一株產(chǎn)吡咯喹啉醌的生絲微菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)吡咯喹啉醌的生絲微菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]吡略喹啉醌（pyrroloquinolinequinone，PQQ)是一種紅褐色的見光易分解、熱 穩(wěn)定的水溶性鄰位醌類化合物，是繼NAD/NADP和FMN/FAD之后發(fā)現(xiàn)的第3種氧化還原酶 (oxidordeuctase)的輔酶，參與呼吸鏈電子傳遞。PQQ的研宄最早可追溯到1959年Hauge 發(fā)現(xiàn)醋酸媽不動(dòng)桿菌（Acinetobactercalcoaceticus)的葡萄糖脫氫酶活性不依賴于P比啶 核苷酸和黃素核苷酸，而是依賴一種新的可分離的輔酶。1979年，Duine等采用電子自旋共 振、核磁共振和質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)這種輔酶為鄰位醌類化合物。隨后，SaliSbury(1979年）采用X射 線晶體衍射技術(shù)闡明了該輔酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并正式命名為吡咯喹啉醌。
[0003] PQQ廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，在人和動(dòng)、植物體內(nèi)也均有微量存在，具有促進(jìn) 機(jī)體生長(zhǎng)、防護(hù)肝損傷、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子合成、調(diào)節(jié)機(jī)體自由基水平、提高細(xì)菌對(duì)毒性和 輻射等極端條件的耐受性等功能，是一種獨(dú)特的生理活性物質(zhì)，在食品和醫(yī)藥保健領(lǐng)域具 有重要的開發(fā)前景。PQQ的早期生產(chǎn)方法以化學(xué)合成法為主，但其合成步驟繁雜，產(chǎn)率低， 副產(chǎn)物多，純化成本高。微生物發(fā)酵法以無(wú)機(jī)培養(yǎng)基為主，成本低，產(chǎn)率較高且利于純化，是 PQQ的主要產(chǎn)業(yè)化方向。
[0004] 迄今為止，能夠產(chǎn)生PQQ的生物僅限于某些革蘭氏陰性細(xì)菌，哺乳動(dòng)物自身不能 合成只能從外界攝入。不同細(xì)菌的PQQ合成量差距十分明顯，有的細(xì)菌只生成微量的PQQ， 以滿足自身正常的生理代謝需求，如假單胞菌屬（Pseudomonas)、微環(huán)菌屬（Microcyclus) 和枝動(dòng)桿菌屬（Mycoplana)等；有的細(xì)菌能產(chǎn)生過(guò)量PQQ，如交替單胞菌屬（Alteromonas)、 嗜甲基菌屬（Methylophilus)和生絲微菌屬（Hyphomicrobium)等，其中甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌 的PQQ生物合成水平最高，且能分泌至細(xì)胞外。目前已報(bào)道的野生菌株，其PQQ產(chǎn)量較低， 均在10mg/L以下。食甲基菌Methylovorussp.MP688經(jīng)過(guò)培養(yǎng)體系優(yōu)化，在7. 5L發(fā)酵罐 上的PQQ產(chǎn)量可達(dá)2g/L，是目前已報(bào)道的產(chǎn)量最高的野生菌株。生絲微菌Hyphomicrobium denitrificansFJNU-6培養(yǎng)88h發(fā)酵液中PQQ產(chǎn)量達(dá)到121mg/L，而蛋白含量只有32mg/ L(楊詩(shī)穎，陳佳，柯崇榕，黃建忠.吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌的篩選及其培養(yǎng)基優(yōu)化.藥物生物技 術(shù)，2014, 21 (5) : 429~432)。而PQQ的具體合成途徑尚未徹底闡明，代謝調(diào)控機(jī)制不清，通 過(guò)基因工程改造存在較大難度。MethylobacteriumextorquensAM1經(jīng)過(guò)基因改造后的產(chǎn) 量也只有114mg/L，是已報(bào)道的產(chǎn)量最高的基因工程菌株。此外，PQQ作為輔酶易與培養(yǎng)液 中的氨基酸發(fā)生不可逆的反應(yīng)形成穩(wěn)定的無(wú)活性惡唑類化合物，會(huì)造成產(chǎn)量急劇下降。因 此，篩選胞外蛋白含量低且產(chǎn)量較高的菌株是微生物發(fā)酵生產(chǎn)PQQ進(jìn)行工業(yè)化的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的產(chǎn)量和/ 或降低發(fā)酵液中的蛋白含量。
[0006] 為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一株脫氮生絲微菌（Hyphomicrobium denitrificans)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10620。
[0007] 為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的脫 氮生絲微菌；
[0008] 所述菌劑為用于產(chǎn)生吡咯喹啉醌的菌劑。
[0009] 為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供所述的脫氮生絲微菌或所述的菌劑在生產(chǎn) 吡咯喹啉醌中的應(yīng)用。
[0010] 為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，包括將所述 的脫氮生絲微菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到吡咯喹啉醌。
