一種模擬固態(tài)發(fā)酵單寧酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種模擬固態(tài)發(fā)酵單寧酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶可以進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，已成為當(dāng)前獲得單寧酶的主要手段。固態(tài)發(fā)酵因具有獲得胞外酶活力高、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉、節(jié)約水資源以及污染小等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)前單寧酶研宄的熱點(diǎn)之一。
[0003]利用廉價(jià)易得的農(nóng)林副產(chǎn)物作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)具有巨大成本的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也帶來一系列無法回避的問題。首先是培養(yǎng)基中大量不溶固形物的存在導(dǎo)致其中的微生物菌體含量不能直接測(cè)定，而所有間接測(cè)定固體培養(yǎng)基中的生物量方法均代價(jià)昂貴且過程繁瑣，并且難以準(zhǔn)確的反映微生物真正的生長(zhǎng)情況；其二，隨著發(fā)酵過程的持續(xù)進(jìn)行，培養(yǎng)基中的基質(zhì)不斷被微生物消耗，導(dǎo)致培養(yǎng)基的氧傳質(zhì)與熱傳質(zhì)發(fā)生變化，不利于過程控制；其三，大量營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜的農(nóng)林副產(chǎn)物固形物的存在也使得微生物的代謝變得更加復(fù)雜，在產(chǎn)出目的代謝產(chǎn)物的同時(shí)還生成了許多其他的物質(zhì)，給目的代謝物的分離純化帶來一定的困難。
[0004]有鑒于此，本發(fā)明人研宄和設(shè)計(jì)了一種模擬固態(tài)發(fā)酵單寧酶的方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種模擬固態(tài)發(fā)酵單寧酶的方法，通過惰性基質(zhì)作為固態(tài)載體培養(yǎng)黑曲霉孢子，可以在固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，準(zhǔn)確的測(cè)量黑曲霉的生物量，同時(shí)使得單寧酶的分離純化變得更加簡(jiǎn)單。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是:
一種模擬固態(tài)發(fā)酵單寧酶的方法，包括以下步驟:
步驟一、制備初始發(fā)酵培養(yǎng)基:
取茶葉梗粉末，烘干后過80目篩，與去離子水混合攪勻，攪拌浸提后，過濾收集濾液，制得茶梗浸提液；
取聚氨酯海綿，切割成顆粒，烘干，待恒重后冷卻至室溫，制得海綿顆粒；每只250 mL錐形瓶分裝Ig所述海綿顆粒，紗布封口滅菌后，烘干至恒重；
每克干海綿配制9-19克的茶梗浸提液，分別稱取0.06克的葡萄糖與氯化銨，添加至所述茶梗浸提液中，調(diào)整初始PH至4.0-5.0，高壓蒸汽滅菌后，制得營(yíng)養(yǎng)液，將所述營(yíng)養(yǎng)液與所述錐形瓶中的海綿顆粒在無菌條件下混合均勻，制得初始發(fā)酵培養(yǎng)基；
步驟二、接種及發(fā)酵培養(yǎng):
每只錐形瓶接種6.4X 17個(gè)黑曲霉孢子，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0°C條件下，恒溫培養(yǎng)
96h ；
步驟三、粗酶液提取: 每只錐形瓶中加入50 mL濃度為0.05 11101/1，？?jī)?cè).0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，25<^下180 rpm振蕩浸提lh，定性濾紙過濾，制得粗酶液。
[0007]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，取茶葉梗粉末，烘干后過80目篩，與去離子水按照1:20 (w/v)比例混合攪勻，置于磁力攪拌器上加熱至80°C攪拌浸提I h，用真空泵減壓過濾收集濾液，制得茶梗浸提液。
