一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，主要包括以下步驟：a)菌種活化與增殖培養(yǎng)；b)收集菌體；c)預(yù)凍及真空冷凍干燥。本發(fā)明通過將嗜熱鏈球菌菌種接種于含白扁豆多糖等物質(zhì)的增殖抗凍培養(yǎng)基中進行增殖，增殖的菌液經(jīng)離心處理，再加入含薏苡仁和山藥混合多糖提取物等的凍干保護劑，預(yù)凍及真空冷凍干燥處理，得到凍干菌粉，其凍干存活率和菌粉活菌數(shù)高，同時更好地開發(fā)利用了我國“藥食同源”中的藥物資源。
【專利說明】一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于嗜熱鏈球菌制品生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)是發(fā)酵生產(chǎn)乳制品的重要乳酸菌之一，其在發(fā)酵過程中，除進行產(chǎn)酸代謝外，還產(chǎn)生2，3- 丁二酮等酸奶特有的風味物質(zhì)，還能促進保加利亞乳桿菌的生長，同時也是重要的益生菌之一，其具有調(diào)節(jié)人體胃腸道菌群平衡、抗突變、增強免疫力等能力。
[0003]在發(fā)酵劑制備過程中，常用的是真空冷凍干燥法，菌種在真空冷凍干燥后:酶的活性喪失少、凍干燥菌粉復(fù)水性好、脫水徹底、保存期長、儲存運輸和使用都很方便，為直投式發(fā)酵劑提供良好的基礎(chǔ)。但是，在實際的使用時，冷凍干燥過程中水的結(jié)晶、細胞的失水、蛋白失活等情況使得菌體出現(xiàn)死亡或損傷，對于菌種的保存、生產(chǎn)使用非常不利。因此需要對菌粉制備方法進行改進。
[0004]對于嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備的改進方法有很多種，如進行增殖培養(yǎng)、抗凍因子添加、保護劑配方的制備等。如專利CN102952771B公開了一種嗜熱鏈球菌凍干保護劑和制備方法，其凍干保護劑配方如下:脫脂乳粉10-20份、棉籽糖3-10份、大豆低聚糖4-10份、右旋糖酐D401.5-5.0份、三磷酸鈉0.3-0.8份、沒食子酸丙酯0.005-0.02份、蒸餾水100份。專利CN100429980C公開了一種直投式酸奶發(fā)酵劑的生產(chǎn)方法，其培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比):脫脂乳粉0.1-15%、乳清粉0.1-10%、酵母膏0.1-5%、番茄汁1-10%,其余為水；其保護劑配方為(質(zhì)量百分比):谷氨酸鈉0.1-5.0%、乳糖0.1-8.0%、甘油
0.1-5.0%、聚乙烯吡咯烷酮0.1-3.0%, Vc0.1-5% O專利CN101502287B也公開了一種直投式酸奶發(fā)酵劑的制備方法，其所使用的培養(yǎng)基為(質(zhì)量百分比):1-2%葡萄糖、0.5-1%蛋白胨、0.1-10%乳清粉、1-5%酵母膏、0.1-0.5%檸檬酸二銨、0.01-0.2%磷酸氫二鉀、
0.1-0.5%無水乙酸鈉；其所使用的保護劑為:重量百分比1-30%的奶粉及0.1-2%的抗氧化劑(異維生素C或谷氨酸或甘氨酸)。CN103404703A公開了一種穩(wěn)定安全的嗜熱鏈球菌活菌制劑及其制備方法，其培養(yǎng)基配方為:酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、KH2P042g、西紅柿汁 100mL、Tween800.5mL、蒸餾水 900mL。專利 CN102766590B 公開了一種嗜熱鏈球菌增菌培養(yǎng)基及制備方法，其配方如下:葡萄糖0.8-1.2g、酵母膏0.5-1.0g、大豆蛋白胨 0.5-1.0g、番茄汁 8-12mL、低聚木糖 0.2-0.4g、水 88_92mL、KH2PO40.1-0.2g 和吐溫800.01-0.05mL。CN102978150A公開了一種嗜熱鏈球菌復(fù)合抗凍因子，其配方如下(以質(zhì)量份數(shù)計):甜菜堿0.1-0.4份、氯化鈉3-5份、甘露糖0.5-3份和碳酸韓0.1-0.4份。另外有許多研究文獻也公開了嗜熱鏈球菌的菌粉制備方法，如“嗜熱鏈球菌的篩選及其高活性菌粉制備”中研究得到的增殖培養(yǎng)基配方為:酵母粉0.5%、番茄汁7.5%、麥芽汁7.5%、乳清粉7.5% ;保護劑配方為:海藻糖20%、乳糖2.5%、谷氨酸鈉5%、甘油0.5%。
[0005]凍干保護劑的使用極大地提高了菌體在真空冷凍干燥下的存活率和凍干菌粉的穩(wěn)定性，而在培養(yǎng)基中添加一些可以促進細胞產(chǎn)生抗凍效果的分子物質(zhì)也有利于其凍干菌粉的制備。這些物質(zhì)的添加也可改變嗜熱鏈球菌細胞膜脂肪酸組成，甚至誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量的抗凍蛋白，從而有效提高嗜熱鏈球菌菌體的抗冷凍能力，可以達到減少甚至避免菌體凍干損傷、提高活菌存活率和菌粉活菌數(shù)、減少復(fù)合凍干保護劑的添加量、延長凍干嗜熱鏈球菌菌粉常溫保存期的目的。
[0006] 白扁豆、薏苡仁和山藥作為衛(wèi)生部頒布的“藥食同源”藥物，其所含的多糖對人體具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、增強免疫力等作用，此外，這些多糖還可以有效刺激乳酸菌的菌體增殖，也可以作為抗凍因子，并且在凍干保護方面也具有良好效果。目前，使用這一類型多糖在凍干菌粉制備方面的報道和發(fā)明專利極少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種更好地開發(fā)利用我國中藥資源作為凍干保護劑、提高菌體抗凍能力的嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0009]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):將嗜熱鏈球菌菌種接種到M17液體培養(yǎng)基中活化，將已活化的菌種接種于增殖抗凍培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，得到增殖的菌液；
[0010]b)收集菌體:將上述增殖的菌液離心處理，棄去上清液，得到菌泥；