[0011] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)為甲醇、 無(wú)機(jī)氮源、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、微量元素液、維生素輔液，溶劑為水；所述甲 醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10-15g/L、所述無(wú)機(jī)氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 2_6g/L、所述磷酸二氫鉀在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1. 2-3. 5g/L、所述磷酸氫二鈉在所 述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為4-8g/L、所述硫酸鎂在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l-3g/L、所述 微量元素液在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l_5mL/L、所述維生素輔液在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中 的濃度為l_3mL/L，pH6. 8-7. 0 ;
[0012] 所述微量元素液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)為硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅、氯 化鈉、鉬酸鈉、氯化鉀、氯化鈷、硼酸和氯化鈣，溶劑為水；所述硫酸亞鐵在所述微量元素液 中的濃度為80g/L，所述硫酸鋅在所述微量元素液中的濃度為22. 5g/L，所述硫酸錳在所述 微量元素液中的濃度為40g/L，所述硫酸銅在所述微量元素液中的濃度為5g/L，所述氯化 鈉在所述微量元素液中的濃度為15g/L，所述鉬酸鈉在所述微量元素液中的濃度為0. 3g/ L，所述氯化鉀在所述微量元素液中的濃度為0. 3g/L，所述氯化鈷在所述微量元素液中的濃 度為0. 03g/L，所述硼酸在所述微量元素液中的濃度為3g/L，所述氯化鈣在所述微量元素 液中的濃度為300g/L;
[0013] 所述維生素輔液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)為核黃素、鹽酸吡哆素、鹽酸硫胺素、葉 酸、煙酸、對(duì)氨基苯甲酸、泛酸鈣、生物素和肌醇，溶劑為水；所述核黃素在所述維生素輔液 中的濃度為200g/L，所述鹽酸吡哆素在所述維生素輔液中的濃度為400g/L，所述鹽酸硫胺 素在所述維生素輔液中的濃度為400g/L，所述葉酸在所述維生素輔液中的濃度為2g/L，所 述煙酸在所述維生素輔液中的濃度為400g/L，所述對(duì)氨基苯甲酸在所述維生素輔液中的濃 度為200g/L，所述泛酸鈣在所述維生素輔液中的濃度為400g/L，所述生物素在所述維生素 輔液中的濃度為2g/L，所述肌醇在所述維生素輔液中的濃度為2000g/L;
[0014] 所述無(wú)機(jī)氮源具體為硫酸銨；
[0015] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)為甲醇、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸 氫二鈉、硫酸鎂、微量元素液、維生素輔液，溶劑為水；所述甲醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為10g/L、所述硫酸銨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2g/L、所述磷酸二氫鉀在所述發(fā)酵 培養(yǎng)基中的濃度為3. 5g/L、所述磷酸氫二鈉在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L、所述硫酸 鎂在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1. 5g/L、所述微量元素液在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 1. 2mL/L、所述維生素輔液在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2mL/L，pH6. 8。
[0016] 上述任一所述的方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件如下：溫度25-32°C、溶氧多20%、 pH為6. 7-7. 2、當(dāng)發(fā)酵液中的甲醇濃度降到lg/L時(shí)添加甲醇，使甲醇濃度為3-5g/L;
[0017] 所述發(fā)酵液包含所述脫氮生絲微菌和所述發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0018] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基占所述發(fā)酵時(shí)所用發(fā)酵罐裝液量的2/3-3/4,具體為7/10 ;
[0019] 所述溫度具體為30°C;
[0020] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150-600rpm，具體為250rpm;
[0021] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0? 3-0. 6vvm;
[0022] 所述pH具體是通過(guò)氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)的。
[0023] 上述任一所述的方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為4-6天。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述脫氮生絲微菌是通過(guò)種子液接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn) 行所述發(fā)酵培養(yǎng)的。