[0008]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，取聚氨酯海綿，切割成顆粒，60°C溫水洗滌3次，再用去離子水洗滌3次后，置于80°C烘箱中烘干，待恒重后冷卻至室溫，制得海綿顆粒；每只250 mL錐形瓶分裝Ig所述海綿顆粒，紗布封口滅菌后，置于80°C烘箱中烘干至恒重。
[0009]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，在所述營(yíng)養(yǎng)液中，還添加有單寧酸成分。
[0010]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，在所述營(yíng)養(yǎng)液中，還添加有硫酸銨及酵母浸霄成分。
[0011]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，選擇聚氨酯海綿作為吸附營(yíng)養(yǎng)液的惰性載體，所述聚氨酯海綿為多孔狀海綿材料，密度為40 kg/m3、開孔孔徑為300-500 μ m、比表面積為380.6
m2/g0
[0012]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述海綿顆粒的直徑為0.2-1.0cm。
[0013]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述聚氨酯海綿，經(jīng)5個(gè)循環(huán)的重復(fù)利用，仍然具有良好的產(chǎn)酶能力。
[0014]模擬固態(tài)發(fā)酵法(Modifiedsolid state fermentat1n，MSSF)是一種新型的固態(tài)發(fā)酵方法，它通常以惰性載體為基質(zhì)吸附特定的營(yíng)養(yǎng)液制備發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)目的代謝產(chǎn)物。它既保留了固態(tài)發(fā)酵的所有優(yōu)點(diǎn)，又可有效的解決存在于固態(tài)基質(zhì)發(fā)酵中的幾個(gè)難題，能更進(jìn)一步深入研宄固態(tài)發(fā)酵的機(jī)理。
[0015]聚氨醋海綿(Polyurethane foam sponge，PUFS)是一種軟質(zhì)聚氨醋泡沫(Flexible polyurethane foam, FPUF)，具有極好的形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、極高的比表面積、良好的透氣性、優(yōu)異的吸附和保水能力。它不能被微生物消耗也不會(huì)給微生物生長(zhǎng)代謝帶來不利影響，在整個(gè)發(fā)酵過程中保持極為穩(wěn)定的狀態(tài)，保證了培養(yǎng)基氧傳質(zhì)和熱傳質(zhì)的穩(wěn)定。以PUFS為惰性基質(zhì)，可以簡(jiǎn)單、直接的測(cè)定培養(yǎng)基中的微生物含量。
[0016]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，采用聚氨酯海綿作為惰性基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉孢子，可以在固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，準(zhǔn)確的測(cè)量黑曲霉的生物量，同時(shí)使得單寧酶的分離純化變得更加簡(jiǎn)單。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的高密度聚氨酯海綿及其黑曲霉形態(tài)特征圖；
圖2為本發(fā)明的聚氨酯海綿顆粒重復(fù)利用對(duì)單寧酶合成的影響示圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下列實(shí)施例中采用的檢測(cè)方法:
單寧酶活力測(cè)定方法:0.01 mol/L沒食子酸丙酯0.25 mL，粗酶液0.25 mL，6.67 g/L甲醇繞丹寧溶液 0.3 mL，30 °C水浴 5 min 后加入 0.7 mol/L KOH 0.2 mL，30 °C水浴 5 min,再加入蒸餾水4 mL，30 °C水浴10 min，在520 nm處測(cè)吸光值。每克干基質(zhì)獲得的單寧酶活力 Y (U/gds) =12.5X ( ΔΑ-0.0524)
