果，只添加酶制劑處理（En)的正十六烷和環(huán)十二烷的去除率分別達到36. 2%和32. 5%;添 加鐵離子促進了酶降解烷烴的活性，其中以加入Fe27Fe3+酶處理（En-Fe 27Fe3+)對烷烴的 降解效率最好，正十六烷和環(huán)十二烷的去除率達到了 48. 5%和45. 4%，較單獨酶制劑處理 去除率提高了 12. 3%和12. 9%。
[0035]實施例2、烷烴降解酶制劑對土壤中烷烴的降解
[0036] 1)烷烴降解酶制劑的制備
[0037] 選取烷烴高效降解菌株地衣芽孢桿菌進行種子液培養(yǎng)，將單克隆菌種接種到含有 烷烴的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于30°C，150rpm/min振蕩培養(yǎng)54h ;而后按體積百分比10%的 接種量將上述培養(yǎng)的菌種重新接種到含有烷烴的無機鹽液體培養(yǎng)基內(nèi)振蕩培養(yǎng)，于30°C發(fā) 酵到對數(shù)生長期（〇D 6CICI= 0. 6);將發(fā)酵液于8000rpm/min下離心5min收集菌體。
[0038] 收集的菌體用8倍體積的pH6.0的PBS緩沖液重懸菌體，然后進行超聲波破碎， 處理條件為200W功率下超聲5s，停止5s，超聲破碎時間為35min ;然后在4°C條件下，經(jīng) 8000rpm/min離心10min，取上清，即為燒徑降解酶制劑。
[0039] 含有烷烴的無機鹽液體培養(yǎng)基成分為：正十六烷0. 5g/L，環(huán)十二烷0. 3g/L，0. 5g/ L NaCl，0.2g/L MgS04,0.5g/L(NH4)2S04，1.5g/L K2HP04,0.5g/L KH2P04,0.05g/L CaCl2， 0? 02g/L FeS04,0? 002g/L 酵母粉，PH 值 7. 0。
[0040] 所述PBS緩沖液由16ml0. 2MNaH2P(VK溶液和84ml0. 2MNa2HP04水溶液混合制 成。
[0041]采用考馬斯亮藍法（Bradford法）測定酶制劑蛋白質(zhì)濃度，采用牛血清蛋白（BSA) 配制成標準蛋白質(zhì)溶液，依據(jù)外標法對粗酶蛋白濃度進行定量分析，經(jīng)測定，粗酶蛋白濃度 為 L45mg/L〇
[0042] 2)對土壤中烷烴的降解
[0043] 烷烴污染土壤中粗酶液降解活性測定反應體系為：3mg酶制劑、5g1% (W/W)濃度 烷烴污染土壤、適量0. 2M pH7. 5PBS緩沖液、濃度均為3mmol/L的Fe2+(FeS04)和Fe3+(FeCl 3) 以及濃度之和為3mmol/L的Fe27Fe3+(FeS0 4/FeCl3) (1:1)混合物，以只加酶液和只加PBS緩 沖液的反應體系作為對照，32°C反應4h，試驗重復三次。烷烴分離于遼河油田原油，采用柱 層析方法進行分離。
[0044] 土壤中混合烷烴的提取采用固相萃取方法，選用二氯甲烷作為萃取劑浸提三次， 脫水濃縮浸提至干后采用紅外分光光度法利用標準曲線進行定量測定。
[0045] 測定結(jié)果（圖2所示）表明：與只加PBS緩沖液處理PBS-CK相比，加酶制劑和鐵 離子處理（En、En-Fe2+、En-Fe3+和En-Fe 2+/Fe3+)對烷烴去除具有較好的效果，只添加酶制劑 處理（En)的對烷烴的去除率達到30. 6%;添加鐵離子促進了酶降解烷烴的活性，其中以加 入Fe27Fe3+酶處理（En-Fe 27Fe3+)對烷烴的降解效率最好，烷烴的去除率達到了47. 1%，較 單獨酶制劑處理去除率提高了16. 5%。
[0046] 實施例3、電動-烷烴降解酶制劑組合修復烷烴污染土壤
[0047] 1)按照實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)及超聲破碎方法進行高效降解菌培養(yǎng)及酶制劑的制 備。
[0048] 2)采用電動修復和烷烴降解酶制劑組合的修復模式進行烷烴污染土壤的降解修 復，土壤中烷烴的濃度為2% (W/W)，試驗過程如表1所示。烷烴分離于遼河油田原油，采用 柱層析方法進行分離。
[0049] 首先在切換電場的lV/cm電壓梯度下進行烷烴污染土壤的電動修復處理（圖3)， 前35天的烷烴去除率達到31. 1%，而后隨著處理時間延長降解作用顯著減弱；此時停止電 動修復進行烷烴降解酶制劑處理，同時添加PBS緩沖液繼續(xù)進行土壤烷烴降解處理作為對 照組，酶制劑處理4h后的烷烴去除率增加20. 4% ;隨后繼續(xù)以前述條件進行第二次電動處 理，處理組中修復效率顯著恢復，去除效率較第一次電動處理后期顯著加快且此快速降解 趨勢持續(xù)一定時間；對照組中電動修復效率稍有恢復但隨即再次降低。加酶電動處理組中 烷烴的總?cè)コ蔬_到70.6%，而對照組（未加酶處理）只達到44.4%。數(shù)據(jù)表明，在電動 修復過程中酶制劑的添加不僅加快烷烴降解速率和程度，同時為再次電動修復創(chuàng)造了良好 的土壤環(huán)境。
