可調(diào)控芽孢生成的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及可調(diào)控芽孢生成的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，可 用于枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中芽孢生成的調(diào)控，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtiis)是一種好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細(xì)菌。該菌具有生 長迅速、營養(yǎng)需求簡單、能分泌表達(dá)多種酶和生物活性物質(zhì)等特性，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食 品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
[0003] 枯草芽孢桿菌是工業(yè)酶生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的菌種之一，例如，利用枯草芽孢桿菌表 達(dá)的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等被廣泛應(yīng)用于生物化工、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域?？莶菅挎邨U菌還 可被制成微生物菌劑，用于改善人體和動物腸道功能、疾病防治和促進(jìn)動物生長?？莶菅挎?桿菌還具有抑制植物病害的功能，可用于植物生防菌劑的生產(chǎn)。
[0004] 枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中有形成芽孢的特性，利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵生 產(chǎn)，針對目標(biāo)產(chǎn)物不同，需要調(diào)節(jié)發(fā)酵條件，以期獲得較高的菌體濃度或者芽孢濃度?？莶?芽孢桿菌芽孢的形成受多個基因的調(diào)控，在菌體生長時，這些基因一般不表達(dá)，它們可能被 一個阻遏體系所調(diào)控，一旦消除阻遏因素，芽孢即可生成，其中一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白AbrB，由 基因AbrB編碼。
[0005] 申請?zhí)枮?01110051406. 9、發(fā)明名稱為"一種高芽孢率的枯草芽孢桿菌發(fā)酵方法" 的中國專利和申請?zhí)枮?01210544003. 2、發(fā)明名稱為"一種高密度培養(yǎng)高芽孢率枯草芽孢 桿菌的方法"的中國專利均提供了獲得高芽孢率的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，枯草芽孢桿 菌芽孢率顯著提高，但是只涉及培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)以獲得較高 濃度的芽孢發(fā)酵液。目前尚未發(fā)現(xiàn)可調(diào)控枯草芽孢桿菌關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AbrB蛋白表達(dá)的的 基因工程枯草芽孢桿菌，以及利用該基因工程菌進(jìn)行高濃度芽孢發(fā)酵液的發(fā)酵方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供可調(diào)控芽孢生成的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建 方法，其優(yōu)選的AbrB基因是將原始AbrB (序列表SEQ ID NO. 1中所示序列）的第42位氨 基酸（天冬氨酸）突變?yōu)楸彼?，點突變的序列為AbrB-mutant(序列表SEQ ID NO. 2中所 示序列）。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供利用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌基因工程菌在發(fā)酵過程中 控制芽孢生成的應(yīng)用，從而獲得高濃度枯草芽孢桿菌菌體或者高濃度枯草芽孢桿菌芽孢。
[0008] 將調(diào)控枯草芽孢桿菌芽孢形成關(guān)鍵蛋白AbrB的基因AbrB或經(jīng)點突變的 AbrB-mutant插入到質(zhì)粒pDG148-stu上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌中， 即成本發(fā)明的枯草芽孢桿菌基因工程菌。利用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌基因工程菌進(jìn)行發(fā) 酵，發(fā)酵過程中可通過控制乳糖或者IPTG (異丙基--D-硫代半乳糖苷）濃度來調(diào)控枯草 芽孢桿菌芽孢的生成，從而獲得高濃度枯草芽孢桿菌菌體或者高濃度枯草芽孢桿菌芽孢。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0010] 一種可調(diào)控芽孢生成的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于該菌株通過誘導(dǎo)表 達(dá)AbrB蛋白調(diào)控芽孢的生成。
[0011] 該菌株可通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液中乳糖或者IPTG濃度對芽孢的生成進(jìn)行調(diào)控。
[0012] 該菌株含有可誘導(dǎo)表達(dá)AbrB蛋白的重組質(zhì)粒PDG148-AbrB(AbrB基因序列見序列 表SEQ ID NO. 1);優(yōu)選的，上述基因工程菌株含有可誘導(dǎo)表達(dá)點突變AbrB蛋白的重組質(zhì)粒 pDG148-AbrB-mutant(AbrB_mutant 的基因序列見序列表 SEQ ID NO. 2)〇
[0013] 一種可調(diào)控芽孢生成的枯草芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如 下步驟：
