本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合人白細胞抗原-g(hla-g)的抗體及其在癌癥治療中的用途。

背景技術(shù)：

1、盡管過去幾十年來人們已經(jīng)對癌癥進行了深入的研究，但癌癥仍然是世界范圍內(nèi)的一個主要死亡原因。已經(jīng)開發(fā)了許多癌癥治療方法，諸如手術(shù)、化療和放療等方法至今仍在使用。然而，這些現(xiàn)有的癌癥治療方法大多僅在癌癥尚未轉(zhuǎn)移的早期階段有效，并且存在當已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移時即使在手術(shù)后也有很大可能復發(fā)的問題。因此，為了更有效地治療癌癥，對利用免疫反應(yīng)的免疫療法的研究一直在持續(xù)進行。

2、免疫療法是一種防止癌細胞逃避人體的免疫系統(tǒng)，從而使得免疫細胞更好地識別和攻擊癌細胞的治療方法。具體地，免疫療法可通過非特異性免疫細胞激活來誘導癌細胞的死亡，或使用腫瘤特異性抗原在癌癥患者的免疫細胞中誘導針對腫瘤的免疫反應(yīng)。

3、同時，人主要組織相容性復合體i類g，也稱為人白細胞抗原-g(hla-g)，是抑制t細胞、自然殺傷(nk)細胞和細胞毒性t細胞的激活和分裂的免疫檢查點。hla-g的已知免疫細胞受體包括ig樣轉(zhuǎn)錄物2(ilt2)、ilt4和殺傷細胞免疫球蛋白樣受體兩個ig結(jié)構(gòu)域和長胞質(zhì)尾4(kir2dl4)，并且所有這些受體都具有免疫受體酪氨酸抑制性(itim)基序。當hla-g與受體結(jié)合時，抑制免疫細胞的信號通路被該基序激活。

4、雖然hla-g的表達僅限于正常細胞，但已有報道稱，hla-g在許多類型的癌細胞中表達(lin?a、yan?wh.human?leukocyte?antigen-g(hla-g)expression?in?cancers:rolesin?immune?evasion,metastasis?and?target?for?therapy.mol?med.21(1),782-791(2015))。此外，已有報道稱，許多癌癥患者的癌細胞中的hla-g表達水平與癌癥的分期有關(guān)，還有報道稱，表達hla-g的患者生存率較低(ye,sr.、yang,h.、li,k.等人humanleukocyte?antigen?g?expression:as?a?significant?prognostic?indicator?forpatients?with?colorectal?cancer.mod?pathol?20,375-383(2007))。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、在以上情況下，本發(fā)明人嘗試了開發(fā)人白細胞抗原-g(hla-g)特異性抗體，以通過抑制hla-g的功能來增加免疫細胞對癌細胞的靶向能力。因此，本發(fā)明人開發(fā)了一種能夠結(jié)合hla-g單體和二聚體的hla-g特異性抗體，從而完成了本發(fā)明。

3、因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種hla-g特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。

4、此外，本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其提供hla-g特異性抗體或其抗原結(jié)合片段作為活性成分。

5、技術(shù)方案

6、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個方面提供了一種抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段包含：

7、(a)包含seq?id?no:1的氨基酸序列的重鏈互補決定區(qū)1(cdr1)、包含seq?id?no:2的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:3的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

8、包含seq?id?no:5的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:6的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:7的氨基酸序列的輕鏈cdr3；

9、(b)包含seq?id?no:9的氨基酸序列的重鏈cdr1、包含seq?id?no:10的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:11的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

10、包含seq?id?no:13的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:14的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:15的氨基酸序列的輕鏈cdr3；

11、(c)包含seq?id?no:17的氨基酸序列的重鏈cdr1、包含seq?id?no:18的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:19的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

12、包含seq?id?no:21的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:22的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:23的氨基酸序列的輕鏈cdr3；或

13、(d)包含seq?id?no:25的氨基酸序列的重鏈cdr1、包含seq?id?no:26的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:27的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

14、包含seq?id?no:29的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:30的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:31的氨基酸序列的輕鏈cdr3。

