本發(fā)明涉及一種多重基因檢測(cè)產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測(cè)體系，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

感染性腹瀉是由多種病原體引起的腸道傳染病，是全世界范圍內(nèi)最高發(fā)的消化系統(tǒng)感染性疾病之一。全球每年患腹瀉病達(dá)20億人次左右，我國(guó)每年發(fā)病約8億人次。感染性腹瀉已經(jīng)成為僅次于呼吸道感染、影響人類(lèi)健康的第二大感染性疾病。

病原學(xué)診斷對(duì)感染性腹瀉的防治具有重要意義?！妒澜缥改c病學(xué)組織全球指南—成人和兒童急性腹瀉：全球觀(guān)點(diǎn)(2012)》和《中國(guó)成人急性感染性腹瀉診療專(zhuān)家共識(shí)(2013)》明確指出：“感染性腹瀉的診斷包括臨床診斷和病原學(xué)診斷，后者不僅為合理治療提供依據(jù)，同時(shí)為流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防和控制腹瀉病的傳播和流行提供重要線(xiàn)索”。目前，由于引起腹瀉的病原體種類(lèi)繁多，高達(dá)數(shù)十種，而常規(guī)的檢測(cè)方法局限性大，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的病原學(xué)診斷，導(dǎo)致臨床治療盲目、耐藥菌產(chǎn)生，使得感染性腹瀉未能得到最及時(shí)和有效地控制。

但是,感染性腹瀉病原體的常規(guī)檢測(cè)方法、檢測(cè)流程、臨床治療方案都具有局限性。

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)腹瀉相關(guān)病原體的常規(guī)方法包括：①細(xì)菌培養(yǎng)法：通過(guò)分離、培養(yǎng)和鑒定腸道致病菌，結(jié)合血清學(xué)分型方法，確定腸道致病菌種屬和血清型。該方法特異性強(qiáng)，可以直接為臨床提供明確的病原學(xué)診斷和體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果。但是引起感染性腹瀉的病原體種類(lèi)繁多，不同種屬的腸道致病菌的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件各不相同，該方法無(wú)法同時(shí)采用所有的腸道致病菌都適合的分離培養(yǎng)方法(比如培養(yǎng)基的類(lèi)型和培養(yǎng)環(huán)境)，造成了病原菌陽(yáng)性檢出率低，假陰性率高，導(dǎo)致臨床漏診和誤診率高。同時(shí)該方法耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。②免疫學(xué)方法：通過(guò)直接檢測(cè)糞便中病原體的特異性抗原或者血液中的特異性抗體進(jìn)行病原學(xué)診斷。該方法耗時(shí)短，但敏感性和特異性低，尤其是血液中特異性抗體的產(chǎn)生有一個(gè)窗口期(從感染到產(chǎn)生可以檢測(cè)到的抗體成分)，導(dǎo)致該方法假陰性率高。同時(shí)該方法也無(wú)法同時(shí)檢測(cè)和鑒別數(shù)十種感染性腹瀉相關(guān)的抗原或抗體。③特異性核苷酸檢測(cè)法：通過(guò)特異性檢測(cè)感染性腹瀉相關(guān)病原體的基因片段進(jìn)行診斷。其優(yōu)點(diǎn)是特異性和敏感性高，但缺點(diǎn)是無(wú)法同時(shí)檢測(cè)和鑒定感染性腹瀉相關(guān)的多種病原體，而且成本高。

