專利名稱:植物種子轉(zhuǎn)化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
外源DNA進(jìn)入植物基因組，目前主要有愈傷組織的農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍法等技術(shù)。但是，受再生體系難、遺傳背景差異導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低下等因素，它們?nèi)匀惶幵诓粩嗟耐晟浦小Ｎ锢硎侄蔚氖褂?如超聲波、負(fù)壓法、脈沖電泳、重離子輻照和γ射線輻照等)也同樣存在使用材料有限、轉(zhuǎn)化率低等主要問題。其中與本發(fā)明相近的γ射線輻照，因為輻照材料為愈傷組織，要考慮到再生體系、輻照時期和污染等問題，實際操作受到了很大限制。因此面對許多類型植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)，還需要進(jìn)一步的不斷改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容 本發(fā)明專利的主要內(nèi)容與技術(shù)特征是將在γ射線輻照后的植物種子(劑量為0.01-10Gy，劑量率為0.1-2Gy/h)，轉(zhuǎn)入攜帶目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌或外源DNA(表達(dá)質(zhì)粒)中浸泡5-300min，然后，在選擇性基質(zhì)中萌發(fā)；鑒定、篩選GUS基因瞬間表達(dá)的幼苗；利用陽性幼苗可以用作兩種后續(xù)的處理一是作為外植體，在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因再生植株；二是將陽性幼苗直接移栽盆內(nèi)或田間，但其后，要每各3-5天，在各株的所有莖尖處點(diǎn)滴50-200μl的相關(guān)抗生素(濃度為50-250mg/l)，直至花芽的形成；收獲種子進(jìn)行外源基因鑒定，陽性材料進(jìn)入下一代種植。
主要用途
本發(fā)明在多種植物，特別是在再生體系較難(如單子葉植物)、愈傷組織-農(nóng)桿菌介導(dǎo)效果差(如十字花科的部分物種等)和轉(zhuǎn)化效率低下等物種的轉(zhuǎn)化上將發(fā)揮重要的作用，大大提高轉(zhuǎn)化效率。本項發(fā)明在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)及其應(yīng)用基礎(chǔ)、植物基因組研究等方面有較大的應(yīng)用價值。

具體實施方式 實例1
輻照種子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)gus基因的瞬間表達(dá)
1.1材料和方法
1.1.1材料
物種取飽滿、完好的白菜、小麥、南瓜、芹菜、香菜、玉米、粳稻、秈稻、黑麥、菠菜、莧菜和豇豆等種子；每種取500粒左右供實驗使用。
農(nóng)桿菌及質(zhì)粒為LBA4404；攜帶的質(zhì)粒為pKUC(浙江大學(xué)舒慶堯教授實驗室)；含抗生素選擇基因為卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；報告基因為GUS基因(含內(nèi)含子序列)；它們的啟動子均為CaMV 35S啟動子。
1.1.2方法
種子輻照用0.01-10Gy劑量(劑量率為0.1-2Gy/h)的γ射線輻照植物種子。
搖菌農(nóng)桿菌在LB液體培養(yǎng)基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃條件下，120rpm搖床培養(yǎng)。指數(shù)增長的中后期，菌液OD550值為0.20-0.85時用做以下實驗。
浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中分別加入輻照處理和未處理的種子，在15-35℃條件下，浸泡5-300min。
萌發(fā)浸泡種子分別點(diǎn)播在含沙土或珍珠巖的盆內(nèi)；期間，噴灑適量的無菌水(含50mg/L卡那霉素)以保濕潤。
gus瞬間表達(dá)鑒定種子萌發(fā)，幼苗長到3cm高以上時(7-25天內(nèi))，剪下植株的少許葉片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm長的小塊轉(zhuǎn)入GUS染色液中；在遮光條件下染色6-24小時，設(shè)置已知未轉(zhuǎn)化材料為陰性對照和轉(zhuǎn)化材料為陽性對照；染色后，用95％乙醇去葉綠素等物質(zhì)，直至透明；出現(xiàn)蘭色為陽性，否則為陰性，由于GUS基因含插內(nèi)含子，因此可以排除由農(nóng)桿菌自身造成的假陽性。染色液成分含0.1M K/NaPO4緩沖液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H2O；0.1％(v/v)Triton X-100；1ml/mg X-Gluc；抽濾滅菌，-20℃保存。
gus基因表達(dá)率的計算。陽性表達(dá)率(％)＝GUS藍(lán)色反應(yīng)株數(shù)/浸泡后萌發(fā)的總株數(shù)。
1.2結(jié)果與分析