15、在本發(fā)明中，抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段可包含以下序列：

16、(a)包含seq?id?no:4的氨基酸序列或與seq?id?no:4的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:8的氨基酸序列或與seq?id?no:8的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

17、(b)包含seq?id?no:12的氨基酸序列或與seq?id?no:12的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:16的氨基酸序列或與seq?idno:16的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

18、(c)包含seq?id?no:20的氨基酸序列或與seq?id?no:20的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:24的氨基酸序列或與seq?idno:24的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或

19、(d)包含seq?id?no:28的氨基酸序列或與seq?id?no:28的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:32的氨基酸序列或與seq?idno:32的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

20、更具體地，在本發(fā)明的一個實施方式中，抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段可包含以下序列：

21、(a)包含seq?id?no:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

22、(b)包含seq?id?no:12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

23、(c)包含seq?id?no:20的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或

24、(d)包含seq?id?no:28的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seq?id?no:32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

25、如本文所用，術(shù)語“抗體”是指用作特異性識別抗原的受體的蛋白質(zhì)分子，包括在免疫學上對特定抗原具有反應(yīng)性的免疫球蛋白分子?？贵w包括單克隆抗體、多克隆抗體、單克隆和/或多克隆抗體的混合物、全長抗體和抗體片段。全長抗體或完整抗體可互換使用，是指具有與天然抗體結(jié)構(gòu)基本上相似的結(jié)構(gòu)或具有含有如本文所定義的可結(jié)晶片段(fc)區(qū)域的重鏈的抗體。

26、此外，抗體可包括二價或雙特異性分子(例如，雙特異性抗體)。另外，根據(jù)序列的來源，抗體可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。

27、如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上相同的抗體群體獲得的單一分子組成的抗體分子，并且此類單克隆抗體表現(xiàn)出對特定表位的單一結(jié)合和親和力，這與可結(jié)合多個表位的多克隆抗體不同。如本文所用，術(shù)語“全長抗體”具有包含兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈的結(jié)構(gòu)，每條輕鏈通過二硫鍵與重鏈連接。重鏈恒定區(qū)具有伽瑪(γ)、繆(μ)、阿爾法(α)、德爾塔(δ)和艾普西龍(ε)型，并且具有伽瑪1(γ1)、伽瑪2(γ2)、伽瑪3(γ3)、伽瑪4(γ4)、阿爾法1(α1)和阿爾法2(α2)作為亞類。輕鏈恒定區(qū)具有喀帕(κ)和拉姆達(λ)型。igg具有亞型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。

28、如本文所用，術(shù)語“重鏈”可包括全長重鏈，所述全長重鏈包含可變區(qū)vh(其包含具有足夠的可變區(qū)序列以賦予對抗原的特異性的氨基酸序列)和三個恒定區(qū)ch1、ch2和ch3及其片段。另外，如本文所用，術(shù)語“輕鏈”可包括全長輕鏈，所述全長輕鏈包含可變區(qū)vl(其包含具有足夠的可變區(qū)序列以賦予對抗原的特異性的氨基酸序列)和恒定區(qū)cl及其片段。

29、如本文所用，術(shù)語“嵌合抗體”是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其余部分源自不同來源或物種的抗體。例如，存在通過將小鼠抗體的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)重組而形成的嵌合抗體，并且它是與小鼠抗體相比免疫反應(yīng)大大改善的抗體。

30、如本文所用，術(shù)語“人源化抗體”是指通過對源自非人物種的抗體的蛋白質(zhì)序列進行修飾，以使其與在人體中天然產(chǎn)生的抗體相似而形成的抗體。例如，可通過將源自小鼠的cdr與源自人抗體的框架區(qū)(fr)重組以產(chǎn)生人源化可變區(qū)，并將其與優(yōu)選的人抗體恒定區(qū)重組來產(chǎn)生人源化抗體。然而，當僅進行cdr移植時，人源化抗體的親和力降低，因此，通過用小鼠抗體的fr氨基酸殘基取代被認為影響cdr的三維結(jié)構(gòu)的若干重要的fr氨基酸殘基，可使親和力升高至與原始小鼠抗體相同的水平。

