本發(fā)明屬于高分子材料領(lǐng)域，涉及一種可大幅提高包涵體蛋白復(fù)性效率的高分子復(fù)合膠束及其復(fù)性工藝。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)和多肽藥物是生物制藥行業(yè)的支柱，目前，市場(chǎng)上超過(guò)200個(gè)蛋白質(zhì)藥物正在進(jìn)行臨床前和臨床試驗(yàn)。此類蛋白質(zhì)藥物主要以大腸桿菌為宿主菌以“重組蛋白”的形式進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。但是在大腸桿菌中表達(dá)的目的蛋白常常以包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無(wú)活性的不溶性聚集物，如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行高效率的復(fù)性以獲得活性產(chǎn)品是生物工程產(chǎn)業(yè)化經(jīng)常面臨的一個(gè)難題。

目前，包涵體蛋白體外復(fù)性的方法主要有透析和稀釋復(fù)性法、折疊促進(jìn)劑協(xié)助復(fù)性法、天然分子伴侶介導(dǎo)的復(fù)性法以及層析折疊復(fù)性法等。這些方法往往操作復(fù)雜、成本高昂、復(fù)性效率低下，并且方法的選擇往往局限于蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，適用范圍很窄，因此發(fā)展一種適用范圍廣并且可以促使包涵體蛋白高效率復(fù)性的新技術(shù)是很有價(jià)值的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種經(jīng)濟(jì)且適用范圍廣的可大幅提高包涵體蛋白復(fù)性效率的高分子復(fù)合膠束，同時(shí)提供了該高分子復(fù)合膠束高效率復(fù)性包涵體蛋白的復(fù)性工藝。該復(fù)合膠束可提高包涵體蛋白的復(fù)性效率，并且針對(duì)不同特性的包涵體蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)高分子復(fù)合膠束的組成，均能達(dá)到較高效率的復(fù)性效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種可大幅提高包涵體蛋白復(fù)性效率的高分子復(fù)合膠束，由粒徑為30-500nm且均勻分布的顆粒構(gòu)成，所述復(fù)合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物組成，兩種雙親性嵌段共聚物中包括一種親水端具有環(huán)境響應(yīng)性的雙親性嵌段共聚物和一種為親水端不帶環(huán)境響應(yīng)性的雙親性嵌段共聚物，該復(fù)合膠束在一定條件下為核-殼結(jié)構(gòu)，核層和殼層分別由兩種雙親性嵌段共聚物的疏水端和親水端混合組成。

所述兩種雙親性嵌段共聚物的疏水端為5-20kda(千道爾頓)，且兩種疏水端的分子量相差不超過(guò)10kda。

所述親水端具有環(huán)境響應(yīng)性的雙親性嵌段共聚物，其親水環(huán)境響應(yīng)性鏈段為具有溫度響應(yīng)性的聚n-異丙基丙烯酰胺(poly(n-isopropylacrylamide),pnipam)、聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(poly(2-(2-methoxyethoxy)ethylmethacrylate),pmeo2ma)，或者具有ph響應(yīng)性的聚β氨酯(poly(β-aminoester),pae)，或者具有溫度和ph雙重響應(yīng)性的聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯(poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate),pdmaema)、聚n-2-乙氨基乙基丙烯酰胺(poly(n-[2-(diethylamino)ethyl]acrylamide),pdeaeam)；其疏水鏈段為聚已內(nèi)酯(poly(ε-caprolactone),pcl)、聚乳酸(polylactide,pla)或者聚苯乙烯(polystyrene,ps)。

針對(duì)帶正電荷的包涵體蛋白(等電點(diǎn)pi>7.0)的復(fù)性，所述親水端具有環(huán)境響應(yīng)性的雙親性嵌段共聚物，其親水環(huán)境響應(yīng)性鏈段混聚了疏水類單體：包括但不限于n-叔丁基丙烯酰胺(n-tert-butylacrylamide)、n-苯基丙烯酰胺(n-phenylacrylamide)；和帶正電荷類的單體：包括但不限于帶氨基類(-nh2)單體、帶叔胺類單體(-nr1r2，r1、r2可相同也可不同)、帶季銨鹽類單體(-n⁺r1r2r3)、帶胍基類單體、帶咪唑基類單體。針對(duì)帶負(fù)電荷的包涵體蛋白(等電點(diǎn)pi<7.0)的復(fù)性，所述親水端具有環(huán)境響應(yīng)性的雙親性嵌段共聚物，其親水環(huán)境響應(yīng)性鏈段混聚了疏水性單體：包括但不限于n-叔丁基丙烯酰胺(n-tert-butylacrylamide)、n-苯基丙烯酰胺(n-phenylacrylamide)；和帶負(fù)電荷的單體：包括但不限于帶羧基(-cooh)類單體、帶磷酸基團(tuán)類單體、帶磺酸基類單體。

