蛋白等。
[0140] 另外，抗原可W是在hD化-1的氨基酸序列（序列號(hào)2)或前述的序列的部分序列 中缺失、置換或添加了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的膚。例如，還可W使用hD化-1 的氨基酸序列或其部分序列中缺失1個(gè)或多個(gè)（優(yōu)選1個(gè)或多個(gè)（例如1個(gè)~10個(gè)，更優(yōu) 選1個(gè)~5個(gè)））氨基酸，1或多個(gè)（優(yōu)選1個(gè)或多個(gè)（例如1個(gè)~10個(gè)，更優(yōu)選1個(gè)~5 個(gè)））氨基酸被其它氨基酸置換，或添加了 1個(gè)或多個(gè)（優(yōu)選1個(gè)或多個(gè)（例如1個(gè)~10 個(gè)，更優(yōu)選1個(gè)~5個(gè)））其它氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成的膚。
[0141] 本發(fā)明中，作為用于導(dǎo)入于細(xì)胞等的基因，可W舉出編碼hD化-1蛋白質(zhì)或其部分 片段的基因、或編碼其突變型的蛋白質(zhì)或片段的基因。作為該種基因，例如可W使用具有序 列號(hào)1所示的堿基序列或其部分序列的基因。
[0142] 而且，作為用于導(dǎo)入于細(xì)胞等的基因，還可W使用與序列號(hào)1所示的堿基序列互 補(bǔ)的序列在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有hD化-1活性的蛋白質(zhì)的堿基序列或其部分序列。
[0143] "嚴(yán)緊條件"是指雜交后清洗時(shí)的條件，緩沖液的鹽（軸）濃度為10~500mM，溫 度為42C~72C，優(yōu)選上述鹽濃度為50~300mM，溫度為55~68C的條件。
[0144] 為了在基因中導(dǎo)入突變，可W通過(guò)Kunkel法或帶缺口的雙鏈體（Gappedduplex) 法等公知方法進(jìn)行，例如使用利用定點(diǎn)突變法的突變導(dǎo)入用試劑盒、例如Gene化i1or? Site-DirectedMutagenesisSystem(Invitrogen公司制）、TaKaRaSite-Directed MutagenesisSystem(PrimeSTAR(注冊(cè)商標(biāo)）MutagenesisBasalkit、Mutan(注冊(cè)商 標(biāo)）-SuperExpressKm等；TAKARABIO公司制）來(lái)進(jìn)行。
[0145] (2)多克隆抗體的制作
[0146] 將制備的抗原給予到用于免疫的哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物沒(méi)有特別限定，例如可W舉 出大鼠、小鼠和兔等，其中優(yōu)選小鼠。
[0147] 每一只動(dòng)物的抗原給藥量，可W根據(jù)佐劑的有無(wú)適當(dāng)設(shè)定。作為佐劑，可W舉出 弗氏完全佐劑（FCA)、弗氏不完全佐劑（FIA)、氨氧化鉛佐劑等。免疫主要可W通過(guò)注入到 靜脈內(nèi)、腳掌、皮下、腹腔內(nèi)等來(lái)進(jìn)行。而且，免疫的間隔沒(méi)有特別限定，W數(shù)天至數(shù)周的間 隔優(yōu)選1周的間隔進(jìn)行1~10次、優(yōu)選2~3次免疫。然后，在最后的免疫日起3~7天 后，通過(guò)酶免疫測(cè)定法巧LISA或EIA)或放射性免疫測(cè)定法巧IA)等測(cè)定抗體效價(jià)，可W在 出現(xiàn)所希望的抗體效價(jià)之日采血，獲得抗血清。在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體 時(shí)，可W通過(guò)適當(dāng)選擇或組合硫酸饋鹽析法、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等公 知方法來(lái)進(jìn)行純化。然后，通過(guò)化ISA法等測(cè)定抗血清中的多克隆抗體的反應(yīng)性。
[014引（3)單克隆抗體的制作
[0149] (3-1)抗體產(chǎn)生細(xì)胞的提取
[0150] 本發(fā)明的抗hD化-1抗體并沒(méi)有限制，但優(yōu)選為單克隆抗體。