31、此外，本發(fā)明提供了抗hla-g抗體的抗原結(jié)合片段?？乖Y(jié)合片段可選自由以下組成的組：抗原結(jié)合片段(fab)、fab'、f(ab')2、可變片段(fv)、二硫鍵穩(wěn)定的fv片段(dsfv)、單鏈fv(scfv)、雙抗體、三抗體和四抗體。

32、如本文所用，術(shù)語“片段”、“抗體片段”、“抗原結(jié)合片段”或“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”可互換使用，是指本發(fā)明抗體的任何具有抗體的抗原結(jié)合功能的片段。示例性抗原結(jié)合片段包括fab、fab'、f(ab')2和fv，但不限于此。

33、fab具有一個抗原結(jié)合位點，其結(jié)構(gòu)具有輕鏈和重鏈的可變區(qū)、輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(ch1結(jié)構(gòu)域)。fab'與fab的不同之處在于它在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的c末端具有包括一個或多個半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)。當fab’的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵時產(chǎn)生f(ab')2抗體。fv是僅具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的最小抗體片段，并且用于產(chǎn)生fv片段的重組技術(shù)公開于pct國際專利公布wo?88/10649、wo?88/106630、wo?88/07085、wo88/07086和wo?88/09344等中。雙鏈fv具有通過非共價鍵連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并且單鏈fv通常具有經(jīng)由肽接頭通過共價鍵連接或直接連接在c末端的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，使得可形成類似雙鏈fv的二聚體結(jié)構(gòu)。這些抗體片段可使用蛋白酶獲得(例如，可通過用木瓜蛋白酶限制性消化整個抗體來獲得fab，并且可通過用胃蛋白酶消化來獲得f(ab')2片段)，并且可優(yōu)選地通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生。

34、雙抗體是由兩個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和兩個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域組成的小的二價抗體，每個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過短接頭與重鏈可變結(jié)構(gòu)域連接。當輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過短得多的接頭與重鏈可變結(jié)構(gòu)域連接時，可形成三抗體或四抗體。

35、此外，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段不僅可包括本文所述的抗hla-g抗體的序列，而且還可包括其生物學等同物(在能夠表現(xiàn)出對hla-g的結(jié)合能力的范圍內(nèi))。例如，可對抗體的氨基酸序列進行進一步改變以進一步改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學特性。此類修飾包括例如抗體的氨基酸序列殘基的缺失、插入和/或取代。此類氨基酸突變是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性進行的，諸如疏水性、親水性、電荷、大小等。通過分析氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類型，可以看出，精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸具有相似的大小；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形狀。因此，基于這一點，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可被視為生物功能等同物。

36、本發(fā)明的另一方面是一種編碼抗體或其抗原結(jié)合片段的分離的核酸?？贵w及其抗原結(jié)合片段如上所述。

37、如本文所用，術(shù)語“核酸”具有綜合含義，包括dna(基因組dna(gdna)和互補dna(cdna))和rna分子，以及作為核酸分子的基本單位的核苷酸，不僅包括天然核苷酸，而且還包括其中糖或堿基部分被修飾的類似物(scheit,nucleotide?analogs,john?wiley,newyork(1980)；uhlman和peyman,chemical?reviews(1990)90:543-584)。本發(fā)明的編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸分子的序列可被修飾，并且修飾包括核苷酸的添加、缺失，或者非保守或保守取代。

38、在本發(fā)明中，分離的核酸可包含以下序列：

39、(a)seq?id?no:37的核苷酸序列或與seq?id?no:37的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq?id?no:38的核苷酸序列或與seq?id?no:38的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列；

40、(b)seq?id?no:39的核苷酸序列或與seq?id?no:39的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq?id?no:40的核苷酸序列或與seq?id?no:40的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列；

41、(c)seq?id?no:41的核苷酸序列或與seq?id?no:41的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq?id?no:42的核苷酸序列或與seq?id?no:42的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列；或

42、(d)seq?id?no:43的核苷酸序列或與seq?id?no:43的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq?id?no:44的核苷酸序列或與seq?id?no:44的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列。

