本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是涉及一種檢測三尖盤頭線蟲的taqman探針qpcr試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、三尖盤頭線蟲(ollulanus?tricuspis)屬于線蟲門、胞管腎綱、圓線蟲目、莫林線蟲科中的一種蠕蟲。三尖盤頭線蟲1865年首次在德國被發(fā)現(xiàn)，目前在歐洲、美洲、澳大利亞和中東呈廣泛性分布，國內(nèi)也有流行，但尚未見確切的文獻數(shù)據(jù)報道。三尖盤頭線蟲主要感染貓科動物，最常見于家貓或流浪貓，偶爾發(fā)生在流浪犬、豬和狐貍中。三尖盤頭線蟲的成蟲體積非常小，雄性只有0.7-0.8mm長，雌性只有0.8-1mm長，成蟲可通過其頭部的螺旋線圈和雌蟲后端的三尖瓣在顯微鏡下進行鑒別。

2、三尖盤頭線蟲多寄生于胃，可鉆入胃粘膜。幼蟲在雌蟲子宮內(nèi)發(fā)育為三期幼蟲，4-5周內(nèi)可在胃中發(fā)育為成蟲，一經(jīng)釋放，即具感染性，形成自身感染，可通過患病動物的嘔吐物進行傳播。dennis?2006年的研究指出，三尖盤頭線蟲對貓的致病潛力一直存在爭議，一些研究員認(rèn)為多數(shù)患病貓無臨床癥狀表現(xiàn)，偶爾表現(xiàn)為嘔吐、厭食、消瘦或卡他性胃炎，對臨床病例的影響不大，但也有證據(jù)表明其能引起嚴(yán)重胃病。值得注意的是，三尖盤頭線蟲引起的慢性感染和炎癥可能會導(dǎo)致或加劇胃腺癌的發(fā)展，尤其是在有其他環(huán)境和遺傳因素的情況下。

3、三尖盤頭線蟲的診斷常需要內(nèi)窺鏡檢及胃黏膜活檢相配合，因為三尖盤頭線蟲可引起不可見的黏膜病變。治療多使用抗寄生蟲藥，如苯咪唑，但可復(fù)發(fā)，因此需持續(xù)監(jiān)測并重復(fù)治療。對三尖盤頭線蟲的臨床重要性還需要進一步研究，尤其是關(guān)于其在慢性胃炎中的作用及其與胃腫瘤的潛在聯(lián)系。

4、collet在2000年的研究指出，糞便漂浮法或沉淀法通常無法有效檢測三尖盤頭線蟲，因為成蟲在腸道中因高ph值被消化，隨糞便外排前通常已死亡?；谏鲜銮闆r，糞便中難以檢測到蟲體或蟲卵。目前，baermann法是一種通過濾網(wǎng)過濾樣本，獲得蟲體的診斷方法，該方法常用于線蟲診斷，是目前三尖盤頭線蟲診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其靈敏度常低于90％，且需大量蟲體才能有效確認(rèn)。cecchi?2006年在對嘔吐和體重減輕的貓進行內(nèi)窺鏡檢查時收集了活檢樣本，用組織病理學(xué)方法，通過he(haemotoxylin?and?eosin)染色鑒定出三尖盤頭線蟲。但作者指出，he染色有時會因人為的細胞碎片而難以識別樣本中的蟲體。

5、一些研究(包括cecchi，2006、dennis，2006、collett，2000和simpson，2006)稱，在犬/貓的胃中零星地檢測到各種線蟲，包括三尖盤頭線蟲、狼尾旋線蟲(spirocerca?lupi)、泡翼線蟲屬(physaloptera?spp.)和aonchotheca?putorii。上述寄生蟲常伴有肉芽腫病變，而在三尖盤頭線蟲引起的感染中尚未發(fā)現(xiàn)此類病變。2020年nagamori等人對貓群流行病學(xué)調(diào)查顯示，對2586份糞便樣本進行糞便漂浮或沉淀、抹片鏡檢、baermann法等檢測，結(jié)果顯示約24.5％的貓有寄生蟲感染，其中混合感染2種及以上的占5.7％，三尖盤頭線蟲感染率約0.12％(3/2586)。2015年takeuchi-storm等人另一項報告對99只貓樣本進行尸檢，超過90％的貓鑒定有寄生蟲感染，其中三尖盤頭線蟲的感染率達13.1％，此外線蟲、吸蟲和絳蟲均有感染。

