miR-24作為血漿/血清miRNA檢測的內參基因的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及miR-24作為血漿/血清miRNA檢測的內參基因的應用。
【背景技術】
[0002] MicroRNAs(即miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約18-24個核苷酸的非編碼小RNA， 在基因組中占1-3%，但預計其可以調控30%的基因表達。miRNA首先在細胞核內由RNA聚 合酶II轉錄生成pri-miRNA，pri-miRNA經Drosha核酸酶處理生成70個核苷酸左右的 pre-miRNA，并通過Exportin-5依賴的轉運機制運送至胞楽。在胞楽中pre-miRNA經Dicer 核酸酶進一步剪切成為成熟的miRNA。成熟miRNA以互補配對的方式與靶mRNA的3'-UTR 區(qū)、5'-UTR區(qū)甚至開放讀碼框結合，造成靶mRNA的降解或轉錄抑制。MiRNA的互補配對并非 絕對互補，因此同一個miRNA可以調控多個mRNA，同時同一個位點也可能同時受多個miRNA 調控。
[0003] 目前大量文獻證實miRNA涉及生理、病理，包括增殖、分化、遷移、凋亡等幾乎所有 過程，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切關聯(lián)，同時在這些疾病中都檢測到其與正常組織的差異 表達情況，因此miRNA已經成為包括腫瘤在內的多種疾病的診斷、分型以及預后的候選標 志物。
[0004] 血液游離核酸作為疾病標志物始于1948年。由于核酸檢測手段多樣，定量簡便， DNA和RNA相繼成為研究熱點。但DNA特異性較差且不能實時反應變化情況，而RNA在血液 中非常容易降解，不夠穩(wěn)定。MiRNA作為新興研究熱點，具有在血清/血漿中穩(wěn)定性好，對酸 堿、反復凍融（10次)、常溫放置（24小時)以及RNA酶等均不敏感的特性，表達穩(wěn)定。血液游 離miRNA來源非常復雜，包括血細胞miRNA釋放，組織細胞中直接滲出miRNA等，在癌癥患 者中還包括腫瘤組織胞外體和超微小泡的外泌作用釋放miRNA等，無論其來源如何，血液 游離miRNA以其表達穩(wěn)定、易檢測、具有疾病特異性等特點成為優(yōu)質血液來源生物標志物。
[0005] 目前研究人員常用于血清/血漿控制miRNA表達差異的方法有三種：一是利用所 有可檢測到的miRNA的平均值作為參照；二是利用血清/血漿總體積作為參照；三是利用 外源添加的非人類定量miRNA作為參照。以上方法都解決了部分差異控制的問題，但都存 在一定的缺陷：第一種方法僅限于高通量的檢測平臺，如高通量測序、miRNA芯片等技術， 在低通量檢測平臺檢測少量特定的miRNA時無法使用；第二、三種方法可以有效控制實驗 技術帶來的差異，但無法控制個體本身的生物學差異。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供miR-24作為血漿/血清miRNA檢測的內參基因的應用。
[0007] 本發(fā)明要求保護miR-24作為內參基因的應用。
[0008] 所述應用中，所述miR-24具體作為血漿或血清中miRNA檢測的內參基因。
[0009] 所述應用中，所述miR-24具體作為單獨的內參基因（即無需與其他內參基因組合 使用）。
[0010] 本發(fā)明還保護一種檢測血漿或血清中miRNA的相對表達量的方法，包括如下步 驟：
[0011] (1)提取待測血漿或血清的總RNA并反轉錄為CDNA;
[0012] (2)以步驟（1)獲得的cDNA為模板，分別檢測其中目的miRNA的編碼序列的含量 和miR-24的編碼序列的含量；
[0013] (3)根據(jù)步驟（2)的結果，以所述miR-24為內參基因，計算目的miRNA的相對表達 i 里〇
[0014] 所述方法應用于非治療目的和非診斷目的。
[0015] 本發(fā)明還要求保護用于檢測血漿或血清中miR-24的物質的應用；所述應用為：以 miR-24為內參基因，檢測其它miRNA相對于所述內參基因在血漿或血清中的相對表達量。
[0016] 本發(fā)明還要求保護用于檢測血漿或血清中miR-24的物質在制備試劑盒中的應 用；所試劑盒的用途為：以miR-24為內參基因，檢測其它miRNA相對于所述內參基因在血 漿或血清中的相對表達量。
[0017] 本發(fā)明還保護一種試劑盒,含有用于檢測血漿或血清中miR-24的物質；所試劑盒 的用途為：以miR-24為內參基因，檢測其它miRNA相對于所述內參基因在血漿或血清中 的相對表達量。所述試劑盒可為基于real-timePCR的試劑盒，如基于Taqman探針法的 real-timePCR試劑盒或基于突光染料法的real-timePCR試劑盒。
[0018] 以上任一所述miR-24如序列表的序列1所示。