由表1可知，各個物種的未輻照或未經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植株幼苗均沒有檢測出GUS反應(yīng)陽性，表明實驗材料存在的內(nèi)源gus基因及其表達(dá)被排除。而經(jīng)過輻照處理的種子，均表現(xiàn)了高低不等的陽性表達(dá)率，有的高達(dá)80％以上，這在發(fā)明者所能查閱的文獻(xiàn)中，還沒有過報道。
表1 輻照種子農(nóng)桿菌介導(dǎo)后幼苗的gus基因瞬間表達(dá)率(％)
1.3結(jié)論
來源不同、遺傳背景各異的植物種子，通過適宜的γ射線處理，在農(nóng)桿菌懸浮液中，可以獲得很高的外源DNA瞬間表達(dá)(如GUS陽性)的轉(zhuǎn)化體。
實例2
輻照種子的外源質(zhì)粒(gus基因)轉(zhuǎn)化表現(xiàn)
2.1材料和方法
2.1.1材料
物種取飽滿、完好的小麥、番茄、白菜和香椿等種子；每種取500粒左右供實驗使用。
農(nóng)桿菌及質(zhì)粒為LBA4404；攜帶的質(zhì)粒為pKUC(來自浙江大學(xué)舒慶堯教授實驗室)；含抗生素選擇基因為卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；報告基因為GUS基因(含內(nèi)含子序列)；它們的啟動子均為CaMV 35S啟動子。
2.1.2方法
種子輻照用0.01-10Gy劑量(劑量率為0.1-2Gy/h)的γ射線輻照植物種子。
搖菌農(nóng)桿菌在LB液體培養(yǎng)基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃條件下，120rpm搖床培養(yǎng)。指數(shù)增長的中后期，菌液OD550值為0.20-0.85時用于質(zhì)粒的提取。
質(zhì)粒的提取堿裂解法裂解農(nóng)桿菌；異丙醇-乙醇粗提質(zhì)粒；PEG沉淀法純化質(zhì)粒；溶于TE緩沖液(pH8.0)，-20℃保存。
浸泡用TE緩沖液將質(zhì)粒稀釋到20-350ng/ml濃度，然后分別加入輻照處理和未處理的種子，在15-35℃條件下，浸泡5-300min。
萌發(fā)浸泡種子分別點(diǎn)播在含珍珠巖的盆內(nèi)；期間，噴灑適量的無菌水(含50mg/l卡那霉素)以保濕潤。
gus瞬間表達(dá)鑒定種子萌發(fā)，幼苗長到3cm高以上時(7-25天內(nèi))，剪下植株的少許葉片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm長的小塊轉(zhuǎn)入GUS染色液中；在遮光條件下染色6-24小時，設(shè)置已知未轉(zhuǎn)化材料為陰性對照和轉(zhuǎn)化材料為陽性對照；染色后，用95％乙醇去葉綠素等物質(zhì)，直至透明；出現(xiàn)蘭色為陽性，否則為陰性，由于GUS基因含內(nèi)含子，農(nóng)桿菌造成的假陽性可以排除。染色液成分含0.1M K/NaPO4緩沖液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H3O；0.1％(v/v)TritonX-100；1ml/mg X-Gluc；抽濾滅菌，-20℃保存。
gus基因表達(dá)率的計算。表達(dá)率(％)＝GUS藍(lán)色反應(yīng)株數(shù)/浸泡后萌發(fā)的總株數(shù)。
2.2結(jié)果與分析
由表2可知，小麥、番茄、白菜和香椿的種子在未輻照或未經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植株幼苗均沒有檢測出GUS反應(yīng)陽性。而經(jīng)過輻照處理的種子，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化下也表現(xiàn)了高低不等的陽性表達(dá)率，最低香椿也高達(dá)30％多。
表2 輻照種子質(zhì)粒介導(dǎo)后幼苗的gus基因瞬間表達(dá)率(％)
2.3結(jié)論
同實例1輻照種子經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的結(jié)果一樣，輻照的種子在質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化下，也可以獲得外源基因(如gus基因)瞬間表達(dá)率較高的轉(zhuǎn)化體。
實例3
瞬間表達(dá)的幼苗盆栽-卡那霉素選擇獲得T0和T1代植株的表現(xiàn)
3.1材料和方法
3.1.1材料
材料來源取實例2的小麥、番茄、白菜和香椿等幼苗，經(jīng)過GUS染色，選取蘭色陽性植株用于移栽。
3.1.2方法
盆內(nèi)移栽陽性植株移栽在含有肥沃沙土的盆內(nèi)。每間隔3-5天，在所有莖尖上滴50-200μl的卡那霉素(濃度為50-250mg/L)，直至花芽的形成。
植株GUS染色的鑒定苗期GUS陽性植株在花期剪取頂部幼莖，一部分用于GUS染色，另一部分用于DNA提取，進(jìn)行PCR鑒定；其株收獲的種子進(jìn)行無菌水發(fā)芽(T1代)，隨機(jī)取一株根尖進(jìn)行GUS染色，統(tǒng)計陽性表達(dá)率(＝再次GUS染色陽性株數(shù)/開始陽性反應(yīng)取樣株數(shù))，染色方法見實例1；陽性材料進(jìn)入下一輪種植。