6、蠕蟲類寄生蟲各發(fā)育階段結(jié)構(gòu)類似，尤其在同科或相關(guān)屬中，用糞便漂浮法結(jié)合顯微鏡檢查常難以區(qū)分，如泡翼線蟲屬與三尖盤頭線蟲形態(tài)類似，通常泡翼線蟲屬體型稍大，但低倍鏡下與三尖盤頭線蟲大致相同，可能會導(dǎo)致混淆。此外狼尾旋線蟲常寄生于食道，體型較大，但在早期檢查時，與泡翼線蟲屬較為相似。三尖盤頭線蟲與上述蠕蟲均可引起胃腸道疾病，鏡檢時需根據(jù)其形態(tài)特征(如大小、形狀及解剖結(jié)構(gòu))仔細區(qū)分。正確鑒別不同蟲體對診斷人員的獸醫(yī)寄生蟲學(xué)經(jīng)驗背景和技術(shù)有較高要求，且步驟較多，不易量化。

7、目前，對三尖盤頭線蟲的診斷尚未開發(fā)出分子生物學(xué)的診斷方法，仍處于基于寄生蟲形體特性診斷的病原學(xué)檢測，無法克服其低敏感性和特異性的劣勢，耗時且難以與其他易混合感染的線蟲等鑒別區(qū)分?；谏鲜鰡栴}，本技術(shù)提出了基于三尖盤頭線蟲的28srrna基因序列設(shè)計引物的taqman探針qpcr方法來特異性檢測這種犬和/或貓中的常見線蟲。28s?rrna是一種真核生物核糖體基因，在基因組中具有多拷貝，可以提高qpcr檢測的靈敏度。28s?rrna基因序列中包含易于引物結(jié)合的保守區(qū)和種屬特異的可變區(qū)，可保證檢測的特異性。28s?rrna在線蟲的分類和遺傳檢測中已被廣泛使用，是分子檢測中可靠、有效的靶基因。本方法具有快速、靈敏、特異、經(jīng)濟的優(yōu)點，簡化了臨床鏡檢的步驟，節(jié)省了臨床檢測的人力和時間，可以實現(xiàn)對三尖盤頭線蟲的高通量的早期檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測三尖盤頭線蟲的taqman探針qpcr試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，本發(fā)明的檢測方法具有敏感性高、特異性強、重復(fù)性好，檢測限低的特點，可用于對犬和/或貓中病原體，尤其是線蟲的檢測。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：一種檢測三尖盤頭線蟲的taqman探針qpcr試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測三尖盤頭線蟲的正向引物、反向引物和taqman探針，其中，所述正向引物的序列如seq?id?no.1所示，反向引物的序列如seq?idno.2所示，taqman探針的序列如seq?id?no.3所示。

3、優(yōu)選地，所述試劑盒包括陽性對照，所述陽性對照為重組質(zhì)粒。

4、優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒的序列如seq?id?no.4所示。

5、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括premix?ex?taq和ddh2o。

6、本發(fā)明公開了一種檢測三尖盤頭線蟲的qpcr反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括0.2μl濃度為10μm的正向引物、0.2μl濃度為10μm的反向引物、0.2μl濃度為20μm的taqman探針、5μl?dna模板、10μl上述的premix?ex?taq以及4.4μl上述ddh2o；其中，所述正向引物的序列如seq?id?no.1所示，反向引物的序列如seq?id?no.2所示，taqman探針的序列如seq?id?no.3所示。

7、本發(fā)明還公開了上述試劑盒的檢測方法，具體步驟如下：

8、s1：采集并提取樣品的dna；

9、s2：配制權(quán)利要求5所述的qpcr反應(yīng)體系，作為待測樣本；

10、s3：進行熒光定量pcr反應(yīng)。

11、優(yōu)選地，所述s3中pcr反應(yīng)包括95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；60℃退火延伸31s；進行40個循環(huán)。

12、本發(fā)明還公開了上述試劑盒在檢測犬和/或貓中病原體的應(yīng)用。

13、本發(fā)明的有益效果是：

14、(1)本發(fā)明方法簡單、操作方便快捷、引物設(shè)計的局限性小，數(shù)據(jù)分析更加簡單直觀，并且整個實驗過程可在2h內(nèi)完成；

15、(2)本發(fā)明的方法敏感性高、特異性強、重復(fù)性好，檢測限低至55.8拷貝/反應(yīng)，且探針法只與目的序列結(jié)合，顯著提高了敏感性和特異性；實時監(jiān)控?zé)晒鈹?shù)據(jù)，避免了瓊脂糖凝膠電泳和污染，確保了實驗結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。