本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種單克隆抗體。
背景技術(shù)：
：凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)是止血過程的中心環(huán)節(jié)。當(dāng)凝血途徑存在缺陷時(shí)，出血時(shí)間(bleedingtime)延長(zhǎng)，出血量增加。凝血因子是參與凝血過程的蛋白質(zhì)分子，生理情況下，多數(shù)凝血因子以無活性的酶原形式存在，當(dāng)組織損傷時(shí)，這些凝血因子相繼被酶解激活轉(zhuǎn)化為有活性的蛋白酶，最終凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，使可溶性的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白團(tuán)塊。凝血因子vii屬維生素k依賴的凝血因子,由肝臟合成，其主要作用是與組織因子形成復(fù)合物，從而啟動(dòng)外源性凝血途徑。血友病a和血友病b為x染色體連鎖的遺傳性出血性疾病，分別以凝血因子viii(fviii)和ix(fix)缺乏為特征。這類病人面臨著創(chuàng)傷后大量出血和自發(fā)性出血的危險(xiǎn)。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)顯示血友病a的發(fā)病率約為1/5000新生男嬰，血友病b的發(fā)病率約1/20000新生男嬰。血友病的傳統(tǒng)治療方式是凝血因子補(bǔ)充治療，即靜脈輸注血漿來源或基因重組的fviii或fix，糾正凝血因子異常，降低出血傾向。但是，約有25％的重癥血友病a病人產(chǎn)生fviii抑制物(抗體)，約有4％的重癥血友病b病人產(chǎn)生fix抑制物，使凝血因子補(bǔ)充治療療效降低甚至無效。許多患者死于無法控制的出血；因出血而導(dǎo)致的重度關(guān)節(jié)損害的問題仍然十分嚴(yán)重；對(duì)有抑制物的患者進(jìn)行手術(shù)時(shí)如何止血，尤其是一個(gè)特殊的難題。fviia可通過旁路途徑繞過依賴于fviii和fix的凝血途徑，激活fx產(chǎn)生fxa,促進(jìn)大量的凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶，形成“凝血酶爆發(fā)”。重組fviia用于治療存在有fviii或fix抑制物的先天性血友病患者的自發(fā)性或手術(shù)性出血，先天性凝血因子vii缺乏患者。人凝血因子vii抗體可用于重組凝血因子vii的親和層析純化及檢測(cè)。然而，一般抗體介導(dǎo)的親和層析需采用酸洗脫，由此產(chǎn)生的影響之一是改變了純化工藝中的樣品緩沖液，使純化工藝復(fù)雜化；此外，低ph極有可能影響樣品的活性。而鈣離子依賴的抗體可在原有樣品緩沖液中加入鈣離子螯合劑edta使抗原抗體分離，避免了酸洗脫帶來的上述不利影響。因此，迫切需要自主開發(fā)鈣離子依賴的抗人凝血因子vii單克隆抗體。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種單克隆抗體。該單克隆抗體可與凝血因子vii特異性結(jié)合，具有較好的親和力。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種鈣離子依賴的特異性結(jié)合凝血因子vii的單克隆抗體，由保藏編號(hào)為cctccno：c2012158的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下：用商品化的重組人活化凝血因子vii(novoseven)與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化后于balb/c小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，4周后取novoseven與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后小鼠背部皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫一次，8周后取novoseven小鼠尾靜脈注射免疫沖擊，4天后取出脾臟，分離出脾臟細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0以10:1的細(xì)胞數(shù)比例混合，離心后于細(xì)胞沉淀中加入融合劑peg1500進(jìn)行融合，轉(zhuǎn)入96孔板中用含1％hat的選擇性培養(yǎng)基篩選，以后每隔2天對(duì)半換液，10-14天取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行elisa檢測(cè)篩選。為篩選鈣離子依賴的抗fvii抗體，novoseven(1μg/ml)包被的elisa板，預(yù)先加入含/不含10mmedta的tbs，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時(shí)，tbst(0.1％tween-20)洗滌5次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠igg二抗，37℃孵育1小時(shí)，tbst(0.1％tween-20)洗滌5次后加入tmb底物顯色，1n硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)od450。獲得了一株在不含edta的上清結(jié)合強(qiáng)陽性而加入10mmedta顯著抑制抗體結(jié)合的雜交瘤細(xì)胞3g3(表1、圖1)。結(jié)果表明3g3抗體結(jié)合fvii依賴鈣離子的存在；而另一株雜交瘤3d7在edta存在下仍能與fvii結(jié)合，說明3d7結(jié)合fvii不依賴于鈣離子。進(jìn)而對(duì)3g3雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化，將3g3細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存保種。單克隆抗體的純化：在注射雜交瘤細(xì)胞前5-7天，預(yù)先腹腔注射pristane0.5ml/只，取3g3細(xì)胞腹腔注射，10-14天后腹腔穿刺采集小鼠腹水，37℃放置半小時(shí)后4℃放置過夜。第二天離心去除血凝塊，在腹水中加入3倍體積的磷酸緩沖液，離心，上清用濾膜過濾后用proteing柱純化。單克隆抗體的鑒定：采用roche公司的抗體亞型鑒定試紙條對(duì)3g3抗體亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)3g3單克隆抗體亞型為igg1,kappa型(圖2)。本發(fā)明還提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為cctccno：c2012158。本發(fā)明還提供了所述的單克隆抗體在制備用于純化凝血因子vii的工具中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述純化為親核層析純化。本發(fā)明還提供了一種純化工具，包括所述的單克隆抗體。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述純化為親核層析純化。本發(fā)明還提供了所述的單克隆抗體在制備用于檢測(cè)凝血因子vii的檢測(cè)工具中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)工具為試劑盒、芯片或試紙。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)工具，包括所述的單克隆抗體。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)工具為試劑盒、芯片或試紙。本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株(保藏編號(hào)為cctccno：c2012158)，以及由此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體3g3。本發(fā)明還提供了單克隆抗體在制備用于純化凝血因子vii的工具中的應(yīng)用以及其在制備用于檢測(cè)凝血因子vii的檢測(cè)工具中的應(yīng)用，含有該單克隆抗體的檢測(cè)工具。本發(fā)明提供的單克隆抗體3g3結(jié)合fvii依賴鈣離子的存在。采用roche公司的抗體亞型鑒定試紙條對(duì)3g3抗體亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)3g3單克隆抗體亞型為igg1,kappa型。經(jīng)過本發(fā)明提供的單克隆抗體固相化用于純化凝血因子vii，結(jié)果表明，應(yīng)用單克隆抗體3g3偶聯(lián)的sepharose4b可成功純化重組人凝血因子vii，目的蛋白分子量顯示為60kda，與預(yù)期一致。用商品化的重組凝血因子fvii(novoseven)包被在生物傳感芯片上，使用biacorex100蛋白相互作用系統(tǒng)測(cè)定3g3單克隆抗體的親和常數(shù)。結(jié)果顯示3g3抗體的親和常數(shù)為1.3×10-9m。表明本發(fā)明提供的單克隆抗體3g3與凝血因子fvii的親和力非常好。當(dāng)本發(fā)明提供的單克隆抗體用于純化凝血因子fvii時(shí)，由于鈣離子依賴的單克隆抗體3g3可在原有樣品緩沖液中加入鈣離子螯合劑edta使抗原抗體分離，避免了酸洗脫帶來的不利影響。生物保藏說明雜交瘤細(xì)胞株anti-f7-3g3：分類命名：雜交瘤細(xì)胞株anti-f7-3g3，于2012年11月8日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏中心地址為湖北省武昌市珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏編號(hào)為cctccno.c2012158。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示elisa篩選鈣離子依賴的抗人fvii抗體；圖2示3g3抗體亞型鑒定；圖3示sds-page電泳后考馬斯亮藍(lán)染色鑒定親和層析純化的重組凝血因子vii；nr:非還原條件；r：還原條件；圖4示3g3單克隆抗體的親和常數(shù)；其中，線1示150nm；線2示75nm；線3示37.5nm；線4示18.75nm；線5示9.375nm。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種單克隆抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的單克隆抗體的各個(gè)具體實(shí)施方案中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1動(dòng)物免疫及雜交瘤篩選用商品化的重組人活化凝血因子vii(novoseven)100μg與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化后于balb/c小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，4周后取100μgnovoseven與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后小鼠背部皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫一次，8周后取100μgnovoseven小鼠尾靜脈注射免疫沖擊，4天后取出脾臟，分離出脾臟細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0以10:1的細(xì)胞數(shù)比例混合，離心后于細(xì)胞沉淀中加入1ml融合劑peg1500進(jìn)行融合，轉(zhuǎn)入96孔板中用含1％hat的選擇性培養(yǎng)基篩選，以后每隔2天對(duì)半換液，10-14天取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行elisa檢測(cè)篩選。為篩選鈣離子依賴的抗fvii抗體，novoseven(1μg/ml)包被的elisa板，預(yù)先加入50μl含/不含10mmedta的tbs，然后加入50μl細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時(shí)，tbst(0.1％tween-20)洗滌5次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠igg二抗，37℃孵育1小時(shí)，tbst(0.1％tween-20)洗滌5次后加入tmb底物顯色，1n硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)od450。