一種解淀粉芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 改革開放以來，我國(guó)農(nóng)業(yè)有了長(zhǎng)足的發(fā)展。化學(xué)肥料的應(yīng)用給我國(guó)的糧食生產(chǎn)帶 來了空前的豐收，由改革開放初期的畝產(chǎn)500-600斤增加到現(xiàn)在的畝產(chǎn)1000斤以上，使擁 有十三億多人口的中國(guó)解決了溫飽問題，人民生活有了保障?；试谵r(nóng)業(yè)增產(chǎn)中起了主要 作用，我國(guó)有十八億畝耕地，每年消耗逾1. 5億噸化肥?；实拇罅渴┯?，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重 污染，耕地大面積鹽漬化，土壤板結(jié)嚴(yán)重，使得產(chǎn)量下降。為了增產(chǎn)，農(nóng)民加倍施用化肥，形 成了惡性循環(huán)。很多地區(qū)的瓜果、蔬菜、藥材大面積嚴(yán)重污染，很多出口導(dǎo)向型產(chǎn)品如山東 蔬菜、云南田七、江西臍橙、廣東火龍果和荔枝等我國(guó)優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品，因產(chǎn)品品質(zhì)、農(nóng)藥殘留超 標(biāo)等問題，而無法出口創(chuàng)匯，直接造成數(shù)十億元的經(jīng)濟(jì)損失。為了解決這種問題，國(guó)家有關(guān) 部門通過各項(xiàng)有關(guān)政策，引導(dǎo)企業(yè)、院校加大研發(fā)力度。
[0003] 自2008年以來，國(guó)家對(duì)與微生物肥料相關(guān)的生物產(chǎn)業(yè)進(jìn)行了有史以來力度最大、 涉及面最廣的國(guó)家政策和產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)扶持，為我國(guó)微生物肥料的發(fā)展提供了極其良好的機(jī) 遇。我國(guó)的微生物肥料近12年發(fā)展迅速，并已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生物產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。目 前，國(guó)家農(nóng)業(yè)部科技推廣部門大力宣傳，引導(dǎo)農(nóng)民使用生物肥料。具專業(yè)機(jī)構(gòu)估計(jì)，未來幾 年，生物肥料的應(yīng)用會(huì)達(dá)到化肥總量的3% -5%，但目前的發(fā)展離農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求還有很 大距離。截至2013年我國(guó)微生物肥料年產(chǎn)量約上千萬噸，與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家相比，可以說是 微乎其微，而且在開發(fā)利用方面與一些發(fā)達(dá)國(guó)家還有相當(dāng)大的距離。
[0004] 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)是微生物科學(xué)的一個(gè)重要分支學(xué)科，農(nóng)業(yè)微生物研究主要包括：農(nóng) 用微生物資源、土壤微生物、植物營(yíng)養(yǎng)、微生物固氮、微生物農(nóng)藥、微生物肥料等幾個(gè)方面。 我國(guó)在農(nóng)業(yè)微生物研究方面突出表現(xiàn)在農(nóng)用微生物資源上，通過從自然界中篩選分離具有 良好的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物菌種，并對(duì)農(nóng)用微生物的功能和作用機(jī)理進(jìn)行深入研究是非 常重要的。雖然在這方面，我國(guó)已有60年的發(fā)展歷史，但因種種原因，未能持續(xù)化、規(guī)?；?使用微生物肥料，致使我國(guó)在技術(shù)發(fā)展上遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家。
[0005] 近年來，在國(guó)家政策的引導(dǎo)下，一大批優(yōu)秀的專家、學(xué)者努力研究，通過技術(shù)交流 等方法，引進(jìn)了國(guó)外先進(jìn)技術(shù)，并結(jié)合多年來的經(jīng)驗(yàn)推出了以根瘤菌、放線菌、固氮菌、解磷 菌、鉀細(xì)菌等為代表的生物肥料產(chǎn)品，帶動(dòng)我國(guó)生物肥料產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。隨著研究的深入和 應(yīng)用的需要，在不斷擴(kuò)大新品種的開發(fā)和改進(jìn)上，微生物肥料已形成由豆科作物肥料向非 豆科作物肥料轉(zhuǎn)化，由單一菌種向復(fù)合菌種轉(zhuǎn)化，由單一功能向多功能轉(zhuǎn)化，由無芽孢菌種 向有芽孢菌種轉(zhuǎn)化。
[0006] 基于目前的情況，繼續(xù)尋找具有優(yōu)異的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物菌種并對(duì)其進(jìn)行深 入研究對(duì)于微生物肥料的發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，其 用作微生物菌劑的活性成分，能夠顯著提高作物產(chǎn)量，該菌種培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模推 廣應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供上述解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) ZD0531，其保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：中國(guó) 武漢武漢大學(xué)），保藏號(hào)為CCTCC NO :M2014345。