[0151] 將制備的抗原給予到用于免疫的哺乳動(dòng)物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只動(dòng)物的抗 原給藥量可W根據(jù)有無(wú)佐劑適當(dāng)設(shè)定。佐劑與上述同樣。免疫方法也與前述同樣。而且， 在最后的免疫日起1~60天后，優(yōu)選為1~14天后，提取抗體產(chǎn)生細(xì)胞。作為抗體產(chǎn)生細(xì) 胞，可W舉出脾細(xì)胞、淋己結(jié)細(xì)胞和外周血細(xì)胞等，其中優(yōu)選淋己結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞。
[0152] (3-2)細(xì)胞融合
[0153] 為了獲得雜交瘤（抗體產(chǎn)生細(xì)胞株），進(jìn)行抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融 合。作為與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞，可w使用小鼠等動(dòng)物的一般可w獲得的已建 立的細(xì)胞株。作為使用的細(xì)胞株，優(yōu)選具有藥劑選擇性，具有未融合的狀態(tài)下在HAT選擇培 養(yǎng)基（含有次黃嘿嶺、氨基噪嶺和胸腺嚼巧脫氧核巧）中無(wú)法生存而只有在與抗體產(chǎn)生細(xì) 胞融合的狀態(tài)下可W生存的性質(zhì)的細(xì)胞株。
[0154] 作為骨髓瘤細(xì)胞，例如可W舉出P3-X63-A妍.653、P3-X63-A妍狂63)、P3-X63-A妍. U1(P抓1)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS1)和Sp2/0-Agl4(Sp2/0)等小鼠骨髓瘤細(xì)胞株。骨髓瘤細(xì) 胞的選擇，可W適當(dāng)考慮與抗體產(chǎn)生細(xì)胞的適合性而進(jìn)行。
[0155] 然后，使骨髓瘤細(xì)胞與抗體產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合時(shí)，在不含血清的 DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基等動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基中，混合1X1〇6~1X10 7個(gè)/mL的抗體產(chǎn)生 細(xì)胞和2X105~2X10 6個(gè)/mL的骨髓瘤細(xì)胞?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞比（抗 體產(chǎn)生細(xì)胞；骨髓瘤細(xì)胞）沒(méi)有限制，但通常優(yōu)選為1 ;1~10 ;1，更優(yōu)選為3 ;1。然后，在 細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下進(jìn)行融合反應(yīng)。作為細(xì)胞融合促進(jìn)劑，例如可W使用平均分子量 為1000~6000道爾頓（D)的聚己二醇等。而且，還可W使用利用電刺激（例如電穿孔） 的市售的細(xì)胞融合裝置，使抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。
[0156] (3-3)雜交瘤的挑選和克隆
[0157] 從細(xì)胞融合處理后的細(xì)胞中挑選出目的雜交瘤。作為該方法，將細(xì)胞息浮液用例 如含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基等適當(dāng)稀釋后，接種于微板上，在各孔中加入選擇培 養(yǎng)基，W后適當(dāng)更換選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。其結(jié)果是，在選擇培養(yǎng)基中開(kāi)始培養(yǎng)后，可W將 14天前后開(kāi)始生長(zhǎng)的細(xì)胞作為雜交瘤。
[0158] 然后，在逐步增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清中，篩選是否存在與hD化-1反應(yīng)的抗體。 雜交瘤的篩選可W按照通常的方法，沒(méi)有特別限制。例如，可W采集已長(zhǎng)出雜交瘤的孔中所 含的培養(yǎng)上清的一部分，通過(guò)化ISA、EIA和RIA等進(jìn)行篩選。
[0159] 融合細(xì)胞的克隆可W通過(guò)有限稀釋法等進(jìn)行。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)等判斷與hD化-1 顯示出強(qiáng)反應(yīng)性的抗體，選擇產(chǎn)生該抗體的雜交瘤，建立克隆。