[0011]c)干燥:在所制備的菌泥中按每克菌泥添加0.14-0.2g蔗糖、0.12-0.18g可溶性淀粉、0.002-0.004g Vc,0.5-1.0mL的磷酸緩沖液、0.1-0.3g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻后真空冷凍干燥，即得嗜熱鏈球菌凍干菌粉；
[0012]所述増殖抗凍培養(yǎng)基配方組成為:10-20g葡萄糖、10_25g大豆蛋白胨、5-10g酪蛋白水解物、0.005-0.01Omg谷氨酸、2_4g ΚΗ2Ρ04、0.5-lmL吐溫80、白扁豆多糖0.2-0.5g、蒸餾水 1000mL。
[0013]所述步驟a)中活化是指將嗜熱鏈球菌菌種接種到M17液體培養(yǎng)基中于35_38°C培養(yǎng)22-26h，再按每IOOmL培養(yǎng)基中接種2_5mL菌種的比例，接種于與上述M17液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0014]所述步驟a)中增殖培養(yǎng)的接種比例為每IOOmL增殖抗凍培養(yǎng)基中接種2_5mL已活化的菌種。
[0015]所述步驟a)中增殖培養(yǎng)是于35_38°C下培養(yǎng)16_18h。
[0016]所述培養(yǎng)基均已滅菌，且所述增殖抗凍培養(yǎng)基經(jīng)過118_121°C、15min滅菌處理并
室溫冷卻。
[0017]所述白扁豆多糖的制備步驟包括:
[0018]首先將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至
5.0-6.8 ；
[0019]其次在40-55 °C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量0.5-2%、活力為8000-1000(^/^的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量1-2%、活力為20000-30000U/g的果膠酶，保溫1.5-2.5h后加熱至沸騰，再保溫15-20min ；
[0020]然后抽濾并將濾液濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無水乙醇，靜置10_14h后抽濾，所得濾渣于45-55°C烘干，即得白扁豆粗多糖；[0021]最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加熱至50_70°C的蒸餾水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15_20mL蒸餾水的比例計算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量1-4%的木瓜蛋白酶，酶解0.5-lh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25%體積的Sevag試劑除蛋白20_30min ;2000-4000rpm離心15_20min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0022]所述步驟b)中離心處理為0-4°C、8000-10000rpm離心15_20min。
[0023]所述薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備步驟包括:
[0024]首先將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸餾水中，其中薏苡仁和去皮的山藥按1:1混合，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在80-100°C水浴溫度下提取 1-2h，冷卻至 40-55°C ；
[0025]接著在40_55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量1-2.5%的果膠酶和0.8-1 %的α -淀粉酶，并保溫1.5-2.0h后加熱至沸騰，再保溫10_15min ；
[0026]然后抽濾并將濾液濃 縮，向濃縮液中加入3-4倍體積的95%乙醇，靜置10_14h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖；
[0027]最后用80%乙醇溶液洗滌粗混合多糖，過濾后將所得沉淀于45_55°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
[0028]所述步驟c)中真空冷凍干燥是在凍干機中進行18-24h。
[0029]所述步驟c)中真空冷凍干燥之前在_40°C預(yù)凍6_14h。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中嗜熱鏈球菌菌種是在含白扁豆多糖等物質(zhì)的增殖抗凍培養(yǎng)基中進行增殖的，增殖的菌液經(jīng)離心處理，再加入含薏苡仁和山藥混合多糖提取物等的凍干保護劑，預(yù)凍及真空冷凍干燥處理，得到凍干菌粉，本發(fā)明中采用白扁豆多糖等作為抗凍因子，使嗜熱鏈球菌具有更高的活菌數(shù)和更好的抗凍能力，同時使用薏苡仁和山藥混合多糖提取物等為凍干保護劑，使菌粉有更高的存活率，根據(jù)本發(fā)明制備的嗜熱鏈球菌凍干菌粉可使其凍干存活率最高可達80.19 %，菌粉活菌數(shù)為2.32 X 10ncfu/g ;而以常用的商業(yè)M17培養(yǎng)基培養(yǎng)、使用磷酸緩沖液為凍干保護劑制備的嗜熱鏈球菌菌粉凍干存活率最高僅為22.72%，活菌數(shù)最高僅為8.lX109cfu/g。而上述中藥多糖的保健功效也大大提高了該菌粉的使用價值，本發(fā)明更好地開發(fā)利用了我國“藥食同源”中的藥物資源、開拓乳酸菌保健功能、提高中藥資源和乳酸菌的綜合使用價值。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0032]實施例1
[0033]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0034]將嗜熱鏈球菌菌種接種到已滅菌的M17液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)22_26h，再按體積比(v/v)為3%的比例接種于與上述M17液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，即每IOOmL培養(yǎng)基中接種3mL菌種，并在相同條件下活化至第三代。