[0025] 上述任一所述的方法中，所述種子液是將所述的脫氮生絲微菌在種子培養(yǎng)基中培 養(yǎng)得到的：
[0026] 所述種子培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)為甲醇、無(wú)機(jī)氮源、磷酸二氫鉀、磷酸 氫二鈉、硫酸鎂，溶劑為水；所述甲醇在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為5-10g/L，所述無(wú)機(jī)氮 源在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為2_4g/L，所述磷酸二氫鉀在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為 0. 8-2. 4g/L，所述磷酸氫二鈉在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為3-6g/L，所述硫酸鎂在所述種 子培養(yǎng)基中的濃度為l_3g/L，pH6. 8-7. 0;
[0027] 所述種子液是按照體積比1% -5%接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的，具體是按照體積 比5%接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的；
[0028] 所述無(wú)機(jī)氮源具體為硫酸銨；
[0029] 所述種子培養(yǎng)基具體由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)為甲醇、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸 氫二鈉、硫酸鎂，溶劑為水；所述甲醇在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為6g/L，所述硫酸銨在所 述種子培養(yǎng)基中的濃度為2. 5g/L，所述磷酸二氫鉀在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為1. 4g/L， 所述磷酸氫二鈉在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為3g/L，所述硫酸鎂在所述種子培養(yǎng)基中的濃 度為lg/L，pH6.8-7.2。
[0030] 上述任一所述的方法中，所述種子液為將所述的脫氮生絲微菌在所述種子培養(yǎng)基 中進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，得到一級(jí)種子液；再將所述一級(jí)種子液在所述種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)培 養(yǎng)，得到的二級(jí)種子液；
[0031] 所述一級(jí)培養(yǎng)的條件為25-32°C培養(yǎng)24-36小時(shí)，具體為32°C培養(yǎng)24-36小時(shí)；
[0032] 所述一級(jí)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150-220rpm，具體為220rpm;
[0033] 所述一級(jí)種子液的0065(|在2. 5-3. 0之間，以所述種子培養(yǎng)基調(diào)零；
[0034] 所述二級(jí)培養(yǎng)的條件為25-32°C培養(yǎng)24-36小時(shí)、空氣流量4-7L/min，具體為30°C 培養(yǎng)24-36小時(shí)，空氣流量5L/min;
[0035] 所述二級(jí)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為400-600rpm，具體為500rpm;
[0036] 所述二級(jí)種子液的(?65(|在4. 0-5. 0之間，以所述種子培養(yǎng)基調(diào)零；
[0037] 所述一級(jí)種子液是按照體積比1% -3%接種到所述種子培養(yǎng)基中進(jìn)行所述二級(jí) 培養(yǎng)的，具體是按照體積比1%接種到所述種子培養(yǎng)基中進(jìn)行所述二級(jí)培養(yǎng)的；
[0038] 所述二級(jí)培養(yǎng)中，所述種子培養(yǎng)基占所述二級(jí)培養(yǎng)時(shí)所用發(fā)酵罐裝液量的 1/3-3/4,具體為 1/2。
[0039] 上述任一所述的無(wú)機(jī)氮源為硫酸銨、氯化銨和氨水中至少一種。
[0040] 本發(fā)明提供的一株產(chǎn)吡咯喹啉醌的生絲微菌FJNU-R8,其培養(yǎng)液中吡咯喹啉醌產(chǎn) 量較高，該菌株在以甲醇為碳源、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天，吡咯喹啉醌的產(chǎn)量 為150-350mg/L，且分泌的胞外蛋白含量較低，有利于吡咯喹啉醌的純化，發(fā)酵性能穩(wěn)定。本 發(fā)明提供的生絲微菌可以應(yīng)用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌中。
[0041] 保藏說(shuō)明
[0042] 菌種名稱：脫氮生絲微菌
[0043]拉丁名：Hyphomicrobiumdenitrificans
[0044]菌株編號(hào)：FJNU-R8
[0045] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0046] 保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CGMCC
[0047] 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
[0048] 保藏日期：2015年3月13日
[0049] 保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCCNo. 106