lI是限制性核酸內(nèi)切酶，其識別序列和切割位點分別是G丨AATTC、 GITCGAC。pBABE-puro質(zhì)粒帶有EcoRI和SalI的識別切割序列。
[0020] 目前，G6H)相關(guān)功能和機(jī)制的研究多用瞬時轉(zhuǎn)染模型。如MHam等在巨噬細(xì)胞細(xì) 胞系RAW264. 7瞬時過表達(dá)G6H)研究其功能，結(jié)果表明巨噬細(xì)胞中G6H)表達(dá)增加可促進(jìn)肥 胖動物體內(nèi)脂肪組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。J〇〇-WonLee等應(yīng)用包含有G6H)基因的腺 病毒感染大鼠胰島細(xì)胞INS-1，72hr后收集細(xì)胞進(jìn)行各項檢測，其結(jié)果提示G6H)在胰島細(xì) 胞中過表達(dá)可引起胰島0細(xì)胞功能紊亂及細(xì)胞凋亡，這可能是2型糖尿病的發(fā)病的原因之 一。新近研究表明，與癌旁組織或正常組織相比，G6H)在膀胱癌、胃腸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、 前列腺癌等多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)、高活性，這提示G6H)參與了多種腫瘤的發(fā)生 發(fā)展過程，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。
[0021]G6ro與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其機(jī)制研究離不開穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立。有文 獻(xiàn)報道，在NIH3T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pH0Apr-l-G6PD-neo質(zhì)粒，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)人 G6H)基因的NIH3T3-G6H)細(xì)胞。與對照組細(xì)胞相比，NIH3T3-G6H)細(xì)胞的增殖速度和促 進(jìn)腫瘤形成的能力明顯增加。AnaGaldn-Cobo等在大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12中轉(zhuǎn) 染G6H)過表達(dá)質(zhì)粒pCDNA_G6PD，經(jīng) 800ug/mLG418 篩選，Northernblot、Quantitative RT-PCR及ELISA鑒定獲得G6TO穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞，并用于研究G6TO與低氧誘導(dǎo)因子 2a(hypoxia-induciblefactor2a，HIF2a)的關(guān)系。我們先前應(yīng)用pRNAT_U6.2/Lenti 質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝、感染獲得的G6H)敲低的人黑色素瘤穩(wěn)定細(xì)胞株（A375-G6H)A)，這細(xì) 胞呈現(xiàn)凋亡增加、裸鼠移植瘤生長抑制的特征；隨后在A375-G6H)A細(xì)胞中再次導(dǎo)入人正 常G6H)基因，篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株A375-G6H)A-G6PDWT，這細(xì)胞功能得到部分恢復(fù)。
[0022] 本課題組前期研究證實，G6H)在人腎細(xì)胞癌瘤體組織中高表達(dá)，提示G6H)可能參 與了腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。鑒于目前國內(nèi)未見G6H)與腎細(xì)胞癌相關(guān)研究的報道，也缺乏 G6H)過表達(dá)的人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞株及其相關(guān)功能、機(jī)制的研究。本申請將人G6H)基因cDNA 克隆入pBABE-Puro質(zhì)粒，構(gòu)建pBABE-Pur〇-G6ro表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染G6H)表達(dá)水平較低的腎細(xì) 胞癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選獲得了G6H)表達(dá)穩(wěn)定增加40倍以上的G6H)過表達(dá) 型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（ACHN-G6PD)，G6H)酶活性升高了 2. 2倍。這一穩(wěn)定細(xì)胞株的建立，為 探究G6H)與腎細(xì)胞癌的相關(guān)性及其機(jī)制研究提供細(xì)胞模型，也為揭示腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā) 展機(jī)理，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點奠定研究基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0023] 圖1是G6TO基因cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0024] 圖2是pBABE-Pur〇-G6PD重組質(zhì)粒的EcoRI和SalI雙酶切鑒定結(jié)果圖。
[0025] 圖3是G6H)基因的測序及pBABE-G6PD表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 圖4是嘌呤霉素對ACHN-Wildtype細(xì)胞株殺傷曲線的檢測。圖中分別用不同濃 度的嘌呤霉素（〇、〇.〇5、〇.l、〇. 15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45iig/mL)處理細(xì)胞，觀察 存活細(xì)胞數(shù)，以確定嘌呤霉素的篩選濃度。
[0027] 圖5光學(xué)顯微鏡下的ACHN-G6H)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（40X)。
[0028]圖 6 是ACHN-Wildtype和ACHN-G6PD細(xì)胞株的RNA電泳圖。
[0029]圖 7 是ACHN-WiIdtype和ACHN-G6PD細(xì)胞株的G6PD的mRNA檢測圖。
[0030]圖8是ACHN-WiIdtype和ACHN-G6PD細(xì)胞株的G6PD蛋白的Westernblot檢測圖。
[0031] 圖9是圖8中G6H)蛋白Western blot的灰度掃描結(jié)果圖。
[0032] 圖10是ACHN-Wild type和ACHN_G6ro細(xì)胞株的G6H)酶活性測定圖。
【具體實施方式】
[0033] 一、G6PD基因的克隆
[0034]用Primer5. 0 軟件設(shè)計針對人G6PD基因（NM_001042351. 2)cDNA的PCR正向 和反向引物，正向引物5' -GGAAITCATGGCAGAGCAGGTGGCCCTG-3'中引入EcoRI酶切位點 (GIAAITC)，反向引物 5' -ACGCGTCGACTCAGAGCTTGTGGGGGITCAC-3' 中引入SalI酶切位點 (G丨TCGAC)。以本課題組前期構(gòu)建的pMD19-Tsimple-G6PD-WT質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR 擴(kuò)增得到含有G6H)的cDNA的片段，長1548bp。PCR反應(yīng)體系（50iiL)如下：