[0014] (l)AbrB基因序列的獲得和重組質(zhì)粒的構(gòu)建：
[0015] 設(shè)計引物AbrB-1和AbrB-2,采用PCR方法擴(kuò)增枯草芽孢桿菌中AbrB基因序列， 為了便于重組質(zhì)粒的構(gòu)建，在引物AbrB-1上引入Hind III酶切位點，引物AbrB-2上引入 Sal I酶切位點，引物AbrB-1和AbrB-2的基因序列分別為：
[0016] AbrB-1 :5' -CCCAAGCTTATGTTTATGAAATCTACTGGTATTGTACG-3' ；
[0017] AbrB-2 :5' -ACGCGTCGACTTATTTAAGGTTTTGAAGCTGGTTT-3' ；
[0018] 以枯草芽孢桿菌基因組為模板，優(yōu)選的，以Bacillus subtil is 168或者Bacilus subtiis CGMCC NO. 2270(保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地 址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏時間：2007年11月 27日，保藏編號：CGMCC NO. 2270)基因組為模板，利用引物AbrB-1和AbrB-2進(jìn)行PCR方法 擴(kuò)增，獲得枯草芽孢桿菌中AbrB基因序列（見序列表SEQ ID NO. 1)，利用基因測序反應(yīng)進(jìn) 行基因序列的驗證；
[0019] 以PCR方法擴(kuò)增獲得的AbrB基因序列為模版，使用引物AbrB-1、AbrB-2、AbrB-3 和AbrB-4,利用PCR方法擴(kuò)增得到AbrB點突變序列AbrB-mutant (見序列表SEQ ID NO. 2)， 引物AbrB-1、AbrB-2、AbrB-3和AbrB-4的基因序列分別為：
[0020] AbrB-1 :5' -CCCAAGCTTATGTTTATGAAATCTACTGGTATTGTACG-3' ；
[0021] AbrB-2 :5' -ACGCGTCGACTTATTTAAGGTTTTGAAGCTGGTTT-3' ；
[0022] AbrB-3 :5' -ATTTATGTTGATGCTGAAAAAATC-3' ；
[0023] AbrB-4 :5' -GGATGATTTTTTCAGCATCAAC-3'；
[0024] (2)利用pDG148-stu質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III和Sal I進(jìn)行雙酶切處理， 用膠回收快速純化試劑盒純化回收后，和AbrB或AbrB-mutant基因序列連接，構(gòu)建AbrB重 組表達(dá)質(zhì)粒pDG148-AbrB或點突變AbrB的重組表達(dá)質(zhì)粒pDG148-AbrB-mutant，利用基因測 序反應(yīng)進(jìn)行重組質(zhì)粒pDG148_AbrB和pDG148-AbrB_mutant的序列驗證；
[0025] (3)誘導(dǎo)表達(dá)AbrB蛋白基因工程枯草芽孢桿菌的獲得
[0026] 利用電激轉(zhuǎn)化法，將質(zhì)粒pDG148_AbrB和pDG148-AbrB_mutant轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌 中，獲得含有重組質(zhì)粒pDG148-AbrB和pDG148-AbrB-mutant的基因工程枯草芽孢桿菌，該 枯草芽孢桿菌可在乳糖操縱子的作用下，利用乳糖或IPTG來調(diào)控AbrB蛋白的表達(dá)。
[0027] 所述基因工程枯草芽孢桿菌可重組表達(dá)芽孢生成調(diào)控蛋白AbrB。
[0028]所述步驟⑴中PCR方法擴(kuò)增的條件為：94-95°C預(yù)變性5分鐘，94-95°C 30秒， 60 °C 30 秒，72 °C 40 秒，25-30 個循環(huán)后 72 °C 10 分鐘。
[0029] 所述步驟（2)中將質(zhì)粒pDG148_stu和AbrB或AbrB-mutant基因序列分別用限制 性內(nèi)切酶Hind III和Sal I在37°C處理4h。
[0030] 所述步驟⑵中將雙酶切處理、純化回收后的pDG148-stu質(zhì)粒和AbrB或 AbrB-mutant基因序列按物質(zhì)的量之比1:3混合，利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反 應(yīng)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5a感受態(tài)中，獲得重組質(zhì)粒pDG148-AbrB和 pDG148-AbrB-mutant 〇
[0031] 本發(fā)明的另一個技術(shù)方案是提供一種利用本發(fā)明的基因工程菌調(diào)控芽孢的生成， 獲得高濃度枯草芽孢桿菌菌體或者芽孢發(fā)酵液的方法，通過添加適量乳糖或IPTG來調(diào)控 枯草芽孢桿菌芽孢的生成，具體技術(shù)方案為：
[0032] 一種可調(diào)控芽孢生成的枯草芽孢桿菌基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于該菌株用于 發(fā)酵過程中調(diào)控芽孢的生成。
[0033] 所述發(fā)酵過程中調(diào)控芽孢的生成包括枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)步驟和高濃度枯草芽 孢桿菌菌體或枯草芽孢桿菌芽孢的獲得步驟。
[0034] 所述枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)步驟為：按照體積比1%-7%的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中 接種含有重組質(zhì)的枯草芽孢桿菌基因工程菌，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0035] 優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蛋白胨7-15g/L，酵母浸粉3-8g/L，NaCl 5-15g/L，pH 7. 0,121°C 滅菌 20min。
[0036] 所述高濃度枯草芽孢桿菌菌體的獲得步驟為：
[0037] 在發(fā)酵過程中控制發(fā)酵液中乳糖濃度為l_5g/L或者添加lmmol/L的IPTