国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體的制作方法_2

      文檔序號(hào):8385592閱讀:來(lái)源:國(guó)知局
      醜胺(曲表示BA-1-3DVH的成熟膚的N末端氨基 酸殘基。BA-1-3DVH的成熟膚的cDNA堿基序列示于序列號(hào)14,其推定氨基酸序列示于 序列號(hào)15。CDR序列(畫(huà)了下劃線的序列)按照K油at等人(SequencesofProteins ofImmunologicalInterests,Fifthedition,NIHPublicationNo.91-3242,U. S.DepartmentofHealthandHumanServices, 1991)的定義。BA-1-3DVH的 CDRUDYAMH)、CDR2(VISTYYGNTNYNQKFKG)和CDR3(GGLREYYYAMDY)的氨基酸序列分別依次 不于序列號(hào)16~18。
      [00財(cái)圖2是表示小鼠抗hD化-1單克隆抗體克隆BA-1-3D的L鏈(輕鏈)可變區(qū)(VL)的cDNA堿基序列(序列號(hào)19)和推定氨基酸序列(序列號(hào)20)的圖。氨基酸殘基用一個(gè)字母標(biāo) 記表示,信號(hào)膚(從該推定氨基酸序列的N末端起20個(gè)氨基酸構(gòu)成的膚)用西文斜體字表 示。畫(huà)了雙下劃線的天冬氨酸值)表示BA-1-3D化的成熟膚的N末端氨基酸殘基。BA-1-3D 化的成熟膚的cDNA堿基序列示于序列號(hào)21,其推定氨基酸序列示于序列號(hào)22。CDR序 列(畫(huà)了下劃線的序列)按照K油at等人(SequencesofProteinsofImmunological Interests,Fifthedition,NIHPublicationNo. 91-3242,U.S.DepartmentofHealth andHumanServices, 1991)的定義。BA-1-3DVL的CDR1(KSSQ化LNSSNQKNYLA)、 CDR2(FASTRE巧和CDR3(QQHYSTPPT)的氨基酸序列分別依次示于序列號(hào)23~25。
      [0066] 圖3表示被設(shè)計(jì)成被Spel位點(diǎn)(ACTAGT;下劃線)和化ndin位點(diǎn)(AAGCTT;下劃 線)夾住的形式的BA-1-3DVH基因的堿基序列(序列號(hào)26)和氨基酸序列。堿基序列的 用西文斜體表示的序列(包含Hindlll位點(diǎn)的3'末端側(cè)的22個(gè)堿基)表示內(nèi)含子序列。 除此W外,與圖1的說(shuō)明相同。
      [0067] 圖4表示被設(shè)計(jì)成被化el位點(diǎn)佑CTAGC;下劃線)和EcoRI位點(diǎn)佑AATTC;下劃 線)夾住的形式的BA-1-3D化基因的堿基序列(序列號(hào)27)和氨基酸序列。堿基序列的 用西文斜體表示的序列(包含EcoRI位點(diǎn)的3'末端側(cè)的22個(gè)堿基)表示內(nèi)含子序列。除 此W外,與圖2的說(shuō)明相同。
      [0068] 圖5是表示嵌合體和人源化BA-1-3DIgGa/K抗體的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)的示意圖。 表達(dá)載體W基于Sail的限制性酶位點(diǎn)為前導(dǎo),順時(shí)針地包括W人巨細(xì)胞病毒(CMV)主要即 刻早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV啟動(dòng)子)開(kāi)始的抗體的H鏈基因的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單元。接著CMV 啟動(dòng)子的是VH外顯子、CH1、較鏈、C肥、C冊(cè)外顯子、W及介于該些外顯子間的內(nèi)含子,W及 在CH3外顯子之后連接有多聚腺巧酸化序列。接著H鏈基因序列,作為L(zhǎng)鏈的轉(zhuǎn)錄單元而 連接有CMV啟動(dòng)子、化外顯子、接著內(nèi)含子序列的一部分的人K鏈恒定區(qū)的外顯子(CL)、 多聚腺巧酸化序列。接著L鏈基因,連接有SV40早期啟動(dòng)子(SV40啟動(dòng)子)、大腸桿菌來(lái) 源的黃嘿嶺鳥(niǎo)嘿嶺磯酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)、含有SV40多聚腺巧酸化部位(SV4化oly(A) site)的片段。最后,連接有含有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(pUCori)和目-內(nèi)醜胺酶基因化eta lactamase)的pUC19質(zhì)粒的序列的一部分。