[0050] 表1試驗設計
[0051]
【主權(quán)項】
1. 一種烷烴降解酶制劑，其特征在于：烷烴降解酶制劑為經(jīng)破碎處理后的地衣芽孢桿 菌發(fā)酵培養(yǎng)物； 所述地衣芽孢桿菌（BacillusIicheniformis)已于2011年7月19日保藏在中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0:M2011261。
2. -種權(quán)利要求1所述的烷烴降解酶制劑的制備方法，其特征在于：將地衣芽孢桿菌 接種到含有烷烴的無機鹽液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體后超聲破碎即得烷烴降解酶制 劑。
3. 按權(quán)利要求2所述的烷烴降解酶制劑的制備方法，其特征在于：將體積百分比 5-10%的地衣芽孢桿菌接種于含有烷烴的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于25-301：，150-200印111/ min振蕩培養(yǎng)48-60h;而后按體積百分比5-8%的接種量將培養(yǎng)液接種到含有烷烴的無機 鹽液體培養(yǎng)基中，于25-28°C發(fā)酵到對數(shù)生長期；于6000-8000rpm/min下離心5-10min收 集菌體； 將收集的菌體用5-10倍體積的pH6. 0的PBS緩沖液重懸菌體，然后進行超聲波破碎， 超聲功率為200-500W，超聲破碎時間為25-35min;然后在2-8°C條件下，經(jīng)6000-8000rpm/ min離心5-10min，取上清液，S卩為燒徑降解酶制劑。
4. 按權(quán)利要求2或3所述的烷烴降解酶制劑的制備方法，其特征在于：所述含有烷烴 的無機鹽液體培養(yǎng)基組成為：正十六烷0. 5-2.Og/L，環(huán)十二烷0. 2-0. 5g/L，0. 5g/LNaCl， 0. 2g/LMgSO4, 0. 5g/L(NH4)2SO4,1. 5g/LK2HPO4,0. 5g/LKH2PO4, 0. 05g/LCaCl2,0. 02g/L FeSO4,0? 002g/L酵母粉，PH值 7. 0。
5. 按權(quán)利要求3所述的烷烴降解酶制劑的制備方法，其特征在于：所述PBS緩沖液由 16ml0.2mol/LNaH2PCVK溶液和 84ml0.2mol/LNa2HPO4水溶液混合制成。
6. -種權(quán)利要求1所述的烷烴降解酶制劑的應用，其特征在于：所述酶制劑作為污染 環(huán)境中的烷烴降解酶制劑，用于治理污染環(huán)境。
7. 按權(quán)利要求6所述的烷烴降解酶制劑的應用，其特征在于：所述酶制劑用于降解污 染水體或土壤中的烷烴。
8. 按權(quán)利要求7所述的烷烴降解酶制劑的應用，其特征在于：所述酶制劑中加入 2-4mmol/L的Fe2+或2-4mmol/L摩爾比為1:1的Fe2+/Fe3+，施用于污染水體或土壤中進行降 解烷烴，進而達到修復的目的。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術領域，涉及一種烷烴降解酶制劑及其制備方法和應用。烷烴降解酶制劑為經(jīng)破碎處理后的地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物，所述地衣芽孢桿菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:2011261。本發(fā)明烷烴降解酶制劑可以對烷烴進行降解，對受烷烴污染的土壤進行降解，降解速度顯著提高，較微生物降解速度提高40-60倍。本發(fā)明是一種效果好，見效快，成本低的烷烴去除的方法，在石油污染土壤修復領域具有很大的應用價值。CCTCC NO: M 201126120110719
【IPC分類】C02F101-32, C12R1-10, C02F3-34, C12N1-06, B09C1-10
【公開號】CN104762210
【申請?zhí)枴緾N201410804166
【發(fā)明人】李鳳梅, 郭書海, 王卅, 李剛
【申請人】中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2014年12月23日