感染性腹瀉病原體常規(guī)檢測(cè)流程和步驟為：①首先采集腹瀉患者糞便樣本進(jìn)行腸道致病菌的培養(yǎng)——直接接種ss平板，分離培養(yǎng)沙門(mén)菌/志賀菌；同時(shí)接種堿性蛋白胨水增菌后轉(zhuǎn)種tcbs平板，分離培養(yǎng)弧菌。②常規(guī)培養(yǎng)陽(yáng)性者，進(jìn)行生化鑒定、血清學(xué)鑒定和體外藥敏試驗(yàn)。常規(guī)培養(yǎng)陰性者，如果臨床癥狀符合腸道細(xì)菌感染癥狀，需再次采集糞便樣本進(jìn)行致病性大腸埃希菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌或艱難梭菌的分離培養(yǎng)——分別接種麥康凱平板、空腸彎曲菌平板和ccfa平板，陽(yáng)性者進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定、血清學(xué)鑒定和體外藥敏試驗(yàn)。③以上細(xì)菌培養(yǎng)陰性或者其它實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)符合病毒性腹瀉的患者，需要進(jìn)行腸道病毒的免疫學(xué)或特異性核酸檢測(cè)。臨床上感染性腹瀉病原體的檢測(cè)流程步驟多、費(fèi)用高、時(shí)間長(zhǎng)。全面檢測(cè)費(fèi)用至少需要1000元，耗時(shí)可長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)。

不同的病原體引起的感染性腹瀉的治療和隔離的方法各不相同。

《國(guó)家衛(wèi)計(jì)委2015年抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》明確指出：“抗菌藥物的應(yīng)用必須根據(jù)患者的癥狀、體征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，明確診斷后可應(yīng)用”。但是，目前的常規(guī)檢測(cè)方法存在檢出率低、耗時(shí)長(zhǎng)、尤其無(wú)法同時(shí)對(duì)多種病原體進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定等缺點(diǎn)，無(wú)法為臨床提供及時(shí)、全面和準(zhǔn)確的病原體診斷依據(jù)，導(dǎo)致臨床普遍采用廣譜性抗菌藥物進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療，造成療效低下、不能及時(shí)控制腹瀉、耐藥菌株高發(fā)和消化菌群紊亂等問(wèn)題。

綜上所述，目前腹瀉病原體檢測(cè)和診斷方法不能滿(mǎn)足臨床需求，迫切需要開(kāi)發(fā)新技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以快速、全面、準(zhǔn)確、低成本的腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系及其試劑盒，以及采用該檢測(cè)體系在制備診斷產(chǎn)品方面的應(yīng)用。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是：一種腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系，包括分別針對(duì)空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、人星狀病毒、諾如病毒ii、人腸道腺病毒、輪狀病毒a、輪狀病毒b和輪狀病毒c進(jìn)行檢測(cè)的正反向pcr擴(kuò)增引物。

針對(duì)空腸彎曲菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，針對(duì)空腸彎曲菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

針對(duì)志賀菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示，針對(duì)志賀菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.4所示；

針對(duì)艱難梭菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.5所示，針對(duì)艱難梭菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.6所示；

針對(duì)腸炎沙門(mén)菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.7所示，針對(duì)腸炎沙門(mén)菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.8所示；

針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.10所示；

針對(duì)腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.11所示，針對(duì)腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.12所示；

針對(duì)腸出血性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，針對(duì)腸出血性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.14所示；

針對(duì)腸致病性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.15所示，針對(duì)腸致病性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.16所示；

針對(duì)腸黏附性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.17所示，針對(duì)腸黏附性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.18所示；

針對(duì)腸侵襲性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.19所示，針對(duì)腸侵襲性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.20所示；

針對(duì)弧菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.21所示，對(duì)應(yīng)弧菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.22所示；

針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.23所示，對(duì)應(yīng)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌反向引物的核苷酸序列如seqidno.24所示；

針對(duì)大腸埃希菌o157的正向引物的核苷酸序列如seqidno.25所示，對(duì)應(yīng)人大腸埃希菌o157的反向引物的核苷酸序列如seqidno.26所示；