      [0069] 圖 6 表示BA-1-3DVH、兩種人源化BA-1-3DVH(HUBA-1-3DVH1 和HUBA-1-3D V肥)、W及作為受體的U00503VH的氨基酸序列的比對(duì)。氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示,示于 序列上部的氨基酸號(hào)按照K油at等人(1991)的定義。BA-1-3DVH的氨基酸序列中的下劃 線表示基于K油at等人(1991)的定義的CDR序列值YAMH,VISTYYGNTNYNQKFKG,GGLREYYYAM DY)?;疊A-1-3DV化和化BA-1-3DV肥的氨基酸序列中的下劃線表示推測(cè)對(duì)CDR結(jié)構(gòu)的形 成很重要的氨基酸殘基,該氨基酸殘基保持了與對(duì)應(yīng)的小鼠BA-1-3DVH的氨基酸序列中的 氨基酸。省略了U00503VH的CDR序列的標(biāo)記。
      [0070] 需要說(shuō)明的是,圖中的BA-1-3DVH的氨基酸序列示于序列號(hào)15(編碼其的堿基 序列為序列號(hào)14),化BA-1-3DVH1的氨基酸序列示于序列號(hào)35 (編碼其的堿基序列為序 列號(hào)34),化BA-1-3DVH2的氨基酸序列示于序列號(hào)40 (編碼其的堿基序列為序列號(hào)39), U00503VH的氨基酸序列示于序列號(hào)29 (編碼其的堿基序列為序列號(hào)28)。
      [0071]圖 7 表示BA-1-3DVL、人源化BA-1-3DVL(HuBA-l-3DVL)、和作為受體的 Z46622化的氨基酸序列的比對(duì)。氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示,示于序列上部的氨基酸號(hào)按 照Kabat等人(1991)的定義。BA-1-3D化的氨基酸序列中的下劃線表示基于Kabat等人 (1991)的定義的CDR序列化SSQSLLNSSNQKNYLA,FASTRES,QQHYSTPPT)。HUBA-1-3D化的氨 基酸序列中的下劃線表示推測(cè)對(duì)CDR結(jié)構(gòu)的形成很重要的氨基酸殘基,該氨基酸殘基保持 了與對(duì)應(yīng)的小鼠BA-1-3D化的氨基酸序列中的氨基酸。省略了Z46622化的CDR序列的標(biāo) 記。
      [0072] 需要說(shuō)明的是,圖中的BA-1-3D化的氨基酸序列示于序列號(hào)22 (編碼其的堿基序 列為序列號(hào)21),化BA-1-3D化的氨基酸序列示于序列號(hào)45 (編碼其的堿基序列為序列號(hào) 44),Z46622化的氨基酸序列示于序列號(hào)31 (編碼其的堿基序列為序列號(hào)30)。
      [0073] 圖8表示被設(shè)計(jì)成被Spel位點(diǎn)(ACTAGT;下劃線)和Hindlll位點(diǎn)(AAGCTT;下 劃線)夾住的形式的化BA-1-3DVH1基因的堿基序列(序列號(hào)36)和氨基酸序列。堿基序 列的用西文斜體表示的序列(包含Hindlll位點(diǎn)的3'末端側(cè)的23個(gè)堿基)表示內(nèi)含子序 列。
      [0074] 化BA-1-3DVH1的cDNA堿基序列示于序列號(hào)32,其推定氨基酸序列示于序列號(hào) 33。 氨基酸殘基用一個(gè)字母標(biāo)記表示,信號(hào)膚(從該推定氨基酸序列的N末端起由19個(gè) 氨基酸構(gòu)成的膚)用西文斜體表示。畫(huà)了雙下劃線的谷氨醜胺(曲表示化BA-1-3DVH1 的成熟膚的N末端氨基酸殘基?;疊A-1-3DVH1的成熟膚的cDNA堿基序列示于序列號(hào) 34, 其推定氨基酸序列示于序列號(hào)35。CDR序列(畫(huà)了下劃線的序列)按照Kabat等人 (SequencesofProteinsofImmunologicalInterests,Fifthedition,NIHPublication No. 91-3242,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices, 1991)的定義。HuBA-l-3D VHl的CDRl0YAMH)、CDR2(VISTYYGNTNYNQKFKG)和CDR3(G化REYYYAMDY)的氨基酸序列分 別依次示于序列號(hào)16~18。
      [00巧]圖9表示被設(shè)計(jì)成被Spel位點(diǎn)(ACTAGT;下劃線)和Hindlll位點(diǎn)(AAGCTT;下 劃線)夾住的形式的化BA-1-3DV肥基因的堿基序列(序列號(hào)41)和氨基酸序列。堿基序 列的用西文斜體表示的序列(包含Hindlll位點(diǎn)的3'末端側(cè)的23個(gè)堿基)表示內(nèi)含子序 列。
