本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種鑒定水稻谷粒長性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻稻谷粒長為稻米外觀品質(zhì)的重要影響因素，長粒米一般堊白較低，外觀品質(zhì)較好，商業(yè)價值較高，同時有助于提高粒重進(jìn)一步提高產(chǎn)量。受到育種工作者的青睞。稻谷粒長性狀的鑒定需要大量的樣品數(shù)量，在育種工作早世代時難以開展選擇工作，通過分子標(biāo)記輔助進(jìn)行長粒型稻米品種的選擇可以大大提高選擇效率，不受世代及樣品數(shù)量的限制，是改良水稻粒長性狀的最佳手段。gs3基因作為調(diào)控稻米粒長的主效qtl于2006年被成功克隆。gs3基因被定位于水稻3號染色體近著絲粒區(qū)，長粒gs3等位基因型與短粒gs3等位基因型的功能性堿基差異位于其第2內(nèi)含子，a-c的snp差異形成了上述兩種等位基因型。以明恢63(大粒)為輪回親本與日本晴(小粒)進(jìn)行連續(xù)雜交和回交，構(gòu)建了gs3的近等基因系。對bc3f2后代的201個隨機個體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)gs3解釋了該群體80-90％粒長的變異。針對于gs3基因，前人開發(fā)過幾對鑒定引物，分為連鎖標(biāo)記和基于酶切技術(shù)的功能性分子標(biāo)記。然而連鎖標(biāo)記在染色體重組過程中存在假陽性現(xiàn)象，基于酶切技術(shù)的功能性分子標(biāo)記在使用過程中由于涉及到限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用，其操作昂貴，耗時較長。綜上所述，已構(gòu)建的鑒定標(biāo)記不適用于分子標(biāo)記輔助育種中大量材料的檢測，基于pcr技術(shù)可供鑒定上述兩種等位基因型的功能性分子標(biāo)記缺失。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供的一種鑒定水稻谷粒長性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用，是目前唯一一個針對于gs3基因構(gòu)建的pcr類型的功能性分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記能夠較好區(qū)分水稻谷粒長性狀的兩種等位基因型，操作簡單，耗費較低。本發(fā)明的第一個目的是提供一種鑒定水稻谷粒長性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為gs3-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的gs3-tpap-o-f、seqidno.2所示的gs3-tpap-o-r、seqidno.3所示的gs3-tpap-i-f和seqidno.4所示的gs3-tpap-i-r。本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻谷粒長性狀的方法，包括以下步驟：s1，提取待測水稻材料的基因組dna；s2，以s1獲得的基因組dna為模板，以gs3-tpap-o-f、gs3-tpap-o-r、gs3-tpap-i-f和gs3-tpap-i-r為引物進(jìn)行pcr擴增；s3，結(jié)果判定以gs3-tpap-o-f與gs3-tpap-o-r結(jié)合擴增出270bp片段作為陽性對照；當(dāng)gs3-tpap-i-f與gs3-tpap-o-r結(jié)合擴增出147bp片段時，檢測材料為長粒等位基因型a；當(dāng)gs3-tpap-o-f與gs3-tpap-i-r結(jié)合擴增出177bp片段時，檢測材料為短粒等位基因型c。優(yōu)選的，上述分子標(biāo)記鑒定水稻谷粒長性狀的方法，pcr擴增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s、55.1℃退火30s、72℃延伸30s-50s、35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃冷卻10min。