獲得了一株在不含edta的上清結(jié)合強(qiáng)陽性而加入10mmedta顯著抑制抗體結(jié)合的雜交瘤細(xì)胞3g3(表1、圖1)，結(jié)果表明3g3抗體結(jié)合fvii依賴鈣離子的存在；而另一株雜交瘤3d7在edta存在下仍能與fvii結(jié)合，說明3d7結(jié)合fvii不依賴于鈣離子。進(jìn)而對(duì)3g3雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化，將3g3細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存保種。表1edta抑制3g3抗體結(jié)合凝血因子vii組別od4503g32.1443d72.2383g3+edta0.1733d7+edta2.231實(shí)施例2抗人凝血因子vii單克隆抗體的純化在注射雜交瘤細(xì)胞前5-7天，預(yù)先腹腔注射pristane0.5ml/只，取5×1063g3細(xì)胞腹腔注射，10-14天后腹腔穿刺采集小鼠腹水，37℃放置半小時(shí)后4℃放置過夜。第二天離心去除血凝塊，在腹水中加入3倍體積的磷酸緩沖液，13000rpm離心30分鐘，上清用0.4μm濾膜過濾后用proteing柱純化。實(shí)施例3抗體亞型鑒定采用roche公司的抗體亞型鑒定試紙條對(duì)3g3抗體亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)3g3單克隆抗體亞型為igg1,kappa型(圖2)。實(shí)施例4抗體固相化用于純化凝血因子vii3g3單克隆抗體偶聯(lián)sepharose4b凝膠的制備：稱取0.268g溴化氰活化的sepharose4b干膠，加入10ml預(yù)冷的1mm鹽酸溶脹30分鐘，離心后沉淀加入15ml預(yù)冷的1mm鹽酸洗滌，離心，凝膠用偶聯(lián)緩沖液洗滌一次，加入6mg3g3單克隆抗體，室溫溫和混勻反應(yīng)2小時(shí)，離心，用偶聯(lián)緩沖液洗游離的3g3抗體，然后用0.1mtris-hcl(ph8.0)封閉，室溫反應(yīng)1小時(shí)。依次用低ph洗滌緩沖液(0.1m醋酸鈉，0.5m氯化鈉，ph3.5)和高ph洗滌緩沖液(0.1m碳酸氫鈉，0.5m氯化鈉，ph8.3)洗滌，反復(fù)洗滌4次后裝柱。4℃保存。親和層析純化重組凝血因子vii:轉(zhuǎn)染重組凝血因子vii的cho細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)換含10μg/ml維生素k1的無血清培養(yǎng)基cd-cho(invitrogen公司)，連續(xù)培養(yǎng)7天后，收集上清，高速離心去除不溶性顆粒，0.22μm過濾，加入3g3-sepharose4b凝膠柱中，洗滌去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，目的蛋白用含10mmedta的tbs緩沖液洗脫，收集洗脫產(chǎn)物，每管收集2ml，共收集5管。洗脫產(chǎn)物加入等體積還原型上樣緩沖液，煮沸5分鐘后冷卻，上樣，經(jīng)10％sds-page電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色，觀察凝血因子純化效果。結(jié)果：可見應(yīng)用3g3單克隆抗體偶聯(lián)的sepharose4b可成功純化重組人凝血因子vii,目的蛋白分子量顯示為60kda，與預(yù)期一致(圖3)。實(shí)施例5鈣離子依賴的fvii的單克隆抗體3g3親和力測(cè)定用商品化的重組凝血因子fvii(novoseven)包被在生物傳感芯片上，使用biacorex100蛋白相互作用系統(tǒng)測(cè)定3g3單克隆抗體的親和常數(shù)。實(shí)驗(yàn)材料：cm5芯片：ge,貨號(hào)br100012；runningbuffer：10mmhepes,150mmnacl,5mmedtana2,0.05％p20,ph7.4；氨基偶聯(lián)試劑盒：ge，貨號(hào)：2060499；樣品：3g3單克隆抗體以及重組人凝血因子vii(novoseven)各1支。實(shí)驗(yàn)方法：1、偶聯(lián)根據(jù)等電點(diǎn)以及按照biacorex100controlsoft的protocol優(yōu)化偶聯(lián)條件，斜率優(yōu)化選擇醋酸鈉作為偶聯(lián)稀釋緩沖液。用此緩沖液稀釋novoseven樣品至25μg/ml后偶聯(lián)到cm5芯片上。預(yù)設(shè)偶聯(lián)水平1500ru。2、kd測(cè)試用ph7.4的runningbuffer稀釋3g3單克隆抗體，稀釋一系列濃度至0nm、9.375nm、18.75nm、37.5nm、75nm、150nm。設(shè)置結(jié)合時(shí)間為180s，解離時(shí)間15min，再生緩沖液用50mmgly-hcl(ph1.7)。按照biacorex100controlsoft的protocol進(jìn)行上機(jī)測(cè)試。3、數(shù)據(jù)處理采用biacorex100自帶分析軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)解讀如下：ka：結(jié)合常數(shù)，反應(yīng)結(jié)合快慢程度，數(shù)值越大結(jié)合越快。kd：解離常數(shù)，反應(yīng)解離快慢程度，數(shù)值越小解離越慢。kd：kd＝kd/ka，親和力常數(shù)，反應(yīng)抗原抗體結(jié)合牢固程度，數(shù)值越小，親和力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、偶聯(lián)根據(jù)抗原的等電點(diǎn)特性以及結(jié)合斜率，最終選擇ph4.5醋酸鈉作為偶聯(lián)稀釋緩沖液。偶聯(lián)水平為1500ru。2、親和力結(jié)果：見圖4。結(jié)果顯示3g3抗體的親和常數(shù)為1.3×10-9m。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12