所述親水端不具有環(huán)境響應(yīng)性的雙親性嵌段共聚物，其親水鏈段為聚乙二醇(poly(ethyleneglycol),peg)、聚2一甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(poly(2-methacryloyl-oxyethylphosphorylcholine),pmpc)，其疏水鏈段為聚已內(nèi)酯(poly(ε-caprolactone),pcl)、聚乳酸(polylactide,pla)或者聚苯乙烯(polystyrene,ps)。

一種可大幅提高包涵體蛋白復(fù)性效率的高分子復(fù)合膠束，用于促使包涵體蛋白的復(fù)性，其單次復(fù)性工藝包括如下步驟：

1)將包涵體蛋白溶解到到變性緩沖溶液中制得變性蛋白溶液，所述變性緩沖液含有6m鹽酸胍、edta和dtt。

2)制備含有高分子復(fù)合膠束的復(fù)性緩沖溶液，針對(duì)帶正電荷的包涵體蛋白，所用高分子復(fù)合膠束，其親水環(huán)境響應(yīng)性鏈段混聚了疏水類單體和帶正電荷類單體；針對(duì)帶負(fù)電荷的包涵體蛋白，所用高分子復(fù)合膠束，其親水環(huán)境響應(yīng)性鏈段混聚了疏水類單體和帶負(fù)電荷類單體。

3)將制備的含有高分子復(fù)合膠束的復(fù)性緩沖溶液于一定條件下穩(wěn)定一定時(shí)間以獲得呈核-殼-冠結(jié)構(gòu)的高分子復(fù)合膠束，然后將上述溶液與變性的蛋白溶液混合均勻，于適當(dāng)條件下進(jìn)行復(fù)性實(shí)驗(yàn)。

4)室溫下隨時(shí)間監(jiān)測(cè)酶的活性。

一種可大幅提高包涵體蛋白復(fù)性效率的高分子復(fù)合膠束，用于促使包涵體蛋白的復(fù)性，其連續(xù)復(fù)性工藝包括如下步驟：

1)將包涵體蛋白溶解到到變性緩沖溶液中制得變性蛋白溶液，所述變性緩沖液含有6m鹽酸胍、edta和dtt。

2)制備含有高分子復(fù)合膠束的復(fù)性緩沖溶液，針對(duì)帶正電荷的包涵體蛋白，所用高分子復(fù)合膠束，其親水環(huán)境響應(yīng)性鏈段混聚了疏水類單體和帶正電荷類單體；針對(duì)帶負(fù)電荷的包涵體蛋白，所用高分子復(fù)合膠束，其親水環(huán)境響應(yīng)性鏈段混聚了疏水類單體和帶負(fù)電荷類單體。

3)將制備的含有高分子復(fù)合膠束的復(fù)性緩沖溶液于于一定條件下穩(wěn)定一定時(shí)間以獲得呈核-殼-冠結(jié)構(gòu)的高分子復(fù)合膠束，然后將一定量的變性蛋白質(zhì)以2-10μl/s的流速分批稀釋到復(fù)性緩沖液中，并將分批復(fù)性完畢的活性蛋白分離出來(lái)。