本發(fā)明的第三個目的是提供一種上述分子標(biāo)記在水稻谷粒長性狀分子標(biāo)記輔助選育中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個目的是提供一種上述鑒定水稻谷粒長性狀的方法在水稻谷粒長性狀分子標(biāo)記輔助選育中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種鑒定水稻谷粒長性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用，具有以下有益效果：本發(fā)明基于gs3基因其第2內(nèi)含子a-c的功能性snp差異，利用四引物受阻擴增突變原理(tetra-primerarms-pcr)，設(shè)計基于pcr的功能性分子標(biāo)記gs3-tpap，并構(gòu)建了該標(biāo)記的pcr擴增體系。分子標(biāo)記gs3-tpap是目前唯一一個針對于gs3基因構(gòu)建的pcr類型的功能性分子標(biāo)記。目前，gs3基因等位基因型的鑒定主要利用gs09、mrg5881及gs3-psti等幾個標(biāo)記。gs09和mrg5881是連鎖標(biāo)記，在染色體重組過程中存在假陽性現(xiàn)象，準(zhǔn)確率在50-70％之間；gs3-psti為功能性分子標(biāo)記，準(zhǔn)確率較高，但由于涉及到限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用，其操作昂貴，耗時較長。已構(gòu)建的鑒定標(biāo)記不適用于分子標(biāo)記輔助育種中大量材料的檢測。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記gs3-tpap是從dna堿基的功能性多態(tài)性進(jìn)行鑒定，為功能性分子標(biāo)記，發(fā)明人經(jīng)過大量實驗材料證實該分子標(biāo)記的準(zhǔn)確率達(dá)100％，不受環(huán)境條件的影響；相比于酶切標(biāo)記gs3-psti可以顯著提高檢測效率，能夠較好的區(qū)分兩種等位基因型，降低檢測成本，pcr擴增操作簡單，具有高通量特性，耗費較低，為gs3基因等位基因型的鑒定及相應(yīng)的分子標(biāo)記輔助選擇工作打下了堅實的基礎(chǔ)，適合于大范圍推廣使用。附圖說明圖1為明恢63材料的gs3基因；圖2為日本晴材料的gs3基因；圖3為不同退火溫度組進(jìn)行pcr擴增結(jié)果；其中，m泳道為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、3、5、7、9、11、13、15泳道分別為明恢63材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火溫度下的擴增結(jié)果；2、3、4、5、10、12、14、16泳道分別為日本晴材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火溫度下的擴增結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明提供的一種鑒定水稻谷粒長性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為gs3-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的gs3-tpap-o-f、seqidno.2所示的gs3-tpap-o-r、seqidno.3所示的gs3-tpap-i-f和seqidno.4所示的gs3-tpap-i-r。具體按照以下方法獲得：通過rap-db查找克隆序列(os03g0407400)：選用其第2內(nèi)含子a-c的snp差異進(jìn)行設(shè)計，供試材料為gs3基因已知等位基因型材料，明恢63攜帶長粒等位基因型gs3，日本晴攜帶短粒等位基因型gs3。利用在線引物設(shè)計軟件primer1進(jìn)行分子標(biāo)記設(shè)計，命名為gs3-tpap，gs3-tpap包括seqidno.1所示的gs3-tpap-o-f、seqidno.2所示的gs3-tpap-o-r、seqidno.3所示的gs3-tpap-i-f和seqidno.4所示的gs3-tpap-i-r，其序列信息詳見表1。seqidno.5為攜帶長粒等位基因型明恢63的核苷酸序列，其中第1-30位為gs3-tpap-o-f的結(jié)合位點，第242-270位為gs3-tpap-o-r的結(jié)合位點，第124-149位為gs3-tpap-i-f的結(jié)合位點，第149-177位為gs3-tpap-i-r的無效擴增位點。如圖1所示，圖1中snp差異位點用加黑斜體字母a表示，帶下劃線的字母表示引物結(jié)合位點，實線箭頭表示引物擴增方向，虛線箭頭表示不能有效擴增。