植株gus基因PCR的鑒定T0代的幼莖部分(見GUS染色)；T1代的材料為測定T1代GUS反應(yīng)的同一植株的幼葉；CTAB法提取植物全基因組DNA；按文獻(xiàn)設(shè)計gus基因引物；含gus基因的質(zhì)粒為陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株為陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增；瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有特異帶為陽性植株。
3.2結(jié)果與分析
由表3可知，從質(zhì)粒介導(dǎo)而來的GUS染色陽性幼苗，移栽到盆內(nèi)，一部分不做任何處理，花期檢測GUS染色反應(yīng)和PCR鑒定，兩者陽性率急劇下降，其中香椿為0；另外一部分，為卡那霉素處理，所有實驗材料仍然維持較高的陽性率，表明保持選擇壓力是必要的。對花期GUS陽性的植株(不論是否經(jīng)過卡那霉素處理)，收獲種子，經(jīng)萌發(fā)，測定幼苗GUS反應(yīng)和進(jìn)行PCR鑒定，兩者陽性率普遍增高。
表3 GUs陽性幼苗盆栽后T0和T1代GUS染色陽性表達(dá)率(％)和PCR陽性率(％)
3.3結(jié)論
輻照種子經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)或質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化，瞬間表達(dá)陽性的植株只有在適當(dāng)?shù)倪x擇壓力下，其后期和后代可以獲得陽性率較高的轉(zhuǎn)化體。
實例4
gus基因瞬間表達(dá)的番茄和白菜幼苗經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得再生植株
4.1材料和方法
4.1.1材料
材料來源取實例2的番茄、白菜和香椿等幼苗，經(jīng)過幼(子)葉局部和莖尖下段GUS染色測定，選取陽性反應(yīng)的幼葉和莖尖余下部分為外質(zhì)體用于組織培養(yǎng)。
4.1.2方法
番茄的組織培養(yǎng)以陽性反應(yīng)的番茄幼葉余下部分為外質(zhì)體(12天內(nèi))，用70％的乙醇洗45s，無菌水清洗3次；再用3％次氯酸鈉浸泡15min，無菌水清洗3-5次；最后用滅菌濾紙吸干其浮水后轉(zhuǎn)入MS+1.0mg/lNAA+0.1mg/l 6-BA+50mg/l卡那霉素培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成愈傷組織；兩周一次繼代培養(yǎng)2-3次，愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+0.2mg/l IAA+2.0mg/l 6-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)幼苗分化；分化幼苗轉(zhuǎn)入MS+1.0mg/l 6-BA+1.0mg/l IAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根；3-5天練苗后，移栽盆內(nèi)。
白菜的組織培養(yǎng)以陽性反應(yīng)的白菜子葉余下部分為外質(zhì)體(7天內(nèi))，用70％的乙醇洗30s，無菌水清洗3次；再用3％次氯酸鈉浸泡10min，無菌水清洗3-5次；最后用滅菌濾紙吸干其浮水后轉(zhuǎn)入MS+0.8mg/lNAA+0.2mg/l 6-BA+50mg/l卡那霉素培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成愈傷組織；兩周一次繼代培養(yǎng)1次，愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+0.2mg/l IAA+1.2mg/l 6-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)幼苗分化；分化幼苗轉(zhuǎn)入MS+0.5mg/l IAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根；3-5天練苗后；移栽盆內(nèi)。
香椿的組織培養(yǎng)以陽性反應(yīng)的香椿莖尖余下部分為外質(zhì)體(20天內(nèi))，用70％的乙醇洗30s，無菌水清洗3次；再用3％次氯酸鈉浸泡15min，無菌水清洗3-5次；最后用滅菌濾紙吸干其浮水后轉(zhuǎn)入MS+0.6mg/l2，4-D+100mg/l卡那霉素培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成愈傷組織；兩周一次繼代培養(yǎng)3-4次后，愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+0.4mg/lIAA+2.0mg/l KT培養(yǎng)基誘導(dǎo)幼苗分化；分化幼苗轉(zhuǎn)入
IAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根；3-5天練苗后，移栽盆內(nèi)。
GUS染色鑒定取再生植株的葉片(每個來源的再生植株只隨機(jī)選取一株測定)；陽性再生植株(T1)收獲的種子進(jìn)行無菌水發(fā)芽，取其根尖(隨機(jī)選取100株)進(jìn)行GUS染色；統(tǒng)計陽性表達(dá)率，染色方法見實例1。
