一種分子標(biāo)記檢測(cè)物在制備檢測(cè)肝癌的試劑盒中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種分子標(biāo)記檢測(cè)物在制備檢測(cè)肝癌的 試劑盒中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌）是病死率很高的常見(jiàn)腫瘤。肝癌的發(fā)病率在 所有腫瘤中排第六位，然而在全球癌癥死亡率中排第三位，其中約55%發(fā)生在我國(guó)。由于 肝癌發(fā)病隱匿，臨床癥狀極不典型，對(duì)于不大于5cm的小肝癌約70%左右無(wú)癥狀，故肝癌 常常不易被早期發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時(shí)往往已處于肝癌的晚期，多數(shù)患者已 失去最佳的治療時(shí)間。肝癌的發(fā)生是很多因素綜合作用的結(jié)果，涉及到很多基因的失調(diào) 或突變。這些異?；蚩蓪?dǎo)致正常肝細(xì)胞異常增殖及凋亡受抑制等。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的微小 RNA(micr 〇RNA，miRNA)便是通過(guò)調(diào)控基因來(lái)發(fā)揮作用的，故miRNA在肝癌的診斷治療中發(fā) 揮著至關(guān)重要的作用。
[0003] miRNA是一種非編碼、內(nèi)源性的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度為21-25nt。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù) miRBase第21版的記載，人類(lèi)基因組中編碼了 1881個(gè)前體miRNA，這些前體miRNA能夠形 成2588個(gè)成熟miRNA。miRNA的功能主要是負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，可與其靶基因信使 RNA(mRNA)的3'非編碼區(qū)（3' -UTR)特異性結(jié)合，使miRNA在翻譯水平上抑制靶基因的表 達(dá)，除此之外miRNA還可引起靶基因mRNA的降解。近些年來(lái)有研宄結(jié)果表明miRNA可在轉(zhuǎn) 錄水平上對(duì)目的基因進(jìn)行調(diào)控，其主要通過(guò)對(duì)miRNA目的基因啟動(dòng)子區(qū)的CPG島異常甲基 化來(lái)發(fā)揮作用。因此，miRNA可通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。miRNA 的表達(dá)量會(huì)在生理樣本和病理樣本中出現(xiàn)差別，例如腫瘤樣本中的某些miRNA的表達(dá)量會(huì) 升高，而有另一些miRNA的表達(dá)量會(huì)降低。
[0004] 目前，將miRNA作為分子標(biāo)記，使用能夠檢測(cè)miRNA的分子標(biāo)記檢測(cè)物來(lái)檢測(cè)待測(cè) 樣本中特定miRNA的表達(dá)量，能夠有助于判斷待測(cè)樣本的疾病種類(lèi)和程度。但是，現(xiàn)有的 miRNA作為分子標(biāo)記用于檢測(cè)肝癌的病理學(xué)分期和不良預(yù)后時(shí)，準(zhǔn)確率還比較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的miRNA作為分子標(biāo)記用于檢測(cè)肝癌的病理學(xué)分期和 不良預(yù)后時(shí)，準(zhǔn)確率還比較低的缺陷，提供一種能夠以準(zhǔn)確率較高的檢測(cè)肝癌的病理學(xué)分 期和不良預(yù)后的方案。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種分子標(biāo)記檢測(cè)物在制備檢測(cè)肝癌的試劑盒 中的用途，其中，所述分子標(biāo)記檢測(cè)物包括能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物和能夠特 異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1的檢測(cè)物。
[0007] 優(yōu)選地，所述能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物包括序列為SEQ ID NO. 1的第 一正向引物和序列為SEQ ID NO. 2的第一反向引物，所述能夠特異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白 D1的檢測(cè)物包括序列為SEQ ID NO. 3的第二正向引物和序列為SEQ ID NO. 4的第二反向引 物。
[0008] 通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠?qū)z測(cè)肝癌的病理學(xué)分期和不良預(yù)后的準(zhǔn)確率顯 著地提高。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0011] 圖1是對(duì)130例病例進(jìn)行隨訪，結(jié)合miR-19a和Cyclin D1的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行五年 總體生存分析的結(jié)果。
[0012] 圖2是對(duì)130例病例進(jìn)行隨訪，結(jié)合miR-19a和Cyclin D1的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行五年 無(wú)病生存分析的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0014] 本發(fā)明提供了一種分子標(biāo)記檢測(cè)物在制備檢測(cè)肝癌的試劑盒中的用途，其中，所 述分子標(biāo)記檢測(cè)物包括能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物和能夠特異性地檢測(cè)細(xì)胞周 期蛋白D1的檢測(cè)物。
[0015] 其中，所述能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物可以為特異性地針對(duì)miR-19a進(jìn) 行加尾法qRT-PCR檢測(cè)或莖環(huán)法qRT-PCR檢測(cè)的引物；能夠特異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1 的檢測(cè)物可以為特異性地針對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)的引物。
[0016] 優(yōu)選地，所述能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物包括序列為SEQ ID NO. 1的第 一正向引物和序列為SEQ ID NO. 2的第一反向引物，所述能夠特異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白 D1的檢測(cè)物包括序列為SEQ ID NO. 3的第二正向引物和序列為SEQ ID NO. 4的第二反向引 物。