[0160] (3-4)單克隆抗體的提取
[0161] 作為培養(yǎng)已建立的雜交瘤并從獲得的培養(yǎng)物中提取單克隆抗體的方法，可W采取 通常的細(xì)胞培養(yǎng)法或腹水形成法等。"培養(yǎng)"是指在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中使雜交瘤生長(zhǎng)，或如 下使雜交瘤在動(dòng)物的腹腔內(nèi)增殖。
[0162] 細(xì)胞培養(yǎng)法中，可W在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或無(wú)血 清培養(yǎng)基等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在通常的培養(yǎng)條件（例如37C，5%C〇2濃度）下培 養(yǎng)雜交瘤7~14天，從其培養(yǎng)上清中獲得抗體。
[0163] 腹水形成法的情況下，在與骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源的哺乳動(dòng)物同種系動(dòng)物的腹腔內(nèi)給予 約IX1〇7個(gè)雜交瘤，使雜交瘤大量增殖。并且，優(yōu)選在2~3周后提取腹水。
[0164] 在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時(shí)，可W通過(guò)適當(dāng)選擇或組合硫酸饋 鹽析法、離子交換層析、凝膠過(guò)濾、親和層析等公知方法來(lái)進(jìn)行純化。
[016引 （3-W具有抗腫瘤活性的克隆的挑選
[0166] 本發(fā)明的抗hD化-1抗體是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗體。
[0167] 該里，"抗腫瘤活性"是指使腫瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）死亡的活性或抑制腫瘤生長(zhǎng)的活 性。本發(fā)明中，作為抗腫瘤活性，例如可優(yōu)選舉出腫瘤血管生成抑制活性。而且，作為本發(fā)明 的抗體可W發(fā)揮抗腫瘤活性的人腫瘤（腫瘤細(xì)胞）的種類(lèi)，可W舉出已確認(rèn)hD化-1的表達(dá) 的前述公知的人腫瘤（具體而言，實(shí)體癌有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 1型神經(jīng)纖維瘤病、小細(xì)胞肺癌、肝癌、腎癌和卵巢癌等，血癌有骨髓發(fā)育異常綜合征和急性 髓系白血病等。）和本發(fā)明人新確認(rèn)hD化-1的表達(dá)的人大腸癌、人乳腺癌和人膜臟癌。其 中尤其可優(yōu)選舉出人大腸癌、人乳腺癌、人膜臟癌、人肝癌、人小細(xì)胞肺癌和人神經(jīng)母細(xì)胞 瘤中的1種或2種W上。
[016引體內(nèi)的抗腫瘤活性的確認(rèn)，例如可W使用在小鼠的皮下移植了所希望的腫瘤細(xì)胞 的荷瘤小鼠，通過(guò)對(duì)該小鼠給予前述獲得的抗體來(lái)進(jìn)行。此時(shí)，抗體的給藥可W在腫瘤細(xì)胞 的移植后立即進(jìn)行（預(yù)防模型），也可W在確認(rèn)移植腫瘤達(dá)到預(yù)定體積之后進(jìn)行（治療模 型）。給藥方法并沒(méi)有限制，例如可W3天1次，W20mg/kg體重進(jìn)行腹腔內(nèi)給藥。預(yù)防模 型的情況下，可W通過(guò)腫瘤形成頻率和腫瘤體積評(píng)價(jià)抗腫瘤活性的有無(wú)和水平。治療模型 的情況下，可W根據(jù)腫瘤體積和腫瘤重量評(píng)價(jià)抗腫瘤活性的有無(wú)和水平。
[0169] 本發(fā)明中，作為在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hD化-1抗體，例如可W優(yōu)選舉出由保 藏號(hào)為陽(yáng)RMBP-11337的雜交瘤產(chǎn)生的抗hD化-1單克隆抗體（克隆名；BA-1-3D)、由保藏 號(hào)為陽(yáng)RMBP-10707的雜交瘤產(chǎn)生的抗hD化-1單克隆抗體（克隆名；M3-1)、由保藏號(hào)為 陽(yáng)RMBP-10899的雜交瘤產(chǎn)生的抗hD化-1單克隆抗體（克隆名；DI-2-14)、和由保藏號(hào)為 陽(yáng)RMBP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的抗hD化-1單克隆抗體（克隆名；DI-6)等。
