本發(fā)明涉及酶工程和基因工程，特別涉及一種耐高溫堿性α-半乳糖苷酶突變體及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、α-半乳糖苷酶即蜜二糖酶(1,6-α-d-galactoside?galactohydrolase；ec3.2.1.22)，是水解α-半乳糖苷鍵的一種外切糖苷酶，能專(zhuān)一性催化多糖、糖脂、糖蛋白中糖鏈末端的α-1,6半乳糖苷鍵水解，不僅能水解棉籽糖和水蘇糖等低聚糖，還能水解含α-半乳糖苷的雜多糖，從而在糖類(lèi)代謝中起到重要作用，幫助分解復(fù)雜的多糖為可吸收的單糖。其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)包含特定的催化活性位點(diǎn)，使其能夠高效地識(shí)別和催化底物。α-半乳糖苷酶的應(yīng)用范圍非常廣泛，尤其在食品工業(yè)中，它能有效分解豆類(lèi)和其他富含半乳糖苷的食物，幫助減少消化不良和脹氣；在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，α-半乳糖苷酶被用于治療遺傳性疾病，如高半乳糖血癥，針對(duì)這種疾病的替代療法，已開(kāi)發(fā)出基于α-半乳糖苷酶的藥物，幫助患者更好地代謝半乳糖；此外，該酶在生物燃料生產(chǎn)中也起到關(guān)鍵作用，通過(guò)轉(zhuǎn)化植物原料中的復(fù)雜糖為可發(fā)酵糖，提高生物燃料的產(chǎn)量。

2、目前，α-半乳糖苷酶的商品化已經(jīng)形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈，包括從微生物發(fā)酵到酶制劑的生產(chǎn)，再到市場(chǎng)推廣和應(yīng)用，涵蓋了食品添加劑、醫(yī)藥產(chǎn)品及生物技術(shù)領(lǐng)域的多種應(yīng)用。這些商品化的產(chǎn)品，不僅推動(dòng)了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也為消費(fèi)者提供了更多健康選擇。隨著對(duì)其功能和應(yīng)用的深入研究，未來(lái)α-半乳糖苷酶的市場(chǎng)潛力將更加巨大。

3、α-半乳糖苷酶廣泛存在于多種微生物中，其主要來(lái)源包括細(xì)菌(巴氏桿菌和大腸桿菌)、真菌(曲霉屬)和酵母，α-半乳糖苷酶的耐高溫和耐堿性特性在不同來(lái)源的微生物中有所不同。通常來(lái)源于嗜熱菌的α-半乳糖苷酶在50℃至75℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的活性，部分酶能夠在ph?6至8的中性至弱堿性環(huán)境中保持最佳活性，但是在ph?9或更高的條件下酶活性降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的第一目的是提供一種同時(shí)耐高溫耐高堿性的α-半乳糖苷酶突變體；本發(fā)明的第二目的為提供所述α-半乳糖苷酶突變體的制備方法。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明所述的耐高溫堿性α-半乳糖苷酶突變體，所述突變體對(duì)來(lái)源于嗜維生素?zé)o氧芽孢桿菌的α-半乳糖苷酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，將seq?id?no.1所示氨基酸序列第444位、第457位、第509位這三個(gè)位點(diǎn)中至少有一個(gè)氨基酸進(jìn)行置換；第444位天冬酰胺asn突變?yōu)楸奖彼醦he，第457位天冬氨酸asp突變?yōu)榧琢虬彼醡et，第509位精氨酸arg突變?yōu)樯彼醫(yī)rp。

3、優(yōu)選的，所述突變體包括所述突變體包括所述突變體包括n444f、d457m、r509w、、d457m/r509w或n444f/d457m/r509w。

4、所述野生型α-半乳糖苷酶來(lái)自嗜維生素?zé)o氧芽孢桿菌(anoxybacillusvitaminiphilus?wmf1)，氨基酸序列為seq?id?no.1，基因序列為：seq?id?no.2。

5、所述突變體n444f，即第444位天冬酰胺asn突變?yōu)楸奖彼醦he。

6、所述突變體d457m，即第457位天冬氨酸asp突變?yōu)榧琢虬彼醡et。

7、所述突變體r509w，即第509位精氨酸arg突變?yōu)樯彼醫(yī)rp。

8、所述突變體d457m/r509w，即第457位天冬氨酸asp突變?yōu)榧琢虬彼醡et，且第509位精氨酸arg突變?yōu)樯彼醫(yī)rp。

9、所述突變體n444f/d457m/r509w，即第444位天冬酰胺asn突變?yōu)楸奖彼醦he，第457位天冬氨酸asp突變?yōu)榧琢虬彼醡et和第509位精氨酸arg突變?yōu)樯彼醫(yī)rp。

