一種硫醚單加氧酶pmo-3546及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物催化與生物合成和分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及在生物 催化與生物合成領(lǐng)域應(yīng)用單加氧酶基因進(jìn)行手性藥物的合成。本發(fā)明還涉及單加氧酶基因 克隆及重組蛋白表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性亞砜是重要的手性中間體和輔劑、手性配體、催化劑和手性藥物，可用于重要 手性胺類和手性氨基酸及多種天然產(chǎn)物的合成。另外，治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及反流 性食管炎等的藥物如奧美拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑等均含有手性亞砜活性基團(tuán)。目前，除 了一些過渡金屬催化劑如鈦、釩能有效催化硫醚底物的不對(duì)稱氧化反應(yīng)生成手性亞砜外， 大多數(shù)化學(xué)催化劑在催化反應(yīng)中還存在過度氧化、副產(chǎn)物多和反應(yīng)條件苛刻等不足。而生 物酶催化硫醚底物的不對(duì)稱氧化反應(yīng)可以直接形成手性中心，是合成手性亞砜類化合物最 方便直接的技術(shù)手段。另外，通過酶催化硫醚底物氧化合成手性亞砜類化合物，還具有選擇 性高、環(huán)境友好等特點(diǎn)。鑒于此，生物催化的硫醚不對(duì)稱氧化反應(yīng)可望發(fā)展成為工業(yè)化綠色 制備手性亞砜類藥物的新型生物制造技術(shù)。但是，現(xiàn)有研宄表明，具有高活性，高對(duì)映選擇 性和高底物耐受性的硫醚單加氧酶還十分匱乏。無論是利用分離后的單加氧酶、產(chǎn)硫醚單 加氧酶菌株，還是重組表達(dá)硫醚單加氧酶的基因工程菌，催化效率都很低，無法滿足綠色工 業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此，本發(fā)明的目的是篩選和獲得高活性單加氧酶用于手性亞砜類的生 物合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種硫醚單加氧酶及其在手性亞砜類化合物生物合成中的 應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明所提供的硫醚單加氧酶，來源于假單胞菌屬 CCTCC M2013683菌株，命名為PM0-3546,是如下1)或2)的蛋白質(zhì)： 1)由序列表中序列SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； SEQ ID No. 1、蛋白序列 Met lie Asp Ala Thr Val Tyr Lys His Val Leu Gly Ser Phe Pro Ser Gly Val Thr Val lie Thr Thr Leu Asp Asp Asp Gly Ser Val Val Gly Leu Thr Ala Ser Ala Phe Ser Ser Leu Ser Met Asp Pro Pro Leu Val Leu Phe Cys Pro Asn Tyr Thr Ser Asp Ser Tyr Pro Val Leu lie Arg Gin Lys Arg Phe Ala lie His Leu Leu Ser Gly Glu Gin Gin Ala Glu Ala Tyr Ala Phe Ala Lys Lys Gly Lys Asp Lys Ala Ser Gly lie Glu Trp Ser Leu Ser Glu Leu Gly Asn Pro lie Leu Ala Gly Ala Thr Ala Val lie Glu Cys Glu Leu Trp Arg Glu Tyr Glu Gly Gly Asp His Ala lie Met Val Gly Lys Val His Asn Leu lie Val Pro Glu Glu Ala Pro Arg Pro Met Val Tyr Cys Arg Gly Lys Met Ala Ser Leu Pro Ala Phe Ala 2)將序列表中序列SEQIDNo.1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且與序列1所示蛋白具有相同活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0005] 序列表中的序列SEQ ID No. 1由161個(gè)氨基酸殘基組成。
[0006] 為了便于序列SEQ ID No. 1蛋白的純化，可在由序列表中SEQ ID No. 1所示的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0007] 表1標(biāo)簽的序列
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白質(zhì)，是如下1)或2)所示的蛋白質(zhì)： 1) 由序列表中的SEQ ID No. 1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)； 2) 將序列表中的SEQ ID No. 1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有硫醚單加氧酶功能的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于：所述蛋白質(zhì)為具有硫醚單加氧酶功能 的蛋白質(zhì)。
3. 權(quán)利要求1或2所述的蛋白的編碼基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因的核苷酸序列如下1)、 或2)所示： 1) 序列表中SEQ ID No. 2的核苷酸序列； 2) 與序列表中SEQ ID No. 2的核苷酸序列具有90%以上的同源性的且編碼蛋白具有硫 醚單加氧酶功能的核苷酸序列。
5. 含有權(quán)利要求3所述的編碼基因的重組表達(dá)載體、或含該重組表達(dá)載體的基因工程 菌。
6. 含有權(quán)利要求4所述的編碼基因的重組表達(dá)載體、或含該重組表達(dá)載體的基因工程 菌。
7. 權(quán)利要求1所述的蛋白及其編碼基因在手性亞砜類藥物制備中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明克隆表達(dá)并公開了一種來源于假單胞菌的硫醚單加氧酶及其應(yīng)用。該酶蛋白大小為18 kD，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，相應(yīng)的編碼基因長度為486 bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。該酶蛋白在重組表達(dá)后能有效催化硫醚底物生成亞砜，具有較高的轉(zhuǎn)化效率和很高的立體異構(gòu)對(duì)映選擇性，可用于手性亞砜類藥物的生物合成。
【IPC分類】C12P11-00, C12N15-53, C12N1-21, C12N15-78, C12R1-38, C12N9-02
【公開號(hào)】CN104673764
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510029435
【發(fā)明人】陳永正, 楊加偉, 張紅燕, 崔寶東, 韓文勇
【申請(qǐng)人】遵義醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月21日