[0170] 此處，保藏號(hào)為陽(yáng)RMBP-11337的雜交瘤命名為"Mouse-Mousehybridoma BA-1-3D"，于2011年2月1日保藏，保藏號(hào)為陽(yáng)RMBP-10707的雜交瘤命名為"Mouse-Mouse hybridoma;M3-r，，于2006年10月18日保藏，保藏號(hào)為陽(yáng)RMBP-10899的雜交瘤命名為 "Mouse-MousehybridomaDI-2-14"，于 2007 年 8 月 21 日保藏，保藏號(hào)為陽(yáng)RMBP-10900 的雜交瘤稱(chēng)為"Mouse-MousehybridomaDI-6",于2007年8月21日保藏，均保藏于獨(dú)立行 政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中也（干305-8566茨城縣筑波市東1-1-1中央 第6)。
[0171] 另外，作為本發(fā)明的抗hD化-1抗體，例如可優(yōu)選舉出H鏈V區(qū)域的CDR1~3的氨 基酸序列依次分別為序列號(hào)16~18所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的CDR1~3的 氨基酸序列依次分別為序列號(hào)23~25所示的氨基酸序列的抗體。作為上述H鏈V區(qū)域， 例如，優(yōu)選序列號(hào)13所示的氨基酸序列、尤其是序列號(hào)15所示的氨基酸序列（成熟膚）構(gòu) 成的區(qū)域，作為上述L鏈V區(qū)域，例如，優(yōu)選序列號(hào)20所示的氨基酸序列、尤其是序列號(hào)22 所示的氨基酸序列（成熟膚）構(gòu)成的區(qū)域。
[0172] 而且，作為本發(fā)明的抗hD化-1抗體，例如還可優(yōu)選列舉與由保藏號(hào)為陽(yáng)RM BP-11337、陽(yáng)RMBP-10707、陽(yáng)RMBP-10899、或陽(yáng)RMBP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體 所結(jié)合（識(shí)別）的部位（例如表位）結(jié)合的抗hD化-1抗體。
[0173] (3-6)抗hD化-1抗體的表位
[0174] 本發(fā)明的抗hD化-1抗體的表位（抗原決定簇）只要是抗原h(huán)D化-1的至少一部分 即可，并沒(méi)有限制，例如，優(yōu)選為序列號(hào)2所示的hD化-1的氨基酸序列中的第24位~第91 位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域（含有hD化-1的EGF-1~EGF-2的區(qū)域）、第92位~第167位的 氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域（含有hD化-1的EGF-3~EGF-4的區(qū)域）、或第131位~第244位的 氨基酸構(gòu)成的區(qū)域（含有hD化-1的EGF-4~EGF-6的區(qū)域）中的至少一部分。其中更為 優(yōu)選含有hD化-1的EGF-1~EGF-2的區(qū)域。識(shí)別該區(qū)域（與該區(qū)域結(jié)合）的抗hD化-1抗 體，例如，對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化活性高，在后述的免疫結(jié)合物等用途中極為有用。
[01巧](4)基因重組抗體和抗體片段
[0176] (4-1)基因重組抗體
[0177] 作為本發(fā)明的抗hD化-1抗體的優(yōu)選方式之一，可W舉出基因重組抗體。作為基因 重組抗體，沒(méi)有限制，但例如可W舉出嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等。
[0178] 嵌合抗體（即人源化嵌合抗體）是小鼠源抗體的可變區(qū)連接到（接合）人來(lái)源的 恒定區(qū)的抗體（參照Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.駐，6851-6855,（1984)等），在制作嵌合 體時(shí)，為了獲得該樣連結(jié)的抗體，可W通過(guò)基因重組技術(shù)容易地構(gòu)建。其中，作為小鼠源抗 體的可變區(qū)，H鏈V區(qū)域例如優(yōu)選序列號(hào)13所示的氨基酸序列、尤其是序列號(hào)15所示的氨 基酸序列（成熟膚）構(gòu)成的區(qū)域，L鏈V區(qū)域例如優(yōu)選序列號(hào)20所示的氨基酸序列、尤其 是序列號(hào)22所示的氨基酸序列（成熟膚）構(gòu)成的區(qū)域。
