一種rna表達載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種RNA表達載體及其用途。
[0002]發(fā)明背景 nodaviruses單股正鏈RNA基因組的二十面體病毒。昆蟲和魚幼蟲已分離出幾種不同的病毒家族成員，然而，盡管病毒的自然宿主范圍有限，許多諾達病毒RNA復(fù)制酶保留完整的昆蟲，哺乳動物，植物，甚至是酵母細胞的活性，它們之間的最簡單和最強大的真核生物RNA復(fù)制酶稱為。諾達病毒RNA復(fù)制酶的復(fù)制產(chǎn)生大量皚皚的mRNA在細胞質(zhì)，例如，放大后nodamura病毒(11)的RNA在幼倉鼠腎細胞(BHK21 )24小時，正鏈RNA的復(fù)制產(chǎn)品之豐富的核糖體(約有10.sup.7每個細胞的分子)和主宰細胞的蛋白質(zhì)合成能力。
[0003]分子生物學(xué)的Nodaviridae，病毒顆粒含有一個分子中的兩個單鏈的基因組片段，基因組RNAl和RNA2，這兩者都是需要的病毒感染。這些RNA的5’帽，但沒有3’聚腺苷酸尾。相反，其3’末端被封鎖由一個共價修飾或不尋常的二級結(jié)構(gòu)。RNA1，在良好的特點羊群房子病毒(FHV)，含有3107個核苷酸，編碼的RNA依賴性RNA聚合酶(RNA復(fù)制酶)，同時復(fù)制RNAl和RNA2基因組片段的整個病毒的貢獻。RNAl因此可以獨立復(fù)制RNA2構(gòu)成一個自主RNA復(fù)制子(3)。其核苷酸序列顯示預(yù)測112千道爾頓(kDa)的多肽的開放閱讀框(ORF)(蛋白A)，對應(yīng)的RNA復(fù)制酶的催化亞基。在復(fù)制過程中基因組RNA1，一個子基因組RNA (RNA3)表示的3’基因組RNAl 387個核苷酸，產(chǎn)生的部分的轉(zhuǎn)錄。RNA3編碼，在重疊的讀碼框，兩個小，約11 kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白(BI和B2)。這些蛋白質(zhì)的功能是未知的，既不似乎是必不可少的RNA復(fù)制。
[0004]nodaviruses,只有4.5 kb的基因組中，很顯然,是最簡單的,所有的動物病毒。然而，它們的RNA可以在從酵母到哺乳動物細胞中的細胞內(nèi)環(huán)境中的各種各樣的大量復(fù)制，這意味著所需的宿主細胞因子是保守的。不一定是細胞毒性的，長期的病毒RNA復(fù)制的事實，一些nodaviruses可以很容易地建立持續(xù)性感染的細胞的培養(yǎng)表示。此外,分段式結(jié)構(gòu)簡化了實驗操作的nodaviral基因組復(fù)制酶基因，表明RNA復(fù)制酶功能自然在反供其使用的表達載體中方便的屬性。
[0005]大多數(shù)表達載體使用的DNA模板的轉(zhuǎn)錄的RNA在細胞內(nèi)的積累，一個過程，是線性的DNA模板的拷貝數(shù),取決于實現(xiàn)。nodaviruses和他們的RNA復(fù)制酶表達載體的一種新型的發(fā)展創(chuàng)造一個有吸引力的機會。本發(fā)明的目標是提供最初由宿主細胞產(chǎn)生初級轉(zhuǎn)錄，翻譯的RNA復(fù)制酶的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA質(zhì)粒。這些初級轉(zhuǎn)錄自治區(qū)，細胞質(zhì)，RNA的復(fù)制，然后放大。這些載體的性能取決于初級轉(zhuǎn)錄的效率比初級轉(zhuǎn)錄由nodaviral RNA復(fù)制的指數(shù)擴增。如上所述，這個過程在一個非常廣泛的宿主細胞中大量存在，并且很大程度上獨立于細胞代謝活性水平。因此，在這些質(zhì)粒載體應(yīng)該是適合用在昆蟲，哺乳動物，植物和酵母細胞，靜止細胞中的常規(guī)的表達載體中，通常情況下失敗，他們也可能具有更多的優(yōu)點。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在放大在細胞中自主RNA復(fù)制的可用性的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的表達載體。本發(fā)明彌補了這個缺陷。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA的表達載體，能夠得到高水平的重組轉(zhuǎn)錄和/或蛋白質(zhì)的細胞類型在很寬的頻譜。