43、更具體地，在本發(fā)明的一個實施方式中，分離的核酸可包含以下序列：

44、(a)seq?id?no:37的核苷酸序列和seq?id?no:38的核苷酸序列；

45、(b)seq?id?no:39的核苷酸序列和seq?id?no:40的核苷酸序列；

46、(c)seq?id?no:41的核苷酸序列和seq?id?no:42的核苷酸序列；或

47、(d)seq?id?no:43的核苷酸序列和seq?id?no:44的核苷酸序列。

48、本發(fā)明的仍另一方面是一種包含核酸分子的重組載體。

49、如本文所用，術(shù)語“載體”是指用于在宿主細胞中表達靶基因的工具，包括質(zhì)粒載體；粘粒載體；以及病毒載體，諸如噬菌體載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體，并且可優(yōu)選為質(zhì)粒載體，但不限于此。

50、根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明的包含核酸分子的重組載體可包含編碼包含以下cdr或包含包括以下cdr的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的序列的核酸分子：

51、(a)包含seq?id?no:1的氨基酸序列的重鏈cdr1、包含seq?id?no:2的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:3的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

52、包含seq?id?no:5的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:6的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:7的氨基酸序列的輕鏈cdr3；

53、(b)包含seq?id?no:9的氨基酸序列的重鏈cdr1、包含seq?id?no:10的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:11的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

54、包含seq?id?no:13的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:14的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:15的氨基酸序列的輕鏈cdr3；

55、(c)包含seq?id?no:17的氨基酸序列的重鏈cdr1、包含seq?id?no:18的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:19的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

56、包含seq?id?no:21的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:22的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:23的氨基酸序列的輕鏈cdr3；或

57、(d)包含seq?id?no:25的氨基酸序列的重鏈cdr1、包含seq?id?no:26的氨基酸序列的重鏈cdr2，以及包含seq?id?no:27的氨基酸序列的重鏈cdr3；和

58、包含seq?id?no:29的氨基酸序列的輕鏈cdr1、包含seq?id?no:30的氨基酸序列的輕鏈cdr2，以及包含seq?id?no:31的氨基酸序列的輕鏈cdr3。

59、在本發(fā)明的載體中，編碼輕鏈可變區(qū)的核酸分子和編碼重鏈可變區(qū)的核酸分子可以可操作地連接至啟動子。

60、如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”是指核酸表達調(diào)控序列(例如，啟動子、信號序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點陣列)與另一核酸序列之間的功能性連接，由此，調(diào)控序列調(diào)控其他核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

61、本發(fā)明的重組載體系統(tǒng)可通過本領(lǐng)域已知的各種方法構(gòu)建，其具體方法公開于sambrook等人,molecular?cloning,a?laboratory?manual,cold?spring?harborlaboratory?press(2001)，其通過引用并入本文。

62、本發(fā)明的載體通常可構(gòu)建為用于克隆的載體或用于表達的載體。本發(fā)明的重組載體優(yōu)選為表達載體。另外，本發(fā)明的載體可使用原核細胞或真核細胞作為宿主來構(gòu)建。

63、例如，當本發(fā)明的載體為表達載體并且使用原核細胞作為宿主時，載體通常包含能夠推進轉(zhuǎn)錄的強啟動子(例如，tac啟動子、lac啟動子、lacuv5啟動子、lpp啟動子、plλ啟動子、prλ啟動子、rac5啟動子、amp啟動子、reca啟動子、sp6啟動子、trp啟動子、t7啟動子等)、用于起始翻譯的核糖體結(jié)合位點，以及轉(zhuǎn)錄/翻譯終止序列。當使用大腸桿菌(e.coli)(例如，hb101、bl21、dh5α等)作為宿主細胞時，大腸桿菌色氨酸生物合成途徑的啟動子和操縱子區(qū)域(yanofsky,c.,j.bacteriol.,(1984)158:1018-1024)和噬菌體λ的左側(cè)啟動子(leftward?promoter)(plλ啟動子，herskowitz,i.和hagen,d.,ann.rev.genet.,(1980)14:399-445)可用作調(diào)控區(qū)域。當使用芽孢桿菌屬(bacillus)細菌作為宿主細胞時，蘇云金芽孢桿菌(bacillus?thuringiensis)的毒素蛋白基因的啟動子(appl.environ.microbiol.(1998)64:3932-3938；mol.gen.genet.(1996)250:734-741)或可在芽孢桿菌屬細菌中表達的任何啟動子可用作調(diào)控區(qū)域。