seqidno.6為攜帶短粒等位基因型日本晴的核苷酸序列，其中第1-30位為gs3-tpap-o-f的結(jié)合位點，第242-270位為gs3-tpap-o-r的結(jié)合位點，第124-149位為gs3-tpap-i-f的無效擴增位點，第149-177位為gs3-tpap-i-r的結(jié)合位點。如圖2所示，圖2中snp差異位點用加黑斜體字母c表示，帶下劃線的字母表示引物結(jié)合位點，實線箭頭表示引物擴增方向，虛線箭頭表示不能有效擴增。表1gs3-tpap中各分子標(biāo)記序列基因標(biāo)記序列(5’-3’)gs3gs3-tpap-i-fggatccacgctgcctccagatgcttags3gs3-tpap-i-raaagaaacagcaggctggcttactctcgggs3gs3-tpap-o-fcctcagacatcacctgaaaagttgacaggcgs3gs3-tpap-o-rcggtcaaagttcatgatcaaaaactgggg實施例1利用上述分子標(biāo)記gs3-tpap鑒定供試水稻材料的谷粒長性狀，具體包括以下步驟：供試材料為gs3基因克隆試驗中的對照材料明恢63和日本晴，其中明恢63攜帶長粒等位基因型gs3，日本晴攜帶短粒等位基因型gs3。s1，分別提取明恢63和日本晴兩個待測水稻材料的基因組dna，基因組dna提取采用全式金植物dna提取試劑盒進(jìn)行(操作按照試劑盒說明)。s2，以s1獲得的基因組dna為模板，以gs3-tpap-o-f、gs3-tpap-o-r、gs3-tpap-i-f和gs3-tpap-i-r為引物進(jìn)行pcr擴增。pcr擴增反應(yīng)體系為10μl：包括dna0.2μl(1ng/μl)；gs3-tpap-o-f、gs3-tpap-o-r各0.3μl，gs3-tpap-i-f、gs3-tpap-i-r各0.2μl；2×tappcrmastermix(帶染料，康為世紀(jì)公司購買)5.0μl；ddh2o3.8μl。其中g(shù)s3-tpap-o-f、gs3-tpap-o-r為外引物，gs3-tpap-i-f和gs3-tpap-i-r為內(nèi)引物，各引物濃度均為4pmol/μl。pcr擴增反的應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s、55.1℃退火30s、72℃延伸30s、35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃冷卻10min。反應(yīng)產(chǎn)物在5％瓊脂糖凝膠上100v電泳1h，經(jīng)溴化乙錠(ethidiumbromide，eb)染色后并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，記錄結(jié)果。s3，結(jié)果判定以gs3-tpap-o-f與gs3-tpap-o-r結(jié)合擴增出270bp片段作為陽性對照；當(dāng)gs3-tpap-i-f與gs3-tpap-o-r結(jié)合擴增出147bp片段時，檢測材料為長粒等位基因型a；當(dāng)gs3-tpap-o-f與gs3-tpap-i-r結(jié)合擴增出177bp片段時，檢測材料為短粒等位基因型c。通過gs3-tpap對2個對照材料的8個退火溫度組進(jìn)行pcr擴增，其中，pcr擴增的8個退火溫度分別為55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃，其余程序均參照上一段pcr擴增反應(yīng)程序的記載。不同退火溫度組進(jìn)行pcr擴增結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，當(dāng)退火溫度為55.1℃時，電泳圖中條帶區(qū)分明顯，不存在假陽性現(xiàn)象。gs3-tpap-o-f與gs3-tpap-o-r結(jié)合擴增出270bp片段作為陽性對照；當(dāng)檢測材料為長粒等位基因型明恢63時，gs3-tpap-i-f與gs3-tpap-o-r結(jié)合擴增出147bp片段；當(dāng)檢測材料為短粒等位基因型日本晴時，gs3-tpap-o-f與gs3-tpap-i-r結(jié)合擴增出177bp片段。由于選取的對照材料為前人研究中該基因位點已測序材料，證實了gs3-tpap的有效性及準(zhǔn)確性。實施例2利用分子標(biāo)記gs3-tpap進(jìn)行dh群體后代的基因型檢測dh群體為長粒等位基因型水稻品種明恢63(父本)雜交短粒等位基因型水稻品種秋光(母本)，由花藥培養(yǎng)而獲得的140個穩(wěn)定品系，通過標(biāo)記gs3-tpap進(jìn)行140個穩(wěn)定品系的gs3等位基因型鑒定，并與2012-2013年兩年谷粒長表型進(jìn)行對比，結(jié)果如表2所示，2012年，長粒等位基因型水稻品共計59個，表型均為長粒，如平均谷粒長度可達(dá)8.25mm；短粒等位基因型水稻品種共計81個，表型均為短粒，如平均谷粒長度僅為5.56mm；2013年，長粒等位基因型水稻品共計59個，表型均為長粒，如平均谷粒長度可達(dá)8.44mm；短粒等位基因型水稻品種共計81個，表型均為短粒，如平均谷粒長度僅為5.19mm。