[0017] 其中，本發(fā)明的試劑盒可以按照包含如下步驟的方法使用：（1)從待測(cè)肝臟組織 樣本中提取RNA，得到RNA樣本；（2)使用所述能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物，對(duì)所述 RNA樣本中的miRNA進(jìn)行加尾法qRT-PCR檢測(cè)或進(jìn)行莖環(huán)法qRT-PCR檢測(cè)；（3)使用能夠特 異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1的檢測(cè)物，對(duì)所述RNA樣本中的細(xì)胞周期蛋白D1的mRNA進(jìn)行 qRT-PCR檢測(cè)；如果待測(cè)肝臟組織樣本中miR_19a的表達(dá)量下降且細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá) 量上升，則指示待測(cè)肝臟組織來(lái)自肝癌患者。
[0018] 其中，所述肝臟組織樣本可以來(lái)自于肝穿刺樣本，也可以來(lái)源于手術(shù)樣本。其中， 提取RNA樣本的試劑和步驟可以使用英杰（Invitrogen)公司的商業(yè)化試劑盒并參照其說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行操作。其中，對(duì)miRNA的加尾法qRT-PCR檢測(cè)以及莖環(huán)法qRT-PCR檢測(cè)所用的 試劑和方法可以使用凱杰（Qiagen)公司或普洛麥格（Promega)公司的商業(yè)化試劑盒并 參照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。其中，進(jìn)行qRT-PCR的方法可以參照羅氏（Roche)公司的商業(yè) 化試劑盒并參照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。其中，待測(cè)肝臟組織樣本中miR-19a的表達(dá)量下降 是指待測(cè)肝臟組織樣本中miR-19a的表達(dá)量與正常肝臟組織樣本中miR-19a的表達(dá)量相 比，待測(cè)肝臟組織樣本中miR-19a的表達(dá)量為正常肝臟組織樣本中miR-19a的表達(dá)量的二 分之一以下。其中，待測(cè)肝臟組織樣本中細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)量上升是指待測(cè)肝臟組 織樣本中細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)量與正常肝臟組織樣本中細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)量相 比，待測(cè)肝臟組織樣本中細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)量為正常肝臟組織樣本中細(xì)胞周期蛋白 D1的表達(dá)量的二倍以上。其中，正常肝臟組織樣本是指按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization (WHO))標(biāo)準(zhǔn)以及國(guó)際抗癌學(xué)會(huì)（International Union against Cancer)標(biāo) 準(zhǔn)進(jìn)行診斷后確認(rèn)的不表現(xiàn)有肝癌病理特征的肝臟組織樣本，例如實(shí)體瘤癌旁樣本。
[0019] 其中，為了進(jìn)一步增強(qiáng)qRT-PCR的準(zhǔn)確性，可以使用內(nèi)參引物，所述內(nèi)參引物可以 包括能夠特異性地檢測(cè)RNU6的引物和/或能夠特異性地檢測(cè)GAPDH的引物，其中，RNU6是 指U6RNA，GAPDH是指甘油醛-3-磷酸脫氫酶。其中，特異性地檢測(cè)RNU6的引物可以包括序 列為SEQ ID NO. 5的第三正向引物和序列為SEQ ID NO. 6的第三反向引物，所述能夠特異 性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1的檢測(cè)物包括序列為SEQ ID NO. 7的第四正向引物和序列為SEQ ID NO. 8的第四反向引物。
[0020] 以下，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0021] 制備實(shí)施例1
[0022] 在符合倫理和法律的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)下，采集130例自體配對(duì)的肝癌肝臟組織樣本和癌 旁正常組織樣本，將這些樣本用液氮保存待用。這些樣本的臨床基本情況如表1所示。
[0023] 表 1
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分子標(biāo)記檢測(cè)物在制備檢測(cè)肝癌的試劑盒中的用途，其中，所述分子標(biāo)記檢測(cè) 物包括能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物和能夠特異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1的檢測(cè) 物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物為特 異性地針對(duì)miR_19a進(jìn)行加尾法qRT-PCR檢測(cè)或莖環(huán)法qRT-PCR檢測(cè)的引物；能夠特異性 地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1的檢測(cè)物為特異性地針對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)的引 物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，所述能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物包 括序列為SEQ ID NO. 1的第一正向引物和序列為SEQ ID NO. 2的第一反向引物，所述能夠 特異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1的檢測(cè)物包括序列為SEQ ID NO. 3的第二正向引物和序列 為SEQ ID NO. 4的第二反向引物。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種分子標(biāo)記檢測(cè)物在制備檢測(cè)肝癌的試劑盒中的用途，其中，所述分子標(biāo)記檢測(cè)物包括能夠特異性地檢測(cè)miR-19a的檢測(cè)物和能夠特異性地檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的檢測(cè)物。本發(fā)明能夠提高檢測(cè)肝癌的病理學(xué)分期和不良預(yù)后的準(zhǔn)確率。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104673894
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510024578
【發(fā)明人】張彥瓊, 郭曉冬, 趙景民, 林娜, 楊美
【申請(qǐng)人】中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所, 中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月16日