64、同時，本發(fā)明的重組載體可通過操縱本領(lǐng)域中常用的質(zhì)粒(例如，pcl、psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19等)、噬菌體(例如，λgt4·λb、λ-charon、λδz1和m13等)或病毒(例如，sv40等)來產(chǎn)生。

65、同時，當本發(fā)明的載體是表達載體并且使用真核細胞作為宿主時，可使用源自哺乳動物細胞的基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子、β-肌動蛋白啟動子、人血紅蛋白啟動子和人肌肉肌酸啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5k啟動子、sv40啟動子、巨細胞病毒(cmv)啟動子、hsv?tk啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)啟動子、人免疫缺陷病毒長末端重復(hiv?ltr)啟動子、莫洛尼病毒啟動子、eb病毒(ebv)啟動子和勞斯肉瘤病毒(rsv)啟動子)，并且其通常具有聚腺苷酸化序列作為轉(zhuǎn)錄終止序列。具體地，本發(fā)明的重組載體可包含cmv啟動子。

66、本發(fā)明的重組載體可與另一序列融合以促進由其表達的抗體的純化。融合序列包括例如谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(pharmacia，美國)、麥芽糖結(jié)合蛋白(neb，美國)、flag(ibi，美國)和六聚組氨酸(6x?his；quiagen，美國)。另外，由于通過本發(fā)明的載體表達的蛋白質(zhì)是抗體，因此所表達的抗體可通過蛋白a柱等輕松純化，而不需要附加序列用于純化。

67、同時，本發(fā)明的重組載體可包含本領(lǐng)域常用的抗生素抗性基因作為選擇標志物，并且可包含例如氨芐青霉素、慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、遺傳霉素、新霉素和四環(huán)素的抗性基因。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，抗hla-g表達載體可包含氨芐青霉素抗性基因。

68、本發(fā)明的表達抗體的載體可以是其中輕鏈和重鏈在單一載體中同時表達的載體系統(tǒng)，或者是其中輕鏈和重鏈各自在單獨載體中表達的系統(tǒng)。在后一種情況下，通過共轉(zhuǎn)化和靶向轉(zhuǎn)化將兩種載體引入宿主細胞中。共轉(zhuǎn)化是將編碼輕鏈和重鏈的相應(yīng)載體dna同時引入宿主細胞中，然后選擇表達輕鏈和重鏈兩者的細胞的方法。靶向轉(zhuǎn)化是選擇用包含輕鏈(或重鏈)的載體轉(zhuǎn)化的細胞，并且將所選擇的表達輕鏈的細胞再次用包含重鏈(或輕鏈)的載體轉(zhuǎn)化以最終選擇表達輕鏈和重鏈兩者的細胞的方法。

69、將本發(fā)明的編碼抗體的重鏈和輕鏈的核酸插入編碼人igg1、igg2、igg4的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載體中。輕鏈和重鏈可克隆在相同或不同的表達載體中。編碼免疫球蛋白鏈的dna序列可操作地連接至表達載體中的控制序列，以確保免疫球蛋白多肽的表達。此類控制序列包括信號序列、啟動子、增強子和轉(zhuǎn)錄終止序列。表達載體是宿主染色體dna或附加體的組成部分，并且可在宿主生物體中復制。

70、當抗體的重鏈和輕鏈分別克隆到單獨載體中時，可將編碼重鏈和輕鏈的表達載體共轉(zhuǎn)染到單一宿主細胞中以表達兩條鏈，并且鏈可在體內(nèi)或體外組裝形成完整抗體。