針對(duì)人星狀病毒的正向引物的核苷酸序列如seqidno.27所示，對(duì)應(yīng)人星狀病毒的反向引物的核苷酸序列如seqidno.28所示；

針對(duì)諾如病毒ii的正向引物的核苷酸序列如seqidno.29所示，針對(duì)諾如病毒ii的反向引物的核苷酸序列如seqidno.30所示；

針對(duì)人腸道腺病毒的正向引物的核苷酸序列如seqidno.31所示，以及針對(duì)人腸道腺病毒的反向引物的核苷酸序列如seqidno.32所示；

針對(duì)輪狀病毒a的正向引物的核苷酸序列如seqidno.33所示，以及針對(duì)輪狀病毒a的反向引物的核苷酸序列如seqidno.34所示；

針對(duì)輪狀病毒b的正向引物的核苷酸序列如seqidno.35所示，以及針對(duì)輪狀病毒b的反向引物的核苷酸序列如seqidno.36所示；

針對(duì)輪狀病毒c的正向引物的核苷酸序列如seqidno.37所示，以及針對(duì)輪狀病毒c的反向引物的核苷酸序列如seqidno.38所示。

上述腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系還包括針對(duì)人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參、系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參進(jìn)行檢測(cè)的正反向pcr擴(kuò)增引物；

所述人rna內(nèi)參是b2m，人dna內(nèi)參是rnasep，系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參是含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒；

針對(duì)人rna內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列如seqidno.39所示，以及針對(duì)人rna內(nèi)參的反向引物的核苷酸序列如seqidno.40所示；

針對(duì)人dna內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列如seqidno.41所示，以及針對(duì)人dna內(nèi)參的反向引物的核苷酸序列如seqidno.42所示；

針對(duì)系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列如seqidno.43所示，以及針對(duì)系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的反向引物的核苷酸序列如seqidno.44所示。

上述針對(duì)空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、弧菌、輪狀病毒b的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為200nm；所述針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、諾如病毒ii、輪狀病毒c的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為100nm，所述針對(duì)大腸埃希菌o157的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為350nm，所述針對(duì)人星狀病毒的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為300nm，所述針對(duì)人腸道腺病毒的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為450nm，所述針對(duì)輪狀病毒a的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為400nm；

所述針對(duì)空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、人腸道腺病毒、輪狀病毒b、輪狀病毒c的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為100nm，所述針對(duì)腸侵襲型大腸埃希菌的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為200nm，所述針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為300nm，所述針對(duì)人星狀病毒、諾如病毒ii的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為400nm，所述針對(duì)輪狀病毒a的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為450nm；

針對(duì)人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參、和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的正反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為1μm。

上述腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系還包括pcr緩沖液,mgcl2溶液,dntps,以及熱啟動(dòng)dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。

上述熒光標(biāo)記為cy5或cy3或fam。

上述腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系還包括陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照物；所述陽(yáng)性對(duì)照物是包括所有目的基因靶點(diǎn)的質(zhì)?；旌衔?；所述陰性對(duì)照液是無(wú)核酸酶超純水。

反應(yīng)時(shí)體系中的組分用量為5×的pcr緩沖液2體積，10μm的dntps共0.35體積，25mmol/l的mgcl2溶液0.25體積，引物混合物1體積，5u/μl的熱啟動(dòng)dna聚合酶和5u/μl的逆轉(zhuǎn)錄酶混合液0.4體積，1u/μ

l的udg酶0.1體積dna模板2.5體積，純水2.5體積；所述基因模板的使用量為5～50ng/體系。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的另一種技術(shù)方案是：一種采用上述的檢測(cè)體系的腹瀉病原體多重基因檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的又一種技術(shù)方案是：一種采用上述的檢測(cè)體系制備腹瀉病原體的檢測(cè)和診斷產(chǎn)品的應(yīng)用。本發(fā)明具有積極的效果：

(1)本發(fā)明的腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系及試劑盒，將所有目的基因的質(zhì)粒等拷貝數(shù)混合在一起，通過(guò)調(diào)整各病原體的引物濃度，使各靶點(diǎn)出現(xiàn)的峰高相當(dāng)，達(dá)到等效擴(kuò)增所有靶基因的目的。