[0179] 在制作人源化抗體時(shí)，通過(guò)從小鼠抗體的可變區(qū)將互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR)移植到人 可變區(qū)，框架區(qū)（FR)為人來(lái)源，CDR由小鼠來(lái)源的CDR構(gòu)成，制備重構(gòu)的可變區(qū)（即CDR移植 (CDRgrafting))。然后，將該些人源化的重構(gòu)的人可變區(qū)與人恒定區(qū)連結(jié)。此處，作為人源 化的重構(gòu)的人可變區(qū)，H鏈V區(qū)域優(yōu)選例如序列號(hào)33所示的氨基酸序列、尤其是序列號(hào)35 所示的氨基酸序列（成熟膚）構(gòu)成的區(qū)域，或者優(yōu)選序列號(hào)38所示的氨基酸序列、尤其是 序列號(hào)40所示的氨基酸序列（成熟膚）構(gòu)成的區(qū)域，L鏈V區(qū)域例如優(yōu)選序列號(hào)43所示的 氨基酸序列、尤其是序列號(hào)45所示的氨基酸序列（成熟膚）構(gòu)成的區(qū)域。該些人源化抗體 的制作方法可W參照例如化化re,巡1，522-525(1986) ；J.Mol.Biol. , 1%, 901-917 (1987)； QueenCetal.，Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 86:10029-10033 (1989);日本特表平 4-502408 號(hào)公報(bào)（日本專(zhuān)利第2828340號(hào)公報(bào)；Queen等人）等。此處，作為可W在本發(fā)明的人源化 抗hD化-1抗體中使用的小鼠來(lái)源的CDR序列，沒(méi)有限制，例如，作為H鏈V區(qū)域的CDR1~ 3,可優(yōu)選舉出（依次分別）序列號(hào)16~18所示的氨基酸序列，作為L(zhǎng)鏈V區(qū)域的CDR1~ 3,可優(yōu)選舉出（依次分別）序列號(hào)23~25所示的氨基酸序列。
[0180] 進(jìn)而，本發(fā)明中，還包括將上述人源化抗體的H鏈或L鏈的V區(qū)域的一部分（CDR 序列除外）的氨基酸（優(yōu)選1個(gè)~多個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)~2個(gè)氨基酸）置換為其它氨基酸的 改變型的氨基酸。
[0181] 作為改變型的氨基酸，例如，優(yōu)選將上述人源化抗體的H鏈V區(qū)域（CDR序列除外） 的1個(gè)或2個(gè)氨基酸置換為其它氨基酸的氨基酸。作為被如此置換的氨基酸，例如，可優(yōu)選 舉出H鏈V區(qū)域
[0182](1-1)由序列號(hào)67所示的氨基酸序列（堿基序列為序列號(hào)66)、尤其是序列號(hào)69 所示的氨基酸序列（成熟膚）（堿基序列為序列號(hào)68)構(gòu)成的氨基酸序列、
[0183](1-2)由序列號(hào)71所示的氨基酸序列（堿基序列為序列號(hào)70)、尤其是序列號(hào)73 所示的氨基酸序列（成熟膚）（堿基序列為序列號(hào)72)構(gòu)成的氨基酸序列、
[0184](1-3)由序列號(hào)75所示的氨基酸序列（堿基序列為序列號(hào)74)、尤其是序列號(hào)77 所示的氨基酸序列（成熟膚）（堿基序列為序列號(hào)76)構(gòu)成的氨基酸序列、
[0185](2-1)由序列號(hào)79所示的氨基酸序列（堿基序列為序列號(hào)78)、尤其是序列號(hào)81 所示的氨基酸序列（成熟膚）（堿基序列為序列號(hào)80)構(gòu)成的氨基酸序列、
[0186] (2-2)由序列號(hào)83所示的氨基酸序列（堿基序列為序列號(hào)82)、尤其是序列號(hào)85 所示的氨基酸序列（成熟膚）（堿基序列為序列號(hào)84)構(gòu)成的氨基酸序列、
[0187] (2-3)由序列號(hào)87所示的氨基酸序列（堿基序列為序列號(hào)86)、尤其是序列號(hào) 89所示的氨基酸序列（成熟膚）（堿基序列為序列號(hào)88)構(gòu)成的氨基酸序列等，更優(yōu)選為 (1-：3)和（2-如的氨基酸序列。如此H鏈V區(qū)域被改變?yōu)樯鲜觯?-1)~（2-如中的任一種 氨基酸序列且L鏈V區(qū)域由前述序列號(hào)43所示的氨基酸序列、尤其是序列號(hào)45所示的氨 基酸序列（成熟膚）構(gòu)成的改變?nèi)嗽椿筯D化-1抗體是親合力（Avid