[0019] 以上任一所述血漿或血清可來源于結直腸癌患者、肺癌患者或健康人。
[0020] 采用miR-24為內參基因可以實現(xiàn)不同實驗室間研究結果的比較，促進各實驗結 果的歸一化處理，進而促進血清/血漿miRNA研究結果向臨床成果轉化，為臨床醫(yī)生提供更 加精確的診斷、分型、預后判斷以及個體化治療的有力工具。
[0021] miRNA作為新型生物標志物，在血清/血漿中受內外因素干擾較小、表達穩(wěn)定、檢 測手段多樣、定量檢測精確。因此以miRNA作為血清/血漿中的內參基因有助于外周血標 志物在診斷、分型以及預后等方面的價值轉化以及不同實驗室間檢測結果的對比。以單個 miRNA作為血清或血漿中的內參基因，適用于高、低通量的檢測平臺，對于大規(guī)模臨床檢測 應用，降低了操作難度，簡化了操作流程。
【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。miR為單鏈RNA，實施例中提供的各個miR的序列均為5' 一 3'方向。
[0023] 實施例1、通過TLDA芯片篩選候選內參基因
[0024] 利用TLDA芯片分別檢測已經醫(yī)院確診但未經任何治療的結直腸癌患者、肺癌患 者和健康人的血漿miRNA的表達譜及含量，分析不同病例和對照間miRNA表達的穩(wěn)定性和 表達量，篩選得到穩(wěn)定高表達的miRNA作為候選內參miRNA。
[0025] 1、血漿樣本的制備
[0026] 分別采集已經醫(yī)院確診但未經任何治療的結直腸癌患者（49人)、肺癌患者（6人） 和健康人（58人）的血漿。
[0027] 將結直腸癌患者分為5組，相關信息見表1。 [0028] 表1結直腸癌患者的信息
【主權項】
1. miR-24作為內參基因的應用；所述miR-24如序列表的序列1所示。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于：所述應用中，所述miR-24作為血漿或血清 中miRNA檢測的內參基因。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于：所述應用中，所述miR-24作為單獨的 內參基因。
4. 一種檢測血漿或血清中miRNA的相對表達量的方法，包括如下步驟： (1)提取待測血漿或血清的總RNA并反轉錄為cDNA ; (2)以步驟（1)獲得的cDNA為模板，分別檢測其中目的miRNA的編碼序列的含量和 miR-24的編碼序列的含量；所述miR-24如序列表的序列1所示； (3)根據(jù)步驟（2)的結果，以所述miR-24為內參基因，計算目的miRNA的相對表達量。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法應用于非治療目的和非診斷目的。
6.用于檢測血漿或血清中miR-24的物質的應用；所述應用為：以miR-24為內參基因， 檢測其它miRNA相對于所述內參基因在血漿或血清中的相對表達量；所述miR-24如序列表 的序列1所示。
7.用于檢測血漿或血清中miR-24的物質在制備試劑盒中的應用；所試劑盒的用途為： 以miR-24為內參基因，檢測其它miRNA相對于所述內參基因在血漿或血清中的相對表達 量；所述miR-24如序列表的序列1所示。
8. -種試劑盒，含有用于檢測血漿或血清中miR-24的物質；所試劑盒的用途為：以 miR-24為內參基因，檢測其它miRNA相對于所述內參基因在血漿/血清中的相對表達量； 所述miR-24如序列表的序列1所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了miR-24作為血漿/血清miRNA檢測的內參基因的應用。本發(fā)明還保護一種檢測血漿或血清中miRNA的相對表達量的方法，包括如下步驟：（1）提取待測血漿或血清的總RNA并反轉錄為cDNA；（2）以步驟（1）獲得的cDNA為模板，分別檢測其中目的miRNA的編碼序列的含量和miR-24的編碼序列的含量；（3）根據(jù)步驟（2）的結果，以所述miR-24為內參基因，計算目的miRNA的相對表達量。采用miR-24為內參基因可以實現(xiàn)不同實驗室間研究結果的比較，促進各實驗結果的歸一化處理，進而促進血清/血漿miRNA研究結果向臨床成果轉化，為臨床醫(yī)生提供更加精確的診斷、分型、預后判斷以及個體化治療的有力工具。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104711338
【申請?zhí)枴緾N201310681099
【發(fā)明人】孫義民, 凌兵, 郭素堂, 陳照麗, 李耀平, 赫捷, 邢婉麗, 程京
【申請人】博奧生物集團有限公司, 清華大學, 山西省腫瘤醫(yī)院, 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2013年12月12日