該載體包含一個的阿德納依賴性RNA聚合酶的啟動子位點來驅(qū)動的初級轉(zhuǎn)錄合成。初級轉(zhuǎn)錄至少包含兩個序列中的元素。初級RNA轉(zhuǎn)錄物的5’末端，包含從結(jié)病毒的RNA-依賴性RNA聚合酶(RNA復(fù)制酶)催化亞基的開放閱讀框，優(yōu)選涌向內(nèi)部病毒(FHV), Nodamura病毒(NOV)或Pariacoto病毒(PAV)。5’開放讀碼框的嵌合體在細胞中的初級轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染的的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA表達載體，使用宿主細胞的機械翻譯產(chǎn)生活躍的結(jié)病毒RNA依賴的RNA聚合酶，隨后識別和復(fù)制的初級轉(zhuǎn)錄。此外包括初級RNA轉(zhuǎn)錄nodaviral的順式作用的信號識別所需的RNA復(fù)制。的順式作用的信號側(cè)翼，至少，異源基因，該基因編碼一個理想的轉(zhuǎn)錄和/或蛋白質(zhì)(例如，核酶，反義RNA，或蛋白質(zhì)具有治療潛力的)，例如由異源基因編碼的轉(zhuǎn)錄擴增RNA復(fù)制。優(yōu)選地，順式調(diào)控元件的位置，編碼RNA復(fù)制酶的轉(zhuǎn)錄也被復(fù)制，并隨后被放大。此策略產(chǎn)生大量水平的封端的，功能很容易被宿主細胞表達的mRNA在細胞質(zhì)中。這種新型的表達載體吸引人的特點是它的高表達水平和廣泛的宿主范圍。
[0009]在本發(fā)明的一個目的是提供一種結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA表達載體。
[0010]在本發(fā)明的一個實施例，提供了一個分離的cDNA編碼一個Nodamura病毒(NOV)RNAl基因組片段具有在序列號I中所示的序列，分離的cDNA編碼一個Nodamura病毒(NOV)RNA2的基因組片段具有序列不于序列號2,分離的cDNA編碼一個Pariacoto病毒(PAV)RNAl具有在序列號3中所示的序列的基因組片段，分離的cDNA編碼一個Pariacoto病毒(PAV) RNA2的基因組片段具有序列示于序列號4。
[0011]在本發(fā)明的另一個實施例中，提供一個的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA表達載體,其特征在于，包括=DNA依賴性RNA聚合酶啟動子；的cDNA編碼nodaviral的RNA依賴的RNA聚合酶(RNA復(fù)制酶)，其可操作地連接到RNA聚合酶側(cè)翼RNA復(fù)制酶的cDNA和異源基因的cDNA編碼的核酶裂解的表達載體的轉(zhuǎn)錄啟動子，異源基因；nodaviral順式元件，其特征在于，所述裂解產(chǎn)生3’端確認的總RNA的RNA復(fù)制酶復(fù)制的成績單。
[0012]在又一個本發(fā)明的實施例，提供一個的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA在細胞中的表達載體所編碼的是轉(zhuǎn)錄的復(fù)制擴增的方法，包括以下步驟:引入細胞的表達載體或RNA轉(zhuǎn)錄物的矢量披露。
[0013]本發(fā)明的本發(fā)明的優(yōu)選實施例的以下描述，本發(fā)明的其它和進一步的方面，特征和優(yōu)點將是顯而易見的。在這些實施例中給出的公開的目的。
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明的目的之一是提供一種的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA表達載體，能夠得到高濃度的異源轉(zhuǎn)錄和/或蛋白質(zhì)的細胞類型在很寬的頻譜。該載體含有啟動子的宿主細胞的依賴于DNA的RNA聚合酶定位驅(qū)動的初級轉(zhuǎn)錄合成的網(wǎng)站。初級轉(zhuǎn)錄包含至少兩個序列中的元素。的主要的RNA轉(zhuǎn)錄物的5’末端，包含的nodaviral RNA依賴的RNA聚合酶(RNA復(fù)制酶)催化亞基的開放閱讀框。在轉(zhuǎn)染細胞被宿主細胞翻譯機械嵌合轉(zhuǎn)錄本翻譯產(chǎn)生活動結(jié)病毒RNA復(fù)制，可以復(fù)制的酶的mRNA進行適當?shù)捻樖阶饔玫男盘栐诓溉閯游?，鳥類，昆蟲，植物，酵母細胞。因此，確認的復(fù)制酶的順式作用信號和所需的復(fù)制側(cè)翼的RNA復(fù)制酶基因和異源基因，該基因編碼一個理想的轉(zhuǎn)錄和/或蛋白質(zhì)。
