專(zhuān)利名稱(chēng)：吡咯并喹呤醌與氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)作用的研究方法
技術(shù)領(lǐng)域：
吡咯并喹呤醌與氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)作用的研究方法，屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卩比咯并喹呤醌，化學(xué)名稱(chēng)為4，5-二氫-4，5- 二氧化-1-氫吡咯(2，3f) 醌-2，7，9-三羧酸，又名methaxatin (PQQ)，是一種氧化還原酶輔基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳動(dòng)物之中，作為電子的供體可以參與機(jī)體氧化還原反應(yīng)及呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程。PQQ具有較強(qiáng)的自由基清除功能，對(duì)N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體(NMDA)介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒有神經(jīng)保護(hù)作用；PQQ與NMDA的氧化還原位點(diǎn)作用，減少由谷氨酸引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，在腦中促進(jìn)神經(jīng)因子產(chǎn)生和神經(jīng)保護(hù)作用；近年的研究表明PQQ對(duì)帕金森氏病有較好的防治作用；因而PQQ在神經(jīng)精神疾病方面，具有較重要的研究前景。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化有較大的關(guān)系。谷氨酸(Glu)和天門(mén)冬氨酸(Asp)是腦部重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，Y-氨基丁酸(GABA)及甘氨酸(Gly)是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，這些氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系。D構(gòu)象絲氨酸(Dser)作為一種新型神經(jīng)遞質(zhì)被認(rèn)為與NMDA受體過(guò)度興奮或表達(dá)下調(diào)相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。PQQ能與各種神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸發(fā)生反應(yīng)生成惡唑類(lèi)化合物，反應(yīng)式見(jiàn)下式。 它在神經(jīng)系統(tǒng)方面的重要功能可能與其對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸的作用有關(guān)，因此研究PQQ與神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸的反應(yīng)對(duì)研究其在神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制方面有極為重要的研究?jī)r(jià)值。本發(fā)明采用HPLC方法研究PQQ與Gly、Ser、Glu、ASp和GABA 5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定不同溫度、不同時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)剩余PQQ的濃度，研究PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、速率常數(shù)和活化能等數(shù)據(jù)，考察PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)能力，對(duì)研究PQQ在神經(jīng)保護(hù)方面的作用機(jī)制提供重要的研究?jī)r(jià)值，并在測(cè)定方法上加以改進(jìn)，采用的HPLC方法使PQQ與相應(yīng)的氨基酸達(dá)到了較好的分離。相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提出一種吡咯并喹呤醌與氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)作用的研究方法，研究 PQQ與神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸的反應(yīng)對(duì)研究其在神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制方面有極為重要的研究?jī)r(jià)值。本發(fā)明的技術(shù)方案吡咯并喹呤醌PQQ與氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)作用的研究方法，采用 HPLC方法研究PQQ與Gly、Dser, Glu、Asp及GABA 5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定不同溫度、不同時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)剩余PQQ的濃度，研究PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、速率常數(shù)和活化能數(shù)據(jù)，考察PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)能力；
PQQ與相應(yīng)的氨基酸反應(yīng)式為
權(quán)利要求
1.吡咯并喹呤醌PQQ與氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)作用的研究方法，其特征在于采用HPLC方法研究PQQ與Gly、Dser, Glu、Asp和GABA 5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定不同溫度、不同時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)剩余PQQ的濃度，研究PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、速率常數(shù)和活化能數(shù)據(jù)， 考察PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)能力；(1)HPLC分析條件采用C18反相色譜柱，型號(hào)Amethyst C18-P，5 μ m，4. 6X 250mm，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了改進(jìn)，A 乙腈；B :20mM磷酸二氫鉀、IOmM四丁基溴化銨、含0. 1%十二烷基磺酸鈉SDS、用磷酸調(diào) PH 為 4. 0-6. 0 ；A/B 的 ν/ν 為 35/65，流速 0. 8mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng) 249nm ；(2)波長(zhǎng)的確定稱(chēng)取一定量的PQQ、Gly、DSer、Glu、ASp、GABA，分別用pH 7. 0磷酸鹽緩沖液溶解，配制成PQQ溶液濃度為ImM，各氨基酸溶液濃度為25mM ；PQQ溶液與各氨基酸溶液分別按ν/ν為 1 1混合，避光，于37°C水浴孵育Mh，用pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液作空白進(jìn)行紫外光譜掃描， 紫外光譜圖顯示M9nm處各樣本紫外吸收較高；選擇M9nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；(3)pH值的影響選擇用分離度對(duì)pH作圖，pH為4. 0-6. 0分離度較高，PQQ與5種0XAZ0LE反應(yīng)物達(dá)到較好的分離；所述 5 種 0XAZ0LE :0X1 為 PQQ-Gly，0X2 為 PQQ-Dser，0X3 為 PQQ- Glu, 0X4 為 PQQ-Asp，0X5 為 PQQ- GABA ；(4)緩沖液中添加SDS對(duì)分離的影響在緩沖液中分別添加0. 05%,0. 1%、0. 15%、0. 2%SDS試驗(yàn)，當(dāng)SDS含量為0. 1%時(shí)，PQQ與 5種0XAZ0LE都能達(dá)到基線(xiàn)分離；(5)線(xiàn)性、精確度和檢測(cè)限測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的PQQ，用PH 7. 0磷酸鹽緩沖液配制成濃度為25mM的溶液，用相同緩沖液稀釋成0. 25^2. 5mM不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣，用積分面積對(duì)樣品濃度作圖，得回歸方程為A = 87503294C + 345390，R2 = 0. 9997，在0. 25 2. 5mM范圍內(nèi)成線(xiàn)性關(guān)系；在確定的色譜條件下于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積計(jì)算所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2. 4%， 保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0. 39%，最小檢出量為2. Ong ；(6)PQQ與5種氨基酸反應(yīng)剩余PQQ濃度的測(cè)定將PQQ溶液分別與5種氨基酸溶液按ν/ν為1:1混合反應(yīng)，避光，分別置于37、50°C孵育，于0. 5、1、2· 5、5、7. 5、10、24h各時(shí)間點(diǎn)抽取反應(yīng)液10 μ L，注入液相色譜儀，HPLC分析， 根據(jù)PQQ的峰面積和線(xiàn)性方程計(jì)算游離PQQ的濃度；(7)PQQ與5種氨基酸反應(yīng)速率常數(shù)和反應(yīng)級(jí)數(shù)的測(cè)定用各溫度、各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按下列公式計(jì)算各級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)一級(jí)反應(yīng)，
全文摘要
吡咯并喹呤醌與氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)作用的研究方法，屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用HPLC方法研究吡咯并喹呤醌PQQ與Gly、Dser、Glu、Asp和GABA5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定不同溫度、不同時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)剩余PQQ的濃度，研究PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、速率常數(shù)和活化能數(shù)據(jù)，考察PQQ與5種神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)能力。本發(fā)明建立的HPLC方法經(jīng)方法學(xué)研究，能夠用于PQQ與神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸反應(yīng)的研究，檢測(cè)限為0.05μM。文獻(xiàn)報(bào)道的毛細(xì)管電泳檢測(cè)PQQ與甘氨酸反應(yīng)，檢測(cè)限為0.1–0.2μM。反應(yīng)活化能的大小決定了反應(yīng)的難易程度，活化能越高，反應(yīng)越難進(jìn)行。EGABA＞EGlu＞EAsp＞EDser＞EGly，提高溫度有利于反應(yīng)的快速進(jìn)行。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102323340SQ20111015246
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者周杏琴, 張建康, 曹?chē)?guó)憲, 欽曉峰 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所