生物量測(cè)定:記錄每個(gè)發(fā)酵瓶中的海綿干重!^，記錄對(duì)應(yīng)的用于浸提的濾紙重量m2。發(fā)酵結(jié)束后，緩沖液浸提粗酶液，真空減壓過濾收集未濾過物80°C烘干至恒重m3。生物量(菌體干重)M (mg) = m3— Hi2-Hi1
高密度聚氨酯海綿表征:SEM觀察海綿顆粒內(nèi)部形貌特征，孔徑大小；分析測(cè)定儀測(cè)定海綿比表面積；取一定體積的海綿在分析天平上進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定并計(jì)算密度。
[0019]聚氨酯海綿內(nèi)部比表面積菌體表征:SEM觀察培養(yǎng)基內(nèi)部菌體形貌特征。
[0020]實(shí)施例1
試驗(yàn)所采用的高密度聚氨酯海綿密度約為40 kg/m3、開孔孔徑約為300-500 μ m、比表面積為380.6 m2/g。掃描電子顯微鏡觀察海綿內(nèi)部及內(nèi)部菌體表觀形態(tài)結(jié)果圖1所示。
[0021]由圖1a和Ib可以清晰的觀察到高密度聚氨酯海綿的內(nèi)部形態(tài)。海綿內(nèi)部光滑、平整，開口良好且孔徑較均一。這為黑曲霉的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)提供了面積巨大的支撐界面，同時(shí)也使其具有優(yōu)異的吸附性能。發(fā)酵過程中，聚氨酯海綿優(yōu)異的機(jī)械性能生物穩(wěn)定性能足以保證發(fā)酵過程中氧傳質(zhì)和熱傳質(zhì)維持穩(wěn)定。
[0022]圖1c和Id顯示，黑曲霉均勻的附著在海綿內(nèi)壁上進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，這表明黑曲霉能夠充分且均勻的利用到基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還可以接觸到充足的氧氣。海綿內(nèi)部空隙明顯，并未因?yàn)楹谇沟纳L(zhǎng)造成透氣性能的下降，這也表明高密度的聚氨酯海綿可以為黑曲霉提供優(yōu)質(zhì)的生長(zhǎng)代謝環(huán)境，是一種性能優(yōu)異的惰性載體。
[0023]實(shí)施例2
取茶葉梗粉末，烘干后過80目篩，與去離子水按照l:20(w/v)比例混合攪勻，置于磁力攪拌器上加熱至80°C攪拌浸提I h，用真空泵減壓過濾收集濾液，制得茶梗浸提液；取聚氨酯海綿，切割成0.2 cm直徑顆粒，60°C溫水洗滌3次，再用去離子水洗滌3次后，置于80°C烘箱中烘干，待恒重后冷卻至室溫，制得海綿顆粒；每只250 mL錐形瓶分裝Ig所述海綿顆粒，紗布封口滅菌后，置于80°C烘箱中烘干至恒重；每克干海綿配制9克的茶梗浸提液，分別稱取0.06克的葡萄糖與氯化銨，添加至所述茶梗浸提液中，調(diào)整初始pH至4.0，高壓蒸汽滅菌后，制得營(yíng)養(yǎng)液；將所述營(yíng)養(yǎng)液與所述海綿顆粒混合均勻，制得模擬固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；每只培養(yǎng)瓶接種6.4X 17個(gè)黑曲霉孢子，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0°C條件下，恒溫培養(yǎng)96h;每只培養(yǎng)瓶中加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，振蕩浸提，定性濾紙過濾，制得粗酶液，測(cè)定生物量為46.4 mg/gds，單寧酶活力為3.02 U/gds。
[0024]實(shí)施例3
取茶葉梗粉末，烘干后過80目篩，與去離子水按照l:20(w/v)比例混合攪勻，置于磁力攪拌器上加熱至80°C攪拌浸提I h，用真空泵減壓過濾收集濾液，制得茶梗浸提液；取聚氨酯海綿，切割成1.0 cm直徑顆粒，60°C溫水洗滌3次，再用去離子水洗滌3次后，置于80°C烘箱中烘干，待恒重后冷卻至室溫，制得海綿顆粒；每只250 mL錐形瓶分裝Ig所述海綿顆粒，紗布封口滅菌后，置于80°C烘箱中烘干至恒重；每克干海綿配制9克的茶梗浸提液，分別稱取0.06克的葡萄糖與氯化銨，添加至所述茶梗浸提液中，調(diào)整初始pH至4.0，高壓蒸汽滅菌后，制得營(yíng)養(yǎng)液；將所述營(yíng)養(yǎng)液與所述海綿顆粒混合均勻，制得模擬固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；每只培養(yǎng)瓶接種6.4X 17個(gè)黑曲霉孢子，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?