專利名稱：一株茚并芘降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株茚并芘降解 菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上 苯環(huán)組成的有機(jī)化合物。人為源如燃料、汽油、垃圾等不完全燃燒導(dǎo)致環(huán)境中的PAHs逐漸 增加。由于PAH吸附性強(qiáng)、水溶性差、特殊而穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，很難被生物利用，致使它們?cè)?土壤環(huán)境中長期殘留，并呈現(xiàn)不斷積累的趨勢。PAHs具有潛在的致畸性、致癌性和基因毒 性，對(duì)環(huán)境和人類身體健康構(gòu)成極大的威脅，已引起世界各國的高度重視。生物降解是實(shí)現(xiàn) 恢復(fù)PAHs污染環(huán)境的最有效手段之一。一般來說，隨著多環(huán)芳烴苯環(huán)數(shù)量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多 環(huán)芳烴在環(huán)境中能較快被降解，在環(huán)境中存在的時(shí)間較短，而高分子量的多環(huán)芳烴則難于 降解，較長期存在于環(huán)境中。然而由于缺少高效的多環(huán)芳烴降解菌，制約了多環(huán)芳烴污染土 壤生物修復(fù)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。現(xiàn)有的微生物降解PAHs的研究普遍集中在低分子 量PAHs的降解微生物的篩選、分離與純化，而對(duì)于高效降解高分子量PAHs的微生物報(bào)道較 少。分離與純化高分子量PAHs高效降解菌是生物修復(fù)PAHs污染環(huán)境的關(guān)鍵。因此，需要從污染的環(huán)境中馴化篩選出對(duì)高分子量的多環(huán)芳烴(如茚并芘)降解 速率較快的微生物菌種，然后再把它們應(yīng)用于實(shí)際PAHs污染環(huán)境的生物治理，這對(duì)于治理 和修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株茚并芘降解菌及其應(yīng)用。所用菌株經(jīng)鑒定為Pandoraea sp.ATSB32。該菌株16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為EF397589. 1，將該菌株制成含菌量為 1. 25X 108CFU/ml的菌懸液，可用于環(huán)境中茚并芘的降解。從污染土壤中分離純化所述茚并芘降解菌的步驟如下(1)選取受石油污染的土壤，將其通過直徑為2mm的網(wǎng)篩后立即放置于4°C冰箱中 保存?zhèn)溆谩?2)向體積為IOOOmL的開口玻璃瓶中加入25 30mL濃度為lg/L的茚并芘的丙 酮混合溶液，為除去丙酮將玻璃瓶開口放置2天。(3)向步驟O)中開口玻璃瓶中加入500 600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為100r/min 的條件下攪拌40 50min后加入步驟(1)中的土壤250g ；然后置于溫度為25 30°C的 環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)30d，在培養(yǎng)期間定期向玻璃瓶中加 入基礎(chǔ)培養(yǎng)基以維持玻璃瓶中泥漿系統(tǒng)的水土比例保持不變；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為 NH4Cl :1. 5g · ΙΛ KH2PO4 :1. 5g · Λ MgCl2 :0. 25g · Λ CaCl2 · 2Η20 :0. IOg · Γ1。(4)向體積為100 200mL的錐形瓶中加入IOmL濃度為lg/L的茚并芘的丙酮混
3合溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。(5)向步驟中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0. 5mL微量金屬液和0. ImL維 生素 c 溶液；其中微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H20 :35mg · L-1，CuCl2 :0. 20mg · L-1，H3BO3 6. Omg · ΙΛ MnCl2 · 4H20 :25mg · Λ Na2MoO4 · 2H20 :3. Omg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. Omg · Λ ZnCl2 :2. 5mg · L-1。(6)向步驟(5)中的錐形瓶內(nèi)接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為 25 30°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天，每天打開瓶口一次以恢復(fù)錐形瓶內(nèi) 的溶解氧；按接種體積比為200 250 1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至( 處理后的錐 形瓶內(nèi)，當(dāng)轉(zhuǎn)接次數(shù)大于8之后即可獲得高效去除茚并芘的好氧降解菌群。(7)向體積為500mL的錐形瓶內(nèi)加入400mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1. OmL微量金屬液、0. ImL 維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用。(8)向體積為150mL的錐形瓶內(nèi)加入50mL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0. 