71、或者，可將編碼重鏈的表達載體和編碼輕鏈的表達載體引入不同的宿主細胞中，以分別表達重鏈和輕鏈，然后可在體外純化和組裝所述鏈以形成完整抗體。如本文所述的抗體或其片段可在原核或真核表達系統(tǒng)諸如細菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲和哺乳動物細胞中產(chǎn)生。盡管本發(fā)明的重組抗體不一定需要糖基化或在真核細胞中表達，但通常優(yōu)選在哺乳動物細胞中表達?？捎玫牟溉閯游锼拗骷毎档氖纠侨伺咛ツI細胞系(hek?293細胞)、乳倉鼠腎細胞(bhk細胞)、中國倉鼠卵巢細胞/-或+二氫葉酸還原酶(dhfr)(cho、cho-s、cho-dg44、flp-in?cho細胞)、非洲綠猴腎細胞(vero細胞)以及人肝細胞(hep?g2細胞)。

72、用于這些細胞的表達載體可包含表達控制序列，諸如復制起點、啟動子和增強子，以及必要的加工信息位點，諸如核糖體結(jié)合位點、rna剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等的啟動子。含有用于產(chǎn)生抗體的質(zhì)粒序列的載體可通過眾所周知的方法轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，所述方法可根據(jù)宿主細胞的類型而變化。

73、本發(fā)明的又另一方面是一種包含重組載體的宿主細胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細胞是用重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。

74、能夠穩(wěn)定且連續(xù)地克隆和表達本發(fā)明的載體的宿主細胞可以是本領(lǐng)域已知的任何宿主細胞并且可包括，例如，原核宿主細胞諸如大腸桿菌(escherichia?coli)、芽孢桿菌屬諸如枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)和蘇云金芽孢桿菌、鏈霉菌屬(streptomyces)、假單胞菌屬(pseudomonas)(例如，惡臭假單胞菌(pseudomonas?putida))、奇異變形桿菌(proteus?mirabilis)或葡萄球菌屬(staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(staphylococcus?carnosus))的菌株，但不限于此。

75、用載體轉(zhuǎn)化的合適的真核宿主細胞可以是真菌諸如曲霉屬(aspergillus)物種、酵母諸如巴斯德畢赤酵母(pichia?pastoris)、釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)和粗糙脈孢菌(neurospora?crassa)、其他低等真核細胞、高等真核細胞諸如昆蟲來源的細胞，以及源自植物或哺乳動物的細胞，但不限于此。

76、具體地，宿主細胞可以是猴腎細胞7(cos7)、ns0細胞、sp2/0、cho細胞、w138、bhk細胞、mardin?darby狗腎(mdck)細胞、骨髓瘤細胞系、hut?78細胞或293細胞。

77、哺乳動物宿主細胞培養(yǎng)物優(yōu)選用于表達和產(chǎn)生抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段，因為本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)了多種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適的宿主細胞系。

78、在本發(fā)明中，“轉(zhuǎn)化”和/或“轉(zhuǎn)染”到宿主細胞中包括用于將核酸引入生物體、細胞、組織或器官中的任何方法，并且可通過選擇適用于如本領(lǐng)域已知的宿主細胞的標準技術(shù)來進行。此類方法包括電穿孔、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣(capo4)沉淀、氯化鈣(cacl2)沉淀、使用碳化硅纖維攪拌、農(nóng)桿菌(agrobacterium)介導的轉(zhuǎn)化、聚乙二醇(peg)、硫酸葡聚糖、脂質(zhì)體(lipofectamine)和干燥/抑制介導的轉(zhuǎn)化方法，但不限于此。

79、本發(fā)明的又另一方面是一種用于產(chǎn)生抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化宿主細胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于產(chǎn)生抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段的方法還可包括在培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化宿主細胞中表達抗hla-g抗體或其抗原結(jié)合片段。

80、在用于產(chǎn)生抗體或其抗原結(jié)合片段的方法中，轉(zhuǎn)化宿主細胞的培養(yǎng)可根據(jù)本領(lǐng)域已知的適當?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所選菌株容易地調(diào)整和使用這樣的培養(yǎng)過程。各種這些培養(yǎng)方法公開于各種文獻中(例如，james?m.lee,biochemicalengineering,prentice-hall?international?editions,138-176)。細胞培養(yǎng)根據(jù)細胞生長方法分為懸浮培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)法，并且根據(jù)培養(yǎng)方法分為分批培養(yǎng)法、補料分批培養(yǎng)法和連續(xù)培養(yǎng)法。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基需要適當?shù)貪M足特定菌株的需求。