(2)本發(fā)明的腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系及試劑盒優(yōu)化了反應(yīng)體系，加入了防污染的ung酶，在基因擴(kuò)增前有效消除基因擴(kuò)增片段污染，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，加入了反轉(zhuǎn)錄酶，實(shí)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄和基因擴(kuò)增一步完成，簡(jiǎn)化檢測(cè)流程和縮短檢測(cè)時(shí)間，也有效降低繁瑣的操作引起的污染。

(3)本發(fā)明的腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系及試劑盒結(jié)合毛細(xì)管電泳及熒光檢測(cè)技術(shù)，不同于傳統(tǒng)凝膠電泳分析模式，可將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽(yáng)性。該試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無(wú)雜峰，特異性高?？蓹z測(cè)低至10個(gè)拷貝的病原體，靈敏度高。

(4)本發(fā)明的腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系及試劑盒不需要采用腹瀉病原體常規(guī)的培養(yǎng)等步驟，在同一反應(yīng)體系直接對(duì)組織樣本進(jìn)行多重腹瀉病原體的同步檢測(cè)和分析，一次檢測(cè)得出所有結(jié)果，彌補(bǔ)了常規(guī)檢測(cè)方法通量低、步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)和檢出率低等缺點(diǎn)，成本低、便捷性好，第一時(shí)間為臨床提供全面、精準(zhǔn)、低成本的病原學(xué)診斷。

(5)不同的病原體引起的感染性腹瀉的治療和隔離的方法各不相同?！秶?guó)家衛(wèi)計(jì)委2015年抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》明確指出：“抗菌藥物的應(yīng)用必須根據(jù)患者的癥狀、體征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，明確診斷后可應(yīng)用”。但是，目前的常規(guī)檢測(cè)方法存在檢出率低、耗時(shí)長(zhǎng)、尤其無(wú)法同時(shí)對(duì)多種病原體進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定等缺點(diǎn)，導(dǎo)致臨床普遍采用廣譜性抗菌藥物進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療，造成療效低下、不能及時(shí)控制腹瀉、耐藥菌株高發(fā)和消化菌群紊亂等問(wèn)題。本發(fā)明采用建立了一種高通量、快速、準(zhǔn)確、低成本的腹瀉病原體鑒定系統(tǒng)，可以同步檢測(cè)19種感染性腹瀉常見(jiàn)病原體，有效彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方法檢出率低、耗時(shí)長(zhǎng)和不能同時(shí)進(jìn)行多種病原體鑒定等缺點(diǎn)，可在第一時(shí)間內(nèi)明確病原體種類(lèi)，以便臨床采取正確的治療方案和隔離措施，有效防止感染擴(kuò)散和減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒對(duì)腹瀉相關(guān)病原體混合陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行pcr反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒對(duì)腹瀉病原體系列稀釋并進(jìn)行pcr反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本1進(jìn)行pcr反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本2進(jìn)行pcr反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本3進(jìn)行pcr反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本4進(jìn)行pcr反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》一書(shū)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。

實(shí)施例

一、試劑盒的組成

本實(shí)施例的腹瀉病原體多重基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒包括：引物混合物、pcr緩沖液(5×pcrbuffer)、mgcl2溶液、dntps、熱啟動(dòng)dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合液、udg酶、陽(yáng)性對(duì)照物和陰性對(duì)照物。

pcr緩沖液、熱啟動(dòng)dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合液均來(lái)自qiagen公司(貨號(hào)：210212)。

熱啟動(dòng)dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合在一起形成混合液，其中熱啟動(dòng)dna聚合酶在反應(yīng)體系中的濃度是0.1u/μl，逆轉(zhuǎn)錄酶在混合液中的濃度是0.1u/μl。