60g 瓊脂，然后在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65 70°C時(shí)，在超凈 工作臺(tái)中將其倒入體積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在 超凈工作臺(tái)中放置2天。(9)在超凈工作臺(tái)中向步驟(8)中的培養(yǎng)皿中加入0. 5mL濃度為lg/L的茚并芘丙 酮溶液，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使茚并芘的丙酮溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的丙酮將 該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天。(10)向體積為25mL的錐形瓶內(nèi)加入IOmL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0. 25g 瓊脂，在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺(tái)中冷卻至38 40°C。(11)在超凈工作臺(tái)中向步驟(10)的錐形瓶中加入ImL步驟(6)得到的茚并芘好 氧降解菌群溶液，搖勻后吸取ImL慢慢加入步驟(9)中的培養(yǎng)皿中，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使 接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。將培養(yǎng)皿放入溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察， 10 15天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。(12)在超凈工作臺(tái)中挑取步驟(11)培養(yǎng)皿中的菌落，進(jìn)行重復(fù)分離，分離純化8 個(gè)周期以上即可得到能夠高效降解茚并芘的純菌種。本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠分離純化到對(duì)茚并芘降解性能好的微生物 菌種。
具體實(shí)施例方式向加入茚并芘和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的開口玻璃瓶內(nèi)加入受石油污染的土壤進(jìn)行茚并芘 降解微生物的富集與馴化，30d后向加入茚并芘、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及 吸附劑的錐形瓶內(nèi)接入富集馴化的土壤。在溫度為25 30°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器 中培養(yǎng)5 7天后，進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到高效去除茚并芘的降解 菌群。在超凈工作臺(tái)中制作以茚并芘為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底 層平板上制作含有茚并芘降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板在 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 15天。在超凈工作臺(tái)中向加入茚并芘、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素 c溶液及吸附劑的錐形瓶內(nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為25 30°C、轉(zhuǎn)速為IOOr/ min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到能夠降解茚并芘的純菌種。 運(yùn)用分離純化得到的降解茚并芘的菌種Pandoraea sp. ATSB32制成菌懸液，含菌 量為1. 25X 108CFU/ml，進(jìn)行降解茚并芘的降解試驗(yàn)。結(jié)果表明菌株P(guān)andoraea sp. ATSB32 能夠?qū)岵④胚M(jìn)行有效的降解，當(dāng)茚并芘的初始濃度為0. 25mg/L、l. 19mg/L、2. 27mg/L、 4. 17mg/L 時(shí)，25 天后的降解去除率分別為43. 8%,55. 04%,55. 57%,37. 49%。
權(quán)利要求
1.一株茚并芘降解菌，其特征在于，所述菌株經(jīng)鑒定為Pandoraea sp.ATSB32。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述茚并芘降解菌，其特征在于，該菌株16SrDNA的Genbank登錄 號(hào)為 EF397589. 1。
3.一種權(quán)利要求1所述茚并芘降解菌的應(yīng)用，其特征在于，菌懸液的含菌量為 1. 25X 108CFU/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一株茚并芘降解菌及其應(yīng)用。茚并芘降解菌經(jīng)鑒定為Pandoraea sp.ATSB32。該菌株16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為EF397589.1。將該菌株制成含菌量為1.25×108CFU/ml的菌懸液，對(duì)初始濃度分別為0.25mg/L、1.19mg/L、2.27mg/L、4.17mg/L的茚并芘在25天后的降解去除率分別為43.8％、55.04％、55.57％、37.49％。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102080055SQ20091022426
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者丁愛中, 杜勇超, 程莉蓉, 豆俊峰, 陳海英 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)