81、在動物細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基含有各種碳源、氮源和微量元素成分?？墒褂玫奶荚吹氖纠ㄌ妓衔镏T如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素，脂肪諸如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸諸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇諸如甘油和乙醇，以及有機酸諸如乙酸，并且這些碳源可單獨或組合使用。

82、可用于本發(fā)明的氮源包括有機氮源諸如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿(csl)和豆粕，以及無機氮源諸如脲、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨，并且這些氮源可單獨或組合使用。培養(yǎng)基可含有磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和對應(yīng)的含鈉鹽作為磷源。另外，培養(yǎng)基可含有金屬鹽，諸如硫酸鎂或硫酸鐵。另外，還可含有氨基酸、維生素以及適當?shù)那绑w。

83、在培養(yǎng)過程中，可以適當?shù)姆绞綄⒅T如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸等化合物添加到培養(yǎng)物中以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的ph。另外，在培養(yǎng)過程中，可使用消泡劑諸如脂肪酸聚二醇酯來抑制氣泡形成。此外，為了維持培養(yǎng)物的需氧條件，將氧氣或含氧氣體(例如，空氣)注入培養(yǎng)物中。培養(yǎng)物的溫度通?？蔀?0℃至45℃，優(yōu)選25℃至40℃，但不限于此。

84、通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細胞獲得的抗體可以未純化狀態(tài)使用，并且可使用各種常規(guī)方法諸如滲析、鹽沉淀和色譜將其進一步純化至高純度。其中，使用色譜的方法最常用，并且柱的類型和順序可根據(jù)抗體的特征、培養(yǎng)方法等選自離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜。

85、根據(jù)本發(fā)明的抗hla-g抗體是使用hla-g的多聚體結(jié)構(gòu)作為抗原產(chǎn)生的，并且其特征在于其能夠結(jié)合hla-g單體和多聚體。由于已知hla-g抑制免疫細胞的激活并在癌細胞中過表達，本發(fā)明人確認了抗hla-g抗體的抗癌能力。

86、因此，確認了抗hla-g抗體抑制hla-g與cd8a的結(jié)合(表4)。此外，還確認，當將外周血單核細胞(pbmc，效應(yīng)細胞)和用抗hla-g抗體處理的靶細胞與癌細胞混合并共培養(yǎng)時，癌細胞被殺死(圖3)并且在腫瘤誘導的小鼠中腫瘤生長受到抑制(表6)。

87、因此，本發(fā)明的又另一方面提供了一種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段作為活性成分。

88、在本發(fā)明中，藥物組合物可用于治療過表達hla-g的癌癥，但不限于此。癌癥可選自由以下組成的組：胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、口腔癌、甲狀腺癌、前列腺癌、腎癌、膽囊癌、膽管癌、血癌、黑色素瘤等。

89、血癌可以是急性髓細胞性白血病(aml)、急性成淋巴細胞性白血病(all)、慢性髓性白血病(cml)、多發(fā)性骨髓瘤(mm)或淋巴瘤。

90、如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”是指通過施用本發(fā)明的組合物來抑制或延遲疾病進展的任何行為，并且“治療”是指抑制、減輕或消除疾病的發(fā)展。

91、本發(fā)明的藥物組合物還可包含藥學上可接受的載劑，藥學上可接受的載劑是制劑制備中常用的載劑并且包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油，但不限于此。除了以上成分之外，本發(fā)明的用于預(yù)防或治療癌癥的組合物還可包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。合適的藥學上可接受的載劑和制劑詳細描述于文獻[remington'spharmaceutical?sciences(第19版,1995)]中。

92、本發(fā)明的藥物組合物可口服或腸胃外施用，并且在腸胃外施用的情況下，可通過靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、肺內(nèi)施用和直腸內(nèi)施用等來施用。在口服施用的情況下，由于蛋白質(zhì)或肽被消化，口服組合物可配制成包覆活性劑或保護其免于在胃中分解，并且本發(fā)明的組合物可通過允許活性物質(zhì)移動至靶細胞的任何裝置來施用。