[0035]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入3% (v/v)已活化的嗜熱鏈球菌，37°C恒溫培養(yǎng)16h。
[0036]b)收集菌體:
[0037]然后在0°C、1000Orpm下離心15min,棄去上清液,獲得菌泥。[0038]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0039]向每克菌泥加入0.14g鹿糖、0.14g可溶性淀粉、0.002gVc、0.5mL的磷酸緩沖液、
0.1g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于-40°c預(yù)凍8h，然后放入凍干機于-56°c、5Pa下進行真空冷凍干燥24h，即得嗜熱鏈球菌凍干菌粉。
[0040]其凍干存活率可為78.25 % (對照培養(yǎng)基為21.21 % )，菌粉活菌數(shù)達
1.62X 10nCFU/g(對照培養(yǎng)基為 7.2X109CFU/g)。
[0041]其中，嗜熱鏈球菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置包括:準確稱取20g葡萄糖、IOg大豆蛋白胨、5g酪蛋白水解物、0.005mg谷氨酸、3g KH2P04、ImL吐溫80、0.4g白扁豆多糖，并溶解于1000mL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)pH值至6.4-6.6，按照裝量80%盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于118°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫，即得嗜熱鏈球菌增殖抗凍培養(yǎng)基。[0042]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于150份蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH值至5.0-6.8，在45°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量1.5%、活力為8000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量I %、活力為30000U/g的果膠酶，保溫2h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫20min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無水乙醇，在冰箱中靜置IOh后抽濾，所得濾渣于50°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴至550C的蒸餾水中計算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量I %的木瓜蛋白酶，酶解0.6h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15%體積的Sevag試劑除蛋白20min，其中Sevag試劑中氯仿:正丁醇=4:1, 2000rpm離心15min后取上清液,反復(fù)離心處理三次,得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0043]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥混合物粉碎后混合浸泡于150份蒸懼水中，其中薏該仁和去皮的山藥按1:1混合,調(diào)節(jié)pH值至
6.0-7.0，在80°C水浴溫度下提取2h，冷卻至40°C后，在40°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量I %的果膠酶和0.8%的α -淀粉酶，并保溫2.0h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫lOmin，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置IOh后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過濾后將所得沉淀于45°C烘干，即得薏苡仁和山藥粗多糖混合提取物。
[0044]實施例2
[0045]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0046]將嗜熱鏈球菌菌種接種到已滅菌的M17液體培養(yǎng)基中，于35°C培養(yǎng)22_26h，再按4% (v/v)比例接種于與上述M17液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0047]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入4% (v/v)已活化的嗜熱鏈球菌，36°C恒溫培養(yǎng)16h。
[0048]b)收集菌體:
[0049]然后在0°C、9000rpm下離心18min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0050]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0051]向每克菌泥加入0.18g鹿糖、0.17g可溶性淀粉、0.003gVc、0.8mL的磷酸緩沖液、0.2g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于-40°C預(yù)凍10h，然后放入凍干機于-56°C、5Pa下進行真空冷凍干燥20h，即得嗜熱鏈球菌凍干菌粉。
[0052] 其凍干存活率可為77.82 % (對照培養(yǎng)基為22.72 % )，菌粉活菌數(shù)達
1.21 X 10nCFU/g(對照培養(yǎng)基為 8.1 X 109CFU/g)。