[0035]
【主權(quán)項】
1. 一種G6H)過表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，其特征在于是一種G6H)過表達(dá)型ACHN穩(wěn) 轉(zhuǎn)細(xì)胞株，是將pBABE-pur〇-G6ro轉(zhuǎn)染人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞株ACHN，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選， Real-time PCR、Western blot驗證，以及反復(fù)傳代、凍存復(fù)蘇所得的G6H)表達(dá)量穩(wěn)定增加 40倍以上的細(xì)胞株。
2. 如權(quán)利要求1所述的G6H)過表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于包括 以下步驟： 一、G6H)基因的克隆 用Primer 5. 0軟件設(shè)計針對人G6PD基因的PCR正向引物5' -GGAAITCATGGCAGAGCAGG TGGCCCTG-3' 和反向引物 5' -ACGCGTCGACTCAGAGCTTGTGGGGGITCAC-3'，分別引入 EcoR I 和 Sal I酶切位點，以pMD19-Tsimple-G6PD-WT質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出G6H)的編碼 序列1548bp，純化PCR產(chǎn)物，獲得G6H)基因的cDNA ; 二、 pBABE-puro-GGH)重組表達(dá)載體的構(gòu)建 上述G6H)基因cDNA的PCR純化產(chǎn)物和pBABE-puro載體分別用EcoR I和Sal I進(jìn)行 酶切，用TaKaRa的T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 a，涂布平板，過夜培養(yǎng)；隨機(jī) 挑取2個單菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切鑒定；對于酶切鑒 定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序及序列的分析比對；擴(kuò)增培養(yǎng)測序正確的陽性克隆，提取其不含內(nèi) 毒素的pBABE-pur〇-G6PD重組質(zhì)粒； 三、 ACHN細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇培養(yǎng)ACHN細(xì)胞至狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染前一天傳代細(xì)胞至6孔板，每孔加入2 X 105細(xì)胞， 次日觀察其匯合度為70%?80%時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染采用1^?〇作(^&1^11 6 2000轉(zhuǎn)染試 劑和Opti-MEM培養(yǎng)基；6孔板每孔的轉(zhuǎn)染量為4 ii g質(zhì)粒稀釋到250 ii L Opti-MEM培養(yǎng)基， 得到A液，取10iiL Lipofectamine 2000溶解于250iiL Opti-MEM培養(yǎng)基，得到B液，室溫 孵育5min后將A液和B液混合，室溫孵育20min后加入棄培養(yǎng)基的細(xì)胞中；孵育6?8hr 后更換為新鮮不含抗生素的完全培養(yǎng)基； 四、 ACHN-G6PD穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選及鑒定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染換液24hr后，更換完全培養(yǎng)基為含0. 25 y g/mL嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基， 壓力篩選一周，中間換一次液；一周后在倒置顯微鏡下觀察，把單獨每一個細(xì)胞群圈出， 用0. 25%胰酶消化畫圈的細(xì)胞群，每一團(tuán)細(xì)胞收集到新的24孔板的一個孔培養(yǎng)；繼續(xù)用 0. 25 y g/mL的嘌呤霉素壓力篩選一周；倒置顯微鏡下觀察，進(jìn)行亞克隆篩選，挑選出正常 生長細(xì)胞群傳代，逐步放大培養(yǎng)；應(yīng)用Real-time PCR、Western blot分別在mRNA和蛋白水 平檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞株G6H)的表達(dá)水平，用紫外分光光度法在340nm檢測G6H)酶活性；將穩(wěn)轉(zhuǎn) 細(xì)胞株反復(fù)傳代、凍存及復(fù)蘇，觀察其G6H)表達(dá)是否穩(wěn)定；ACHN-G6H)細(xì)胞株已在體外傳代 20次以上，其G6H)表達(dá)量穩(wěn)定增加40倍以上，G6H)酶活性增加2. 2倍，表明G6H)過表達(dá) 型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，尤其是采用siRNA干擾技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞研究模型。本發(fā)明所述的G6PD過表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是一種G6PD過表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，是將pBABE-puro-G6PD轉(zhuǎn)染人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞株ACHN，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選，Real-time PCR、Western blot驗證，以及反復(fù)傳代、凍存復(fù)蘇所得的G6PD表達(dá)量穩(wěn)定增加40倍以上的細(xì)胞株。其構(gòu)建方法包括以下步驟：一、G6PD基因的克??；二、pBABE-puro-G6PD重組表達(dá)載體的構(gòu)建；三、ACHN細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染；四、ACHN-G6PD穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選及鑒定。這一穩(wěn)定細(xì)胞株的建立，為探究G6PD與腎細(xì)胞癌的相關(guān)性及其機(jī)制研究提供細(xì)胞模型，也為揭示腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點奠定研究基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-85, C12N15-53, C12N5-10
【公開號】CN104531622
【申請?zhí)枴緾N201410797658
【發(fā)明人】朱月春, 張巧, 王艷玲, 況應(yīng)敏, 狄勇, 李玉倩, 楊惠鑫
【申請人】昆明醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月19日