[0010] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，菌落呈白色或灰白色、不透明、有皺 褶，菌體為直桿狀，含有芽孢。其16SrDNA序列如SEQ ID NO :3所示。該解淀粉芽孢桿菌能 夠提高作物的產(chǎn)量。
[0011] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌ZD0531的培養(yǎng)方法，包括將該解淀粉芽孢桿菌ZD0531 接種于用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0012] 其中，上述培養(yǎng)基中含有2-4g/L的牛肉膏、8-12g/L的蛋白胨和4-6g/L的氯化鈉。 牛肉膏的含量例如 2. 2g/L、2. 5g/L、2. 8g/L、3. 2g/L、3. 5g/L、3. 8g/L、3. 9g/L 等，蛋白胨的 含量例如 8. 5g/L、9. 0g/L、9. 5g/L、10. 0g/L、10. 5g/L、ll. 0g/L、ll. 5g/L、ll. 8g/L 等，氯化 鈉的含量例如 4. 2g/L、4. 5g/L、4. 8g/L、5. 2g/L、5. 5g/L、5. 8g/L、5. 9g/L 等。優(yōu)選地，上述培 養(yǎng)基中含有3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨和5g/L的氯化鈉。上述培養(yǎng)溫度為25-34°C， 例如 25°C、25. 5°C、26°C、26. 5°C、27°C、28°C、29t：、3(rC、3rC、32t：、32. 5°C、33°C、33. 5°C、 33. 8°C等；培養(yǎng)時(shí)間為12-48小時(shí)，例如15小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、25小時(shí)、28小 時(shí)、32小時(shí)、36小時(shí)、40小時(shí)、42小時(shí)、45小時(shí)、46小時(shí)、47小時(shí)等。
[0013] 本發(fā)明還提供上述解淀粉芽孢桿菌ZD0531在制備微生物菌劑中的應(yīng)用。其中，所 述微生物菌劑能夠提高作物的產(chǎn)量。
[0014] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌ZD0531可用作制備微生物菌劑，用于作物生產(chǎn)中能夠 顯著提升作物的產(chǎn)量，因此本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌ZD0531是一種非常有價(jià)值的農(nóng)用微 生物。
[0015] 生物樣品保藏信息：
[0016] 菌株名稱：Bacillus amyloliquefaciens ZD0531
[0017] 保藏日期：2014年7月21日
[0018] 保藏單位：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心（CCTCC)
[0019] 保藏編號(hào)：CCTCC NO :M2014345
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的劃線 培養(yǎng)結(jié)果的照片；
[0021] 圖2為本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的革蘭 氏染色結(jié)果的光學(xué)顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0023] 實(shí)施例1:解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的篩選和分離
[0024] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531是從土壤中采 用稀釋平板法和平板劃線法分離獲得的，分離方法為：于6、7月份從吉林省長(zhǎng)白山森林中 采集樹根周圍的肥沃濕土，采用牛肉膏_蛋白胨固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。具體篩選方法如下： 稱取l-2g 土樣溶解在200mL無菌水中，置于30°C搖床中250rpm震蕩搖晃30min;靜置待上 層澄清后，取100 U L上清液，進(jìn)行10' 10' 10' KT4稀釋，然后將稀釋液涂布于牛肉膏-蛋 白胨固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度濃度涂布三個(gè)平板，在30°C培養(yǎng)2d后，依據(jù)解淀粉芽孢 桿菌的主要生物學(xué)特征挑取幾十個(gè)菌落進(jìn)行個(gè)別單獨(dú)培養(yǎng)。
[0025] 將35株個(gè)別單獨(dú)培養(yǎng)的菌落分別于牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基中32°C培養(yǎng)36小 時(shí)后，得到濃度大約2. OX 108Cfu/mL的培養(yǎng)液，使用分別來自35株菌體的培養(yǎng)液分別進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)室噴施實(shí)驗(yàn)。具體方法是：選取實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的開花坐果期的辣椒360盆（植株生長(zhǎng)狀 況基本相同），分為36組，每組10盆；將上述培養(yǎng)液分別稀釋50倍，作為淋施液，分別淋施 到35組辣椒上，剩余一組作為對(duì)照淋施相同稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)基（不含任何菌體），每7天淋 施一次，直到果實(shí)米摘。