4)室溫下監(jiān)測(cè)酶的活性。

該高分子復(fù)合膠束促使包涵體蛋白高效率復(fù)性的原理：

在生物體內(nèi)，新生多肽鏈的從頭折疊到具有活性的狀態(tài)需要一系列的分子伴侶發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)缺少分子伴侶輔助時(shí)，新生肽鏈中的疏水氨基酸殘基之間容易相互聚集，從而形成沒(méi)有活性的不溶的包涵體。本發(fā)明開發(fā)出一種新的帶電荷的具有核-殼-冠結(jié)構(gòu)的復(fù)合膠束，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境刺激下，處于殼層的環(huán)境響應(yīng)性親水部分發(fā)生相分離，疏水塌縮形成新的殼層，而不帶環(huán)境響應(yīng)性的親水部分則作為冠層，阻止了復(fù)合膠束之間的聚集，使這種帶有疏水表面的核-殼-冠納米結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定存在，從結(jié)構(gòu)和功能上精確模擬天然分子伴侶，從而可以促使包涵體蛋白高效率復(fù)性。以帶正電的包涵體蛋白為例，使用變性劑和還原劑使包涵體蛋白完全變性以模擬新生肽鏈。沒(méi)有復(fù)合膠束存在時(shí)，當(dāng)把變性的包涵體蛋白快速稀釋到復(fù)性緩沖液中時(shí)，多肽鏈之間由于疏水相互作用快速聚集，形成無(wú)活性的聚集體，自發(fā)復(fù)性效率非常低(圖1，過(guò)程i)。當(dāng)把變性的包涵體蛋白快速稀釋到含有帶正電荷的高分子復(fù)合膠束復(fù)性緩沖液中時(shí)，在疏水作用力的推動(dòng)下，多肽鏈快速吸附到復(fù)合膠束表面的疏水受限空腔中，從而阻止了多肽鏈之間的聚集；同時(shí)，在同種電荷相斥作用下，多肽鏈中的正電片斷可以從復(fù)合膠束的疏水受限空腔表面解離，從而逐漸帶動(dòng)多肽鏈的整體正確折疊，最終折疊成活性狀態(tài)(圖1，過(guò)程ii)。當(dāng)把變性的包涵體蛋白快速稀釋到含有帶負(fù)電荷的高分子復(fù)合膠束復(fù)性緩沖液中時(shí)，雖然復(fù)合膠束抑制的多肽鏈之間的聚集，但是由于異性電荷相吸作用，多肽鏈緊密的吸附在復(fù)合膠束的疏水受限空腔表面，從而抑制了多肽鏈自發(fā)調(diào)節(jié)復(fù)性(圖1，過(guò)程iii)。但是，當(dāng)?shù)孜餅閹ж?fù)電的包涵體蛋白時(shí)，帶負(fù)電荷的高分子復(fù)合膠束能夠很好的發(fā)揮促使其復(fù)性作用(原理同圖1，過(guò)程ii)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

由兩種雙親性嵌段共聚物形成的核-殼-冠結(jié)構(gòu)的復(fù)合膠束，能夠在水體系中穩(wěn)定存在，同時(shí)表面具有疏水性質(zhì)和電荷性質(zhì)可調(diào)節(jié)的受限空腔；針對(duì)不同特性的包涵體蛋白，通過(guò)加入相應(yīng)的復(fù)合膠束，可以顯著提高包涵體蛋白的復(fù)性效率；當(dāng)變性蛋白復(fù)性完成時(shí)，可以自發(fā)的從膠束表面的受限空腔內(nèi)解離，從而其能夠連續(xù)多次的發(fā)揮作用；其制備方法及復(fù)性工藝簡(jiǎn)單、易于操作，適用底物蛋白范圍廣，復(fù)性設(shè)備成本低，效率高，易于推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為復(fù)合膠束促使包涵體蛋白復(fù)性作用機(jī)制原理圖。

圖2為peg/p(ni-co-ntb-co-gua)復(fù)合膠束輔助變性溶菌酶復(fù)性動(dòng)力學(xué)圖。

圖3為peg/p(ni-co-ntb-co-aac)復(fù)合膠束輔助變性碳酸酐酶復(fù)性動(dòng)力學(xué)圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)非限定性實(shí)例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1：peg/p(ni-co-ntb-co-gua)復(fù)合膠束輔助變性溶菌酶復(fù)性

采用raft和rop的方法合成了嵌段共聚物pcl82-b-peg114和pcl78-b-p(ni60-co-ntb18-co-gua9)，室溫下將兩種嵌段共聚物超聲溶解在超干四氫呋喃中，過(guò)夜，共聚物溶液濃度均為5mg/ml，按照pcl-b-peg溶液和pcl-b-p(ni-co-ntb-co-gua)溶液體積比1:6均勻混合兩種共聚物溶液，充分混勻后將上述混合溶液快速加入到適量冰水中，冰浴狀態(tài)下超聲10min后將上述混合溶液用冰水進(jìn)行透析以除去四氫呋喃，透析完畢后，加水定容，最后制得嵌段共聚物的濃度為0.5mg/ml的peg/p(ni-co-ntb-co-gua)高分子復(fù)合膠束溶液。

將溶菌酶加入到變性緩沖溶液中制得變性溶菌酶溶液，具體為稱取5mg溶菌酶、0.5732g鹽酸胍、5μl1mdtt、40μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液，然后用滅菌超純水定容至1ml，37℃變性12h備用。