[0053]其中，嗜熱鏈球菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置包括:準確稱取18g葡萄糖、24g大豆蛋白胨、8g酪蛋白水解物、0.008mg谷氨酸、2gKH2P04、0.5mL吐溫80、0.3g白扁豆多糖，并溶解于1000mL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)pH值至6.4-6.6，按照裝量80%盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于118°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫。即得嗜熱鏈球菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0054]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于125份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0-6.8，在40°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量I %、活力為9000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量1.5%、活力為20000U/g的果膠酶，保溫2.5h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫18min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無水乙醇，在冰箱中靜置IOh后抽濾，所得濾渣于55°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于15mL、水浴至50°C的蒸餾水中計算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量3%的木瓜蛋白酶，酶解0.5h后得酶解液,酶解液使用多糖溶液18%體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白25min，3000rpm離心20min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0055]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥(1:1混合)粉碎后混合浸泡于200份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在10(TC水浴溫度下提取Ih,冷卻至45°C后，在45°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量2%的果膠酶和1%的α -淀粉酶，并保溫1.5h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫13min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置12h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過濾后將所得沉淀于50°C烘干，即得薏苡仁和山藥粗多糖混合提取物。
[0056]實施例3
[0057]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0058]將嗜熱鏈球菌菌種接種到已滅菌的M17液體培養(yǎng)基中，于38°C培養(yǎng)22_26h，再按2% (v/v)比例接種于與上述M17液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0059]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入5% (v/v)已活化的嗜熱鏈球菌，35°C恒溫培養(yǎng)17h。
[0060]b)收集菌體:
[0061]然后在4°C、1000Orpm下離心15min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0062]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0063]向每克菌泥中加入0.2g鹿糖、0.12g可溶性淀粉、0.004gVc、l.0mL的磷酸緩沖液、0.3g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于_40°C預(yù)凍14h，然后放入凍干機于-56°C、5Pa下進行真空冷凍干燥22h，即得嗜熱鏈球菌凍干菌粉。
[0064]其凍干存活率可為79.60 % (對照培養(yǎng)基為20.42 % )，菌粉活菌數(shù)達
2.02X 10nCFU/g(對照培養(yǎng)基為 7.8X 109CFU/g)。[0065]其中，嗜熱鏈球菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置包括:準確稱取15g葡萄糖、18g大豆蛋白胨、IOg酪蛋白水解物、0.01Omg谷氨酸、4gKH2P04、0.8mL吐溫80、0.5g白扁豆多糖，并溶于1000mL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)pH值至6.4-6.6，按照裝量80%盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于119°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫，即得嗜熱鏈球菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0066]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100份蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH值至5.0-6.8，在55 °C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量2 %、活力為10000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量2%、活力為20000U/g的果膠酶，保溫1.5h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫20min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無水乙醇，在冰箱中靜置14h后抽濾，所得濾渣于50°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴至700C的蒸餾水中計算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量4%的木瓜蛋白酶，酶解Ih后得酶解液，酶解液使用多糖溶液25%體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:I)除蛋白30min，4000rpm離心20min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0067]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥(1:1混合)粉碎后混合浸泡于200份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在90°C水浴溫度下提取
1.5h，冷卻至50°C后，在50°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量1.5%的果膠酶和1%的α-淀粉酶，并保溫2.0h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫15min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置14h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過濾后將所得沉淀于55°C烘干，即得薏苡仁和山藥粗多糖混合提取物。
[0068]實施例4
[0069]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0070]將嗜熱鏈球菌菌種接種到已滅菌的M17液體培養(yǎng)基中，于36°C培養(yǎng)22_26h，再按5% (v/v)比例接種于與上述M17液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0071]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入2% (v/v)已活化的嗜熱鏈球菌，38°C恒溫培養(yǎng)18h。
[0072]b)收集菌體:
[0073]然后在2°C、8000rpm下離心20min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0074]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0075]向每克菌泥中加入0.16g鹿糖、0.18g可溶性淀粉、0.003gVc、0.9mL的磷酸緩沖液、0.2g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于_40°C預(yù)凍6h，然后放入凍干機于-56°C、5Pa下進行真空冷凍干燥18h，即得嗜熱鏈球菌凍干菌粉。
[0076]其凍干存活率可為80.19 % (對照培養(yǎng)基為21.65 % )，菌粉活菌數(shù)達
2.32X 10nCFU/g(對照培養(yǎng)基為 7.9X 109CFU/g)。
[0077]其中，嗜熱鏈球菌 增殖抗凍培養(yǎng)基的配置包括:準確稱取IOg葡萄糖、25g大豆蛋白胨、7g酪蛋白水解物、0.0007mg谷氨酸、3gKH2P04、0.7mL吐溫80、0.2g白扁豆多糖，并溶于1000mL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)pH值至6.4-6.6，按照裝量80%盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于121°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫，即得嗜熱鏈球菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0078]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于140份蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH值至5.0-6.8，在50°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量0.5%、活力為10000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量2%、活力為30000U/g的果膠酶，保溫2.5h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫15min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無水乙醇，在冰箱中靜置12h后抽濾，所得濾渣于45°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于18mL、水浴至60°C的蒸餾水中計算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量2%的木瓜蛋白酶，酶解0.8h后得酶解液,酶解液使用多糖溶液20%體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白28min，3000rpm離心18min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。[0079]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥(1:1混合)粉碎后混合浸泡于180份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在901:水浴溫度下提取lh，冷卻至55°C后，在55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量2.5%的果膠酶和0.9%的α -淀粉酶，并保溫1.8h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫12min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置13h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過濾后將所得沉淀于52°C烘干，即得薏苡仁和山藥粗多糖混合提取物。