[0026] 果實(shí)采摘后，分別稱取每組辣椒的總產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)有3組淋施液處理的辣椒的產(chǎn)量 相比對(duì)照組增產(chǎn)20. 7%、28. 5%和40. 2%，而其它組淋施液處理的辣椒相比對(duì)照組沒有發(fā) 現(xiàn)明顯增產(chǎn)。
[0027] 取相比對(duì)照組增產(chǎn)40. 2 %的辣椒組施用的菌體，將其命名為ZD0531，并對(duì)其進(jìn)行 進(jìn)一步鑒定。
[0028] 上述實(shí)驗(yàn)所用的牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中含有3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨和 5g/L的氯化鈉。
[0029]實(shí)施例 2:解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531 的鑒定
[0030] 1、形態(tài)鑒定
[0031] 取ZD0531菌株在牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，32°C培養(yǎng)36小時(shí)。觀 察其形態(tài)特征：菌落呈白色或灰白色、不透明、有皺褶，菌體為直桿狀，含有芽孢（如圖1所 示），初步判斷是芽孢桿菌。
[0032] 2、染色
[0033] 取菌體涂片，進(jìn)行革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體，發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陽 性（如圖2所示）。
[0034] 3、生理生化特征
[0035]參照《Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定 手冊(cè)》對(duì)ZD0531進(jìn)行生理生化特征鑒定，結(jié)果見表1。
[0036]表1
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種解淀粉芽孢桿菌ZD0531，其保藏于中國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2014345。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌ZD0531，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌 為革蘭氏陽性菌，菌落呈白色或灰白色、不透明、有皺褶，菌體為直桿狀，含有芽孢。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌ZD0531，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌 的16SrDNA序列如SEQ ID NO :3所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌ZD0531，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌 能夠提高作物的產(chǎn)量。
5. -種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的解淀粉芽孢桿菌ZD0531的培養(yǎng)方法，包括將所述 解淀粉芽孢桿菌ZD0531接種于用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中含有2-4g/L的牛肉 膏、8-12g/L的蛋白胨和4-6g/L的氯化鈉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中含有3g/L的牛肉膏、 l〇g/L的蛋白胨和5g/L的氯化鈉。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)溫度為25-34°C ;培養(yǎng) 時(shí)間為12-48小時(shí)。
9. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的解淀粉芽孢桿菌ZD0531在制備微生物菌劑中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述微生物菌劑能夠提高作物的產(chǎn)量。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，所述解淀粉芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZD0531，其保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO：M2014345，用作微生物菌劑的活性成分，能夠顯著提高作物產(chǎn)量，該菌種培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模推廣應(yīng)用。CCTCC NO：M201434520140721
【IPC分類】C12R1-07, C05F11-08, C12N1-20
【公開號(hào)】CN104611263
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510047611
【發(fā)明人】張永軍
【申請(qǐng)人】深圳市潤(rùn)田生物科技有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年1月29日