      [0076] 化BA-1-3DV肥的cDNA堿基序列示于序列號(hào)37,其推定氨基酸序列示于序列號(hào) 38。 氨基酸殘基用一個(gè)字母標(biāo)記表示,信號(hào)膚(從該推定氨基酸序列的N末端起由19個(gè) 氨基酸構(gòu)成的膚)用西文斜體表示。畫(huà)了雙下劃線的谷氨醜胺(曲表示化BA-1-3DVH2 的成熟膚的N末端氨基酸殘基。化BA-1-3DV肥的成熟膚的cDNA堿基序列示于序列號(hào) 39, 其推定氨基酸序列示于序列號(hào)40。CDR序列(畫(huà)了下劃線的序列)按照Kabat等人 (SequencesofProteinsofImmunologicalInterests,Fifthedition,NIHPublication No. 91-3242,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices, 1991)的定義。HuBA-l-3D V肥的CDRl0YAMH)、CDR2(VISTYYGNTNYNQKFKG)和CDR3(G化REYYYAMDY)的氨基酸序列分 別依次示于序列號(hào)16~18。
      [0077] 圖10表示被設(shè)計(jì)成被化el位點(diǎn)佑CTAGC;下劃線)和EcoRI位點(diǎn)佑AATTC;下劃 線)夾住的形式的化BA-1-3D化基因的堿基序列(序列號(hào)46)和氨基酸序列。堿基序列 的用西文斜體表示的序列(包含EcoRI位點(diǎn)的3'末端側(cè)的23個(gè)堿基)表示內(nèi)含子序列。
      [0078] 化BA-1-3D化的cDNA堿基序列示于序列號(hào)42,其推定氨基酸序列示于序列號(hào) 43。 氨基酸殘基用一個(gè)字母標(biāo)記表示,信號(hào)膚(從該推定氨基酸序列的N末端起由20個(gè) 氨基酸構(gòu)成的膚)用西文斜體表示。畫(huà)了雙下劃線的天冬氨酸值)表示化BA-1-3DVL 的成熟膚的N末端氨基酸殘基?;疊A-1-3D化的成熟膚的cDNA堿基序列示于序列號(hào) 44, 其推定氨基酸序列示于序列號(hào)45。CDR序列(畫(huà)了下劃線的序列)按照Kabat等人 (SequencesofProteinsofImmunologicalInterests,Fifthedition,NIHPublication No. 91-3242,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices, 1991)的定義。HuBA-l-3D 化的CDRl〇(SSQSLLNSSNQKNYLA)、CDR2 (FASTRE巧和CDR3 (QQHYSTPPT)的氨基酸序列分別 依次示于序列號(hào)23~25。
      [0079] 圖11表示本申請(qǐng)實(shí)施例4中的H鏈和L鏈的cDNA的PCR擴(kuò)增、W及測(cè)序反應(yīng)中使 用的寡核巧酸引物(CMV2、JNT026、JNT082、JNT097 和JNT098)的堿基序列。CMV2、JNT026、 JNT082、JNT097和JNT098的堿基序列分別依次示于序列號(hào)47~51。
      [0080] 圖12表不P化BA-1-3D載體的H鏈(Y1鏈)的編碼區(qū)域的堿基序列(序列號(hào)52) 和氨基酸序列(序列號(hào)53)。氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示,終止密碼子的位置用"?"表示。 [00引]圖13表不P化BA-1-3D載體的L鏈(K鏈)的編碼區(qū)域的堿基序列(序列號(hào)54) 和氨基酸序列(序列號(hào)55)。氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示,終止密碼子的位置用"?"表示。 [008引圖14表不P化BA-1-3D-1載體的H鏈(Y1鏈)的編碼區(qū)域的堿基序列(序列號(hào) 56)和氨基酸序列(序列號(hào)57)。氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示,終止密碼子的位置用" 表不。
      [008引圖15表示師1BA-1-3D-2載體的H鏈(Y1鏈)的編碼區(qū)域的堿基序列(序列號(hào) 58)和氨基酸序列(序列號(hào)59)。氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示,終止密碼子的位置用" 表不。
      [0084]圖 16 表示pHuBA-l-3D-l載體、pHuBA-l-3D-2 載體、pHuBA-l-3D-l-T73K載體、 和pHuBA-l-3D-l-A24G/T73K載體的L鏈(K鏈)的編碼區(qū)域的堿基序列(序列號(hào)60) 和氨基酸序列(序列號(hào) 61)。總之,HuBA-l-3D-l、HuBA-l-3D-2、HuBA-l-3D-l-T73K和HUBA-1-3D-1-A24G/T73K的各抗體的L鏈(K鏈)均為相同的堿基序列和氨基酸序列。圖 中,氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示,終止密碼子的位置用"?"表示。