陽(yáng)性對(duì)照液是包括所有目的基因靶點(diǎn)的質(zhì)?；旌衔?。

陰性對(duì)照液是無(wú)核酸酶超純水。

引物混合物中包括：針對(duì)空腸彎曲菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)志賀氏菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)艱難梭菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)腸炎沙門(mén)菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)腸出血性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)腸致病性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)腸黏附性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)弧菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)腸侵襲性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)大腸埃希菌o157的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)人星狀病毒的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)諾如病毒ii的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)人腸道腺病毒的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)輪狀病毒a的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)輪狀病毒b的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)輪狀病毒c的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)人rna內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)人dna內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對(duì)系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列。

人rna內(nèi)參是b2m，人dna內(nèi)參是rnasep，系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參是含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒。

各引物的特征如表1所示。引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1腹瀉病原體引物序列特征表

二、試劑盒的使用方法

本實(shí)施例的腹瀉病原體檢測(cè)試劑盒的具體檢測(cè)步驟如下：

1.樣本采集

將腹瀉患者的糞便組織標(biāo)本浸入生理鹽水中，采用天跟抽提試劑盒提取樣本總基因組，具體的操作參見(jiàn)抽提試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

獲得樣本核酸基因后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和od260/od280的比值控制樣本核酸質(zhì)量。樣本核酸的優(yōu)選濃度為10ng/μl～100ng/μl。od260/od280的比值的優(yōu)選范圍為1.7～1.9。

2.pcr反應(yīng)

采用本實(shí)施例的試劑盒中的試劑分別與基因模板(樣本核酸、陽(yáng)性對(duì)照液或陰性對(duì)照液)配制pcr反應(yīng)體系，具體組分如表2所示。

表2pcr反應(yīng)體系組分表

然后在pcr儀(abiveriti96well)上進(jìn)行pcr反應(yīng)程序，最優(yōu)反應(yīng)程序如表3所示。

表3pcr反應(yīng)程序表

3.毛細(xì)管電泳片段分析

在96孔樣品板的每個(gè)孔中加入9μl的甲酰胺(absciex公司，貨號(hào)：608082)和0.25μl的內(nèi)標(biāo)(dnasizestandard500，absciex公司，貨號(hào)：608098)，再將1μl的pcr產(chǎn)物加入其中。

根據(jù)ab3500dx毛細(xì)管電泳分析儀的操作手冊(cè)，將樣品板放入機(jī)器，運(yùn)行fragment分離程序。執(zhí)行默認(rèn)的分析方法，最后保存數(shù)據(jù)。

針對(duì)各個(gè)基因的pcr產(chǎn)物片段大小不同,得到的毛細(xì)管電泳峰圖，其中橫坐標(biāo)表示片段長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。

4.結(jié)果分析

毛細(xì)管電泳分析儀自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

三、試劑盒的檢測(cè)結(jié)果判定

1.試劑盒有效性判定

同時(shí)滿(mǎn)足下列條件，才可進(jìn)行結(jié)果判定：

1)陰性對(duì)照：只檢測(cè)到系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參特異峰。

2)陽(yáng)性對(duì)照：在各擴(kuò)增片段長(zhǎng)度處各檢測(cè)到一個(gè)熒光信號(hào)，且熒光信號(hào)值高于300。

2.樣本有效性判定：

2)若檢測(cè)樣本的熒光信號(hào)值至少有一個(gè)高于32000，則樣本加入過(guò)量，建議對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

3)若檢測(cè)樣本的熒光信號(hào)值均低于300，則樣本加入量較低，可適當(dāng)增加pcr產(chǎn)物加入量或增加pcr反應(yīng)循環(huán)數(shù)；若仍然不符合要求，需重新制備樣本。

3.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

腹瀉病原體感染鑒定

人dna內(nèi)參、人rna內(nèi)參、系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參和腹瀉病原體基因的目的片段區(qū)域出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且熒光信號(hào)值均高于300，可以判斷感染了腹瀉病原體。