統(tǒng)計分析表明不同等位基因型后代谷粒長性狀差異達(dá)到極顯著水平，基因型與表型吻合，證實了標(biāo)記gs3-tpap的準(zhǔn)確性。表2利用分子標(biāo)記gs3-tpap檢測dh群體谷粒長及谷粒長表型對比結(jié)果注釋：標(biāo)注字母a及b代表了0.01水平上的顯著性實例2利用分子標(biāo)記gs3-tpap進(jìn)行ril群體后代的基因型檢測ril群體為長粒等位基因型水稻品種明恢63(父本)雜交短粒等位基因型水稻品種橋科951(母本)，由單粒傳方法而獲得的110個穩(wěn)定品系，通過標(biāo)記gs3-tpap進(jìn)行110個穩(wěn)定品系的gs3等位基因型鑒定，并與2013-2014年兩年谷粒長表型進(jìn)行對比，結(jié)果如表3所示，2013年，長粒等位基因型水稻品共計38個，表型均為長粒，如平均谷粒長度可達(dá)8.38mm；短粒等位基因型水稻品種共計72個，表型均為短粒，如平均谷粒長度僅為5.32mm；2014年，長粒等位基因型水稻品共計38個，表型均為長粒，如平均谷粒長度可達(dá)8.39mm；短粒等位基因型水稻品種共計72個，表型均為短粒，如平均谷粒長度僅為5.31mm。統(tǒng)計分析表明不同等位基因型后代谷粒長性狀差異達(dá)到極顯著水平，基因型與表型吻合，證實了標(biāo)記gs3-tpap的準(zhǔn)確性。表3利用分子標(biāo)記gs3-tpap檢測ril群體谷粒長及谷粒長表型對比結(jié)果注釋：標(biāo)注字母a及b代表了0.01水平上的顯著性需要說明的是，本發(fā)明權(quán)利要求書中涉及數(shù)值范圍時，應(yīng)理解為每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用，由于采用的步驟方法與上述實施例相同，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。序列表<120>一種鑒定水稻谷粒長性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<400>1cctcagacatcacctgaaaagttgacaggc30<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2cggtcaaagttcatgatcaaaaactgggg29<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<400>3ggatccacgctgcctccagatgctta26<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4aaagaaacagcaggctggcttactctcgg29<210>5<211>270<212>dna<213>明恢63<400>5cctcagacatcacctgaaaagttgacaggctaaacacatgcccatctccctcgtttactt60aaattaattcgaacaaacaactgtatatatatttcttgcagggtgaaataaattcaatcg120aagggatccacgctgcctccagatgctgaagagagtaagccagcctgctgtttctttttg180tactacttccatttcttctcgtctttactcttaccatgcattcacaaaatatacttactt240accccagtttttgatcatgaactttgaccg270<210>6<211>270<212>dna<213>日本晴<400>6cctcagacatcacctgaaaagttgacaggctaaacacatgcccatctccctcgtttactt60aaattaattcgaacaaacaactgtatatatatttcttgcagggtgaaataaattcaatcg120aagggatccacgctgcctccagatgctgcagagagtaagccagcctgctgtttctttttg180tactacttccatttcttctcgtctttactcttaccatgcattcacaaaatatacttactt240accccagtttttgatcatgaactttgaccg270當(dāng)前第1頁12