      [0085] 圖17是經(jīng)純化的各抗體的SDS-PAGE圖(泳道1 ;分子量標(biāo)記 (SeeBluePlus2PrestainedStandard(Invitrogen))、泳道 2;QiBA-l-3D、泳道 3: HuBA-l-3D-l、泳道4 ;HuBA-l-3D-2、泳道 5 ;HuBA-l-3D-l-T73K、泳道6 ;HuBA-l-3D-l-A24G/ T73K)。其為下述結(jié)果:對(duì)于各抗體 7.5yg,利用MES-SDSRunningbuffer(Invitrogen)在 還原條件下用NuPAGEBis-Tris4-20%凝膠展開(kāi)。圖左側(cè)的數(shù)值表示分子量。
      [0086] 圖18是表示hD化-1細(xì)胞外區(qū)域的重組蛋白化mk-1-His)對(duì)于化BA-1-3D、 HUBA-1-3D-1 和HUBA-1-3D-2 的結(jié)合活性的ELISA結(jié)果。用 1yg/mL的ChBA-l-3D、 HuBA-l-3D-l和HuBA-l-3D-2 包覆化ISA板,對(duì)于hD化-1-His,從 1yg/mL起分別W2 倍制 作稀釋系列,使其反應(yīng)。hD化-1-His的結(jié)合用HRP標(biāo)記的抗化s標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測(cè)。
      [0087] 圖 19 是表示ChBA-l-3D、HuBA-l-3D-l和HUBA-1-3D-2 對(duì)于hD化-1-His的結(jié)合活 性的化ISA結(jié)果。用0. 5yg/mL的hD化-1-His包覆化ISA板,對(duì)于待測(cè)抗體(ChBA-l-3D、 化BA-1-3D-1和化BA-1-3D-2),從5yg/mL起分別W2倍制作稀釋系列,使其反應(yīng)。圖中示 出ChBA-l-3D、HUBA-1-3D-1 和HUBA-1-3D-2 的ECs。值。
      [0088] 圖 20 是表示ChBA-l-3D、HuBA-l-3D-l和HUBA-1-3D-2 對(duì)于hD化-1-His的結(jié)合活 性的化ISA結(jié)果。用0. 05yg/mL的hD化-1-His包覆化ISA板,對(duì)于待測(cè)抗體(ChBA-l-3D、 HUBA-1-3D-1和HUBA-1-3D-2),從5yg/mL其分別W2倍制作稀釋系列,使其反應(yīng)。
      [0089]圖 21 是表示ChBA-l-3D、HUBA-1-3D-2、HuVH/Mu化(將HUBA-1-3D-2 的 VL(HuBA-l-3DVL)置換為小鼠BA-1-3D的VL)和MuVH/Hu化(將HUBA-1-3D-2 的 VH(HuBA-l-3DV肥)置換為小鼠BA-1-3D的VH)對(duì)于hD化-1-His的結(jié)合活性的化ISA結(jié)果。 用0. 05yg/mL的hD化-1-His包覆化ISA板,制作分別瞬間性表達(dá)待測(cè)抗體(化BA-1-3D、 化BA-1-3D-2、化VH/Mu化和MuVH/化VL)的細(xì)胞的培養(yǎng)上清的2倍稀釋系列,使其反應(yīng)。
      [0090] 圖22是表示化BA-1-3DVH1及其氨基酸置換突變體(V5Q~T73K/T75巧的氨基 酸序列的圖。氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示。各氨基酸置換突變體中,對(duì)于與化BA-1-3DVH1 的氨基酸相同的氨基酸,用表示;僅對(duì)所置換的氨基酸用一個(gè)字母標(biāo)記表示。序列上部 的數(shù)字表示氨基酸號(hào)化油at等人,1991)。
      [0091] 圖 23 是表示ChBA-l-3D、HUBA-1-3D-1、HUBA-1-3D-1-A24G、HUBA-1-3D-1-T73K 和HUBA-1-3D-1-A24G/T73K對(duì)于hD化-1-His的結(jié)合活性的化ISA結(jié)果。用0.05yg/mL 的hD化-1-His包覆化ISA板,制作分別瞬間性表達(dá)待測(cè)抗體(ChBA-l-3D、HUBA-1-3D-1、 HuBA-l-3D-l-A24G、HuBA-l-3D-l-T73K和HUBA-1-3D-1-A24G/T73K)的細(xì)胞的培養(yǎng)上清的 2 倍稀釋系列,使其反應(yīng)。
      [009引圖24表示抑UBA-1-3D-1-T73K的H鏈(Y1鏈)的編碼區(qū)域的堿基序列(序列
      當(dāng)前第2頁(yè)1 2 3 4 5 6 
      網(wǎng)友詢(xún)問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1