制備含有高分子復(fù)合膠束的復(fù)性緩沖溶液。具體為取1850μlpeg/p(ni-co-ntb-co-gua)復(fù)合膠束、80μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液、10μl1medta、20μl150mmgsh、20μl50mmgssh，將上述溶液混合均勻后40℃下溫浴20min，然后取20μl上述已變性的溶菌酶溶液快速稀釋到上述復(fù)性緩沖溶液中，于40℃下進(jìn)行復(fù)性實(shí)驗(yàn)。室溫下隨時(shí)間監(jiān)測(cè)酶的活性。對(duì)照組將peg/p(ni-co-ntb-co-gua)復(fù)合膠束替換成滅菌超純水，其余步驟一樣。

溶菌酶的活性測(cè)試以容壁微球菌為底物，稱取3mg容壁微球菌，用10ml66mmph＝6.5的磷酸緩沖溶液溶解，向500μl容壁微球菌溶液中加入50μl復(fù)性溶液，快速混合，室溫檢測(cè)反應(yīng)液在450nm處的吸光值變化，1min內(nèi)的吸光值下降速率(扣除空白實(shí)驗(yàn)中底物水解速率后)，與酶活性成正比，求出變化斜率，與100％酶活性相比得到相對(duì)酶活性。

測(cè)試結(jié)果如圖2所示，測(cè)試結(jié)果表明：peg/p(ni-co-ntb-co-gua)復(fù)合膠束能夠顯著提高溶菌酶的復(fù)性產(chǎn)率，復(fù)性完成時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的復(fù)性產(chǎn)率高達(dá)97％，而對(duì)照組僅僅為34％。結(jié)果表明，帶正電荷的peg/p(ni-co-ntb-co-gua)復(fù)合膠束能夠高效率的促使帶正電荷的包涵體蛋白復(fù)性。

實(shí)施例2：peg/p(ni-co-ntb-co-aac)復(fù)合膠束輔助變性碳酸酐酶復(fù)性

采用raft和rop的方法合成了嵌段共聚物pcl82-b-peg114和pcl78-b-p(ni54-co-ntb16-co-aac8)，室溫下將兩種嵌段共聚物超聲溶解在超干四氫呋喃中，過(guò)夜，共聚物溶液濃度均為5mg/ml，按照pcl-b-peg溶液和pcl-b-p(ni-co-ntb-co-aac)溶液體積比1:6均勻混合兩種共聚物溶液，充分混勻后將上述混合溶液快速加入到適量冰水中，冰浴狀態(tài)下超聲10min后將上述混合溶液用冰水進(jìn)行透析以除去四氫呋喃，透析完畢后，加水定容，最后制得嵌段共聚物的濃度為0.5mg/ml的peg/p(ni-co-ntb-co-aac)高分子復(fù)合膠束溶液。

將碳酸酐酶加入到變性緩沖溶液中制得變性溶菌酶溶液，具體為稱取5mg碳酸酐酶、0.5732g鹽酸胍、40μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液，然后用滅菌超純水定容至1ml，37℃變性12h備用。

制備含有高分子復(fù)合膠束的復(fù)性緩沖溶液。具體為取4750μlpeg/p(ni-co-ntb-co-aac)復(fù)合膠束、200μl0.5mph＝7.5tris-cl溶液，將上述溶液混合均勻后40℃下溫浴20min，然后取50μl上述已變性的溶菌酶溶液快速稀釋到上述復(fù)性緩沖溶液中，于40℃下進(jìn)行復(fù)性實(shí)驗(yàn)。室溫下隨時(shí)間監(jiān)測(cè)酶的活性。對(duì)照組將peg/p(ni-co-ntb-co-aac)復(fù)合膠束替換成滅菌超純水，其余步驟一樣。

碳酸酐酶的活性測(cè)試以4-硝基苯基乙酸酯(pnpa)為底物為底物，稱取0.0725gpnpa，用5ml重蒸處理過(guò)的乙腈溶液溶解，取20μlpnpa溶液，加入600μl復(fù)性溶液，快速混合，室溫檢測(cè)反應(yīng)液在400nm處的吸光值變化，1min內(nèi)的吸光值升高速率(扣除空白實(shí)驗(yàn)中底物水解速率后)，與酶活性成正比，求出變化斜率，與100％酶活性相比得到相對(duì)酶活性。

測(cè)試結(jié)果如圖3所示，測(cè)試結(jié)果表明：peg/p(ni-co-ntb-co-aac)復(fù)合膠束能夠明顯提高碳酸酐酶的復(fù)性產(chǎn)率，復(fù)性完成時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的復(fù)性產(chǎn)率達(dá)58％，而對(duì)照組僅僅為30％。結(jié)果表明，帶負(fù)電荷的peg/p(ni-co-ntb-co-aac)復(fù)合膠束能夠高效率的促使帶負(fù)電荷的包涵體蛋白復(fù)性。