4.結(jié)果判斷實(shí)例

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)單個(gè)陽(yáng)性對(duì)照分別進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析?；虻哪繕?biāo)片段區(qū)域空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、人星狀病毒、諾如病毒ii、人腸道腺病毒、輪狀病毒a、輪狀病毒b和輪狀病毒c的19種病原體均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰。該結(jié)果非常直觀(guān)，基因均擴(kuò)增良好。說(shuō)明每對(duì)引物能有效擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的目的基因，特異性好。

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)所有陽(yáng)性對(duì)照的混合進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析后圖譜如圖1所示?；虻哪繕?biāo)片段區(qū)域空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、人星狀病毒、諾如病毒ii、人腸道腺病毒、輪狀病毒a、輪狀病毒b和輪狀病毒c19種病原體均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰。該結(jié)果非常直觀(guān)，基因均擴(kuò)增良好。說(shuō)明各引物之間沒(méi)有干擾，能同時(shí)有效擴(kuò)增所有目的基因。

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)陰性對(duì)照進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析，沒(méi)有出現(xiàn)任何目的基因峰，只在小于100nt處有非特異性背景熒光信號(hào)。說(shuō)明該檢測(cè)體系特異性非常好。

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)單個(gè)腹瀉病原體陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行系列稀釋后，進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析后的圖譜如表4所示，檢測(cè)最低靈敏度艱難梭菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和輪狀病毒可達(dá)到1000個(gè)拷貝；空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌和人星狀病毒可達(dá)到100個(gè)拷貝；志賀菌、諾如病毒ii型和人腸道腺病毒可達(dá)到10個(gè)拷貝。說(shuō)明該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)腹瀉病原體單重感染檢測(cè)的靈敏度很高。

表4腹瀉病原體檢測(cè)靈敏度

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)所有的腹瀉病原體陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行混合后并系列稀釋后，進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析后的圖譜如圖2所示，在1000個(gè)拷貝/反應(yīng)的稀釋度時(shí)19種目標(biāo)病原體都可以被檢測(cè)出，且信號(hào)值均高于300，結(jié)果清晰易判讀。說(shuō)明該檢測(cè)體系對(duì)腹瀉病原體多重感染檢測(cè)靈敏度也很高。

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本1進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析后的圖譜如圖3所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時(shí)出現(xiàn)且信號(hào)值大于300，艱難梭菌(c.difficile)基因的目標(biāo)片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號(hào)值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明該患者感染了艱難梭菌。檢測(cè)結(jié)果非常直觀(guān)。

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本2進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析后的圖譜如圖4所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時(shí)出現(xiàn)且信號(hào)值大于300，鼠傷寒沙門(mén)(s.typhimurium)基因的目標(biāo)片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號(hào)值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明該患者感染了鼠傷寒沙門(mén)。檢測(cè)結(jié)果非常直觀(guān)。

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本3進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析后的圖譜如圖5所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時(shí)出現(xiàn)且信號(hào)值大于300，輪狀病毒(rov)基因的目標(biāo)片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號(hào)值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明該患者感染了輪狀病毒。檢測(cè)結(jié)果非常直觀(guān)。

采用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)樣本4進(jìn)行pcr反應(yīng)后采用毛細(xì)管電泳分析后的圖譜如圖6所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時(shí)出現(xiàn)且信號(hào)值大于300，艱難梭菌、鼠傷寒沙門(mén)菌和人腸道腺病毒(s.typhimurium、c.difficile、hadv)基因的目標(biāo)片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號(hào)值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明該患者同時(shí)感染了艱難梭菌、鼠傷寒沙門(mén)菌和人腸道腺病毒。檢測(cè)結(jié)果非常直觀(guān)。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式一一列舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。

sequencelisting

<110>華東醫(yī)院

<120>腹瀉病原體多重基因檢測(cè)體系及其試劑盒和應(yīng)用

<130>無(wú)

<160>44

<170>patentinversion3.3

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