gus基因PCR的鑒定取植株的幼葉，CTAB法提取植物全基因組DNA；按文獻(xiàn)設(shè)計gus基因引物；以含gus基因的質(zhì)粒為陽性對照(質(zhì)粒來源于實例1)，未轉(zhuǎn)化植株為陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增；瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有特異帶為陽性植株；PCR陽性率(％)＝陽性株數(shù)/測定總株數(shù)。每個來源的再生植株只隨機(jī)選取一株測定(同GUS染色測定的材料相對應(yīng))；T1代鑒定材料為GUS染色測定的隨機(jī)選取的100株苗。
4.2結(jié)果與分析
實例3表明瞬間表達(dá)陽性的植株，在無選擇壓力下，隨著它的生長發(fā)育，它很快就會失去外源DNA片段。因此，開展了實例4的研究。由表4可知，經(jīng)過輻照處理的種子，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化下幼苗期表現(xiàn)陽性的植株，取其葉或莖尖為外植體，經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得再生植株，其GUS陽性表達(dá)率和PCR陽性率均超過60％；而隨機(jī)抽取的再生植株后代幼苗，GUS陽性表達(dá)率和PCR陽性率均超過80％。
表4 再生植株和T1代幼苗的GUS染色陽性表達(dá)率(％)與PCR陽性率(％)
4.3結(jié)論
對輻照種子通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化獲得的瞬間表達(dá)陽性的植株，可以通過組織培養(yǎng)的手段獲得更高而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
權(quán)利要求
植物種子轉(zhuǎn)化技術(shù)
本發(fā)明專利的主要技術(shù)特征是將在γ射線輻照后的植物種子(劑量為0.01-10Gy，劑量率為0.1-2Gy/h)，轉(zhuǎn)入攜帶目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌或外源DNA(表達(dá)質(zhì)粒)中浸泡5-300min，然后，在選擇性基質(zhì)中萌發(fā)；鑒定、篩選GUS基因瞬間表達(dá)的幼苗；利用陽性幼苗可以用作兩種后續(xù)的處理一是作為外植體，在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因再生植株；二是將陽性幼苗直接移栽盆內(nèi)或田間，但其后，要每各3-5天，在各株的所有莖尖處點(diǎn)滴50-200μl的相關(guān)抗生素(濃度為50-250mg/l)，直至花芽的形成；收獲種子進(jìn)行外源基因鑒定，陽性材料進(jìn)入下一代種植。
專利摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。外源DNA進(jìn)入植物基因組，目前主要有愈傷組織的農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍法等技術(shù)。但是，受再生體系難、遺傳背景差異導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低下等因素，它們?nèi)匀惶幵诓粩嗟耐晟浦?。物理手段的使?如超聲波、負(fù)壓法、脈沖電泳、重離子輻照和γ射線輻照等)也同樣存在使用材料有限、轉(zhuǎn)化率低等主要問題。其中與本發(fā)明相近的γ射線輻照，因為輻照材料為愈傷組織，要考慮到再生體系、輻照時期和污染等問題，實際操作受到了很大限制。因此面對許多類型植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)，還需要進(jìn)一步的不斷改進(jìn)。本發(fā)明的主要內(nèi)容與技術(shù)特征是將在γ射線輻照后的植物種子(劑量為0.01－10Gy，劑量率為0.1－2Gy/h)，轉(zhuǎn)入攜帶目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌或外源DNA(表達(dá)質(zhì)粒)中懸浮液浸泡5－300min，然后，在選擇性的基質(zhì)中萌發(fā)；鑒定、篩選GUS基因瞬間表達(dá)的幼苗利用陽性幼苗可以用作兩種后續(xù)的處理一是作為外植體，在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因再生植株；二是將陽性幼苗直接移栽盆內(nèi)或田間，但其后，要每各3－5天，在各株的所有莖尖處，點(diǎn)滴50－200μl的相關(guān)抗生素(濃度為50－250mg/l)，直至花芽的形成；收獲種子進(jìn)行外源基因鑒定，陽性材料進(jìn)入下一代種植。
文檔編號A01H4/00GK1995358SQ200610129492
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月22日
發(fā)明者李興林, 舒慶堯, 路福平, 夏英武, 吳殿星, 高年發(fā), 張健, 崔海瑞, 傅俊杰 申請人:天津科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan