隨著ph的升高相對酶活迅速下降，ph為10.0時的相對酶活僅為ph為7.0時的10％。

實施例5pveh3催化外消旋pcso的對映歸一性水解

在1.5mlep管中加入950μl菌懸液，其酶活力為1.72u/g濕菌體，25℃保溫5min，再加入50μlpcso(終濃度10mmol/l)進行反應(實際反應量為32.6u/mmol底物)。定時取樣50μl至1ml乙酸乙酯中萃取，上層有機相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后過0.22μm有機濾膜，采用高效液相色譜儀waterse2695(美國waters公司)對樣品進行手性分析。底物和產(chǎn)物均通過hplc進行檢測。以e.coli/pet-28a菌懸液為對照，進行上述相同的反應和分析。結果如圖3所示，在反應進行至3h時，(s)-pcso轉化了98％，(r)-pcso轉化了47％，說明pveh3優(yōu)先催化(s)-pcso水解。當反應時間為7h時，轉化率為99.3％，當反應時間為8h時，轉化率為99.6％，即底物幾乎完全轉化為產(chǎn)物，產(chǎn)物的對映體過量值為85.1％。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的保護范圍。

sequencelisting

<110>江南大學

<120>一種表達菜豆環(huán)氧化物水解酶的工程菌及應用

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cgccaccagattctggctctcagttcccgaggatatcgcgctgttgcaccagatctacgt180

ggctacggtgacacagaggcaccagcttcaatgagcagctacagctgctttgacatagtg240

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