[0015]兩側(cè)適當?shù)捻樖阶饔玫男盘枙r，異源RNA序列由結(jié)病毒的r印Iicases的有效地復(fù)制，從而產(chǎn)生豐富的層次的封端的和功能性的mRNA在細胞質(zhì)中直接。因此，這種強大的RNA擴增系統(tǒng)提供了一個有價值的真核表達載體。由于DNA是更容易和更便宜的制備，存儲和傳遞到RNA細胞比，本文中利用本發(fā)明的DNA的質(zhì)粒載體，其中，當導(dǎo)入細胞中，轉(zhuǎn)錄成RNA，推出細胞質(zhì)RNA的復(fù)制，因此，擴增的轉(zhuǎn)錄和/或DNA載體上所含的外源基因編碼的蛋白。
[0016]本發(fā)明是指向一個的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA表達載體。
[0017]本發(fā)明是針對一個分離的cDNA編碼一個Nodamura病毒(NOV) RNAl基因組片段具有在序列號I中所示的序列，分離的cDNA編碼一個Nodamura病毒(NOV) RNA2的基因組片段具有序列表中SEQ ID第2號，分離的cDNA編碼一個Pariacoto病毒RNAl (PAV)具有在序列號3中所示的序列的基因組片段，分離的cDNA編碼一個Pariacoto病毒(PAV)RNA2的基因組片段具有序列表中SEQ ID否#4。另外，本發(fā)明還指向包含的Nodamura病毒和Pariacoto的本發(fā)明中，與這些DNA載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞的病毒cDNA的DNA載體。
[0018]本發(fā)明進一步指向一個結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA表達載體，它包括:一個DNA依賴性RNA聚合酶啟動子；的cDNA編碼nodaviral的RNA依賴性RNA聚合酶(RNA復(fù)制酶)，RNA聚合酶啟動子可操作地連接到一個異源基因；nodaviral順式元件側(cè)翼的RNA復(fù)制酶的cDNA和異源基因的cDNA編碼的核酶裂解的表達載體中的轉(zhuǎn)錄，其特征在于，所述裂解生成3’端的RNA復(fù)制酶RNA復(fù)制的成績單確認。
[0019]另外，本發(fā)明還指向基于諾達病毒DNA在細胞中的表達載體，其特征在于引入到一個單元格的步驟，本發(fā)明的一個的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA的表達載體或RNA編碼的成績單復(fù)制擴增的方法的該表達載體編碼的成績單。
[0020]優(yōu)選的是，所述表達載體包含基因組RNAl的nodaviral基因組片段，并且順式作用的信號來自于基因組RNAl，RNA2或RNA3 RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。的表達載體可以進一步包括一個由噬菌體T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止信號的序列，該序列或真核細胞的poly (A)和/或轉(zhuǎn)錄終止信號，其中，所述的聚(A)和/或轉(zhuǎn)錄終止信號的3’的順式作用元件。
[0021]代表RNA聚合酶啟動子誘導(dǎo)的啟動子，組成型啟動子，組織特異性啟動子和合成發(fā)起人。代表性的可誘導(dǎo)啟動子是激素反應(yīng)的熱休克蛋白70啟動子，金屬硫蛋白啟動子，醇脫氫酶啟動子，半乳糖啟動子，有代表性的組成型啟動子的勞斯肉瘤病毒(RSV) LTR啟動子，人巨細胞病毒(CMV)的主要立即早期基因啟動子和SV40早期啟動子和有代表性的組織特異性啟動子是α-珠蛋白啟動子和β-珠蛋白啟動子。
[0022]通常情況下,nodaviral RNA復(fù)制酶和nodaviral的順式作用元件是從結(jié)病毒,如雞群內(nèi)部病毒，Nodamura病毒和病毒Pariacoto的的的。代表性的裝置引入的的結(jié)病毒為基礎(chǔ)的DNA表達載體包括，但不限于，注射(通過'基因槍)(有或無脂或其他載體)，轉(zhuǎn)染或感染的DNA基因組中的生物體到其中的已被插入合適的載體序列(例如，以下病毒家族的成員:腺病毒，皰疹病毒，細小病毒，桿狀病毒，乳多空病毒等)。在一般情況