【權(quán)利要求】
1.一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:包括以下步驟: a)菌種活化與增殖培養(yǎng):將嗜熱鏈球菌菌種接種到M17液體培養(yǎng)基中活化，將已活化的菌種接種于增殖抗凍培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，得到增殖的菌液； b)收集菌體:將上述增殖的菌液離心處理，棄去上清液，得到菌泥； c)干燥:在所制備的菌泥中按每克菌泥添加0.14-0.2g蔗糖、0.12-0.18g可溶性淀粉、0.002-0.004g Vc,0.5-1.0mL的磷酸緩沖液、0.1-0.3g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻后真空冷凍干燥，即得嗜熱鏈球菌凍干菌粉； 所述増殖抗凍培養(yǎng)基配方組成為:10_20g葡萄糖、10-25g大豆蛋白胨、5-10g酪蛋白水解物、0.005-0.01Omg谷氨酸、2_4g ΚΗ2Ρ04、0.5-lmL吐溫80、白扁豆多糖0.2-0.5g、蒸餾水1000mLo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟a)中活化是指將嗜熱鏈球菌菌種接種到M17液體培養(yǎng)基中于35-38°C培養(yǎng)22_26h，再按每IOOmL培養(yǎng)基中接種2-5mL菌種的比例，接種于與上述M17液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟a)中增殖培養(yǎng)的接種比例為每IOOmL增殖抗凍培養(yǎng)基中接種2_5mL已活化的菌種。
4.根據(jù)權(quán)利 要求3所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟a)中增殖培養(yǎng)是于35-38°C下培養(yǎng)16_18h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基均已滅菌，且所述增殖抗凍培養(yǎng)基經(jīng)過118-12rC、15min滅菌處理并室溫冷卻。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述白扁?多糖的制備步驟包括: 首先將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0-6.8 ； 其次在40-55°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量0.5-2%、活力為8000-10000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量1-2%、活力為20000-3000(^/^的果膠酶，保溫1.5-2.5h后加熱至沸騰，再保溫15-20min ； 然后抽濾并將濾液濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無水乙醇，靜置10-14h后抽濾，所得濾渣于45-55°C烘干，即得白扁豆粗多糖； 最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加熱至50-70°C的蒸餾水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15-20mL蒸餾水的比例計算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量1-4%的木瓜蛋白酶，酶解0.5-lh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25%體積的Sevag試劑除蛋白20_30min ;2000-4000rpm離心15_20min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟b)中離心處理為0-4°C、8000-10000rpm 離心 15_20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備步驟包括: 首先將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸餾水中，其中薏苡仁和去皮的山藥按1:1混合，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在80-100°C水浴溫度下提取1-2h，冷卻至 40-550C ； 接著在40-55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量1-2.5%的果膠酶和0.8-1 %的α -淀粉酶，并保溫1.5-2.0h后加熱至沸騰，再保溫10_15min ； 然后抽濾并將濾液濃縮，向濃縮液中加入3-4倍體積的95%乙醇，靜置10-14h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖； 最后用80%乙醇溶液洗滌粗混合多糖，過濾后將所得沉淀于45-55°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟c)中真空冷凍干燥是在凍干機中進行18-24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟c)中真空冷凍干燥之前在_40°C預(yù)凍6-14h。
【文檔編號】C12N1/20GK103937725SQ201410171384
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】陳合, 陳世偉, 舒國偉 申請人:陜西科技大學