10、本發(fā)明所述的核苷酸序列，為編碼上述α-半乳糖苷酶突變體蛋白的基因序列。

11、本發(fā)明所述載體，包含上述的核苷酸序列。所述載體能夠擴(kuò)增或表達(dá)所述核苷酸序列。

12、所述載體包括克隆載體或表達(dá)載體。載體可以為質(zhì)?；虿《镜?/p>

13、本發(fā)明所述重組菌，包含上述的核苷酸序列或者上述的載體。

14、優(yōu)選的，所述宿主菌為e.coli?dh5α。

15、本發(fā)明所述α-半乳糖苷酶突變體的制備方法，包括如下步驟：

16、(1)以α-半乳糖苷酶基因?yàn)槟０?，用點(diǎn)突變引物進(jìn)行pcr反應(yīng)得到α-半乳糖苷酶突變基因；

17、(2)將α-半乳糖苷酶突變基因插入表達(dá)載體，后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞；

18、(3)收集表達(dá)α-半乳糖苷酶突變體的重組細(xì)胞，重懸菌體后破碎細(xì)胞，離心取上清即得含有α-半乳糖苷酶突變體的粗酶液。

19、優(yōu)選地，通過(guò)計(jì)算機(jī)建模，預(yù)測(cè)出原始α-半乳糖苷酶的3d模型，并設(shè)計(jì)相關(guān)突變位點(diǎn)的引物。所述點(diǎn)突變引物如表1：

20、表1點(diǎn)突變引物

21、

22、

23、引物中下劃線(xiàn)標(biāo)記的為突變位點(diǎn)。

24、所述pcr反應(yīng)的體系如表2：

25、表2pcr反應(yīng)體系

26、

27、pcr反應(yīng)的條件如表3：

28、表3pcr反應(yīng)條件

29、

30、優(yōu)選的，步驟(2)中，所述將α-半乳糖苷酶突變基因插入表達(dá)載體使用dna同源重組方法。

31、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：(1)通過(guò)對(duì)嗜維生素?zé)o氧芽孢桿菌(anoxybacillus?vitaminiphilus?wmf1)來(lái)源的α-半乳糖苷酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得α-半乳糖苷酶突變體具有良好的熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性，在ph?11的緩沖液中，95℃高溫處理2h，酶突變體催化α-半乳糖苷鍵水解的能力均有明顯提升，酶突變體的比酶活相比原始酶提高了635％；(2)α-半乳糖苷酶突變體增加了α-半乳糖苷酶在更寬的ph和更高的溫度條件下的可用性，對(duì)提高乳糖加工產(chǎn)業(yè)中的原料利用率和產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本具有顯著效果，滿(mǎn)足了能源、食品和飼料等領(lǐng)域中對(duì)于耐酸性α-半乳糖苷酶的需求，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)特征：

1.一種耐高溫堿性α-半乳糖苷酶突變體，其特征在于，所述突變體對(duì)來(lái)源于嗜維生素?zé)o氧芽孢桿菌的α-半乳糖苷酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，將seq?id?no.1所示氨基酸序列第444位、第457位、第509位這三個(gè)位點(diǎn)中至少有一個(gè)氨基酸進(jìn)行置換；第444位天冬酰胺asn突變?yōu)楸奖彼醦he，第457位天冬氨酸asp突變?yōu)榧琢虬彼醡et，第509位精氨酸arg突變?yōu)樯彼醫(yī)rp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述α-半乳糖苷酶突變體，其特征在于，所述突變體包括n444f、d457m、r509w、d457m/r509w或n444f/d457m/r509w。

3.一種核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列為編碼權(quán)利要求1或2所述α-半乳糖苷酶突變體蛋白的基因序列。

4.一種載體，其特征在于，所述載體包含權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求5所述載體，其特征在于，所述載體包括克隆載體或表達(dá)載體。

6.一種重組菌，其特征在于，所述重組菌包含權(quán)利要求3所述的核苷酸序列或者權(quán)利要求4所述的載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重菌，其特征在于，所述宿主菌為e.coli?dh5α。

8.一種權(quán)利要求1所述α-半乳糖苷酶突變體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述將α-半乳糖苷酶突變基因插入表達(dá)載體使用dna同源重組方法。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述引物為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐高溫堿性α?半乳糖苷酶突變體及其制備方法，所述突變體對(duì)來(lái)源于嗜維生素?zé)o氧芽孢桿菌的α?半乳糖苷酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，將SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列第444位、第457位、第509位這三個(gè)位點(diǎn)中至少有一個(gè)氨基酸進(jìn)行置換；第444位天冬酰胺Asn突變?yōu)楸奖彼酨he，第457位天冬氨酸Asp突變?yōu)榧琢虬彼酠et，第509位精氨酸Arg突變?yōu)樯彼酺rp。本發(fā)明通過(guò)對(duì)嗜維生素?zé)o氧芽孢桿菌(Anoxybacillus?vitaminiphilus?WMF1)來(lái)源的α?半乳糖苷酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得α?半乳糖苷酶突變體具有良好的熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性。

技術(shù)研發(fā)人員：任鑫坤,程冰潔,余克洋,屈展,吳怡菲,李志恒,王天奇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5