93、本發(fā)明的藥物組合物的合適劑量取決于諸如配制方法、施用方法、患者的年齡、體重、性別和病理狀況、食物、施用時間、施用途徑、排泄速率和反應(yīng)敏感性等因素而變化，并且普通技術(shù)的醫(yī)生可容易地確定對期望的治療或預(yù)防有效的劑量并開出處方。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明的藥物組合物的日劑量可為0.1mg/kg至100mg/kg，優(yōu)選0.1mg/kg至10mg/kg，并且更優(yōu)選0.1mg/kg至2mg/kg。如本文所用，術(shù)語“藥學有效量”是指足以治療、預(yù)防和診斷疾病的量。

94、本發(fā)明的藥物組合物可以單位劑量形式制備，或者可通過將其放入多劑量容器中，通過使用藥學上可接受的載劑和/或賦形劑根據(jù)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易實施的方法配制來制備。此時，制劑可以是在油或含水介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳液的形式，或者它可以是提取物、粉末、顆粒、片劑或膠囊的形式，并且還可含有分散劑和/或穩(wěn)定劑。

95、本發(fā)明的組合物可作為單獨的治療劑施用或與其他治療劑組合施用，并且可與常規(guī)治療劑順序或同時施用。

96、本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可通過將其以抗體-治療劑(功能性分子)和雙特異性抗體-治療劑(功能性分子)綴合物的形式施用于活體來用于治療癌癥。在例如文獻[trouet等人,plenum?press,new?york?and?london,(1982)19-30]中已經(jīng)報道了適合且優(yōu)選用于將藥物靶向特定靶位點的各種條件。

97、本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可進一步與功能性分子組合或共同施用，以用于預(yù)防、治療和診斷與hla-g過表達相關(guān)的疾病。功能性分子可包括化學物質(zhì)、放射性核素、免疫治療劑、細胞因子、趨化因子、毒素、生物制劑和酶抑制劑。

98、本發(fā)明的又另一方面提供了一種診斷、預(yù)防或治療與hla-g過表達相關(guān)的疾病(例如癌癥)的方法，所述方法包括以藥學有效量向受試者，例如人或非人哺乳動物施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段、藥物組合物。本發(fā)明還提供了一種診斷與hla-g過表達相關(guān)的疾病(例如癌癥)的方法，所述方法包括向有需要的受試者，例如人或非人哺乳動物施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段。

99、如本文所用，術(shù)語“受試者”是指已經(jīng)發(fā)展或可能發(fā)展與hla-g過表達相關(guān)的疾病的任何動物，包括人、猴、牛、馬、羊、豬、雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔子或豚鼠。

100、同時，本發(fā)明人確認了抗體和hla-g的結(jié)合位點，并且因此，確認了在用于抗體篩選的抗原的氨基酸序列(seq?id?no:33)中，氨基酸339至344(dyeatl)、氨基酸390至402(vvvpsgeeqrytc)和氨基酸323至338(qradppkthvthhpvf)是表位。

101、因此，本發(fā)明的又另一方面提供了一種hla-g表位，其由選自由seq?id?no:34至36組成的組的序列組成。

102、如本文所用，術(shù)語“表位”是指抗體或其片段可特異性地結(jié)合的抗原局部位點。表位通常由分子的表面基團，諸如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征和特定的電荷特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性溶劑的存在下喪失與構(gòu)象表位的結(jié)合，而不喪失與非構(gòu)象表位的結(jié)合。表位可包括直接參與結(jié)合的氨基酸殘基(也稱為表位的免疫顯性組分)和不直接參與結(jié)合的其他氨基酸殘基，諸如被特異性抗原結(jié)合肽有效阻斷的氨基酸殘基(即，氨基酸殘基存在于特異性抗原結(jié)合肽的足跡內(nèi))。

103、本發(fā)明還提供了一種與hla-g表位特異性結(jié)合的抗體，并且抗體的具體示例與上述相同，但不限于此。

104、有益效果

105、根據(jù)本發(fā)明的抗hla-g抗體可以結(jié)合hla-g的單體和多聚體，并且因此可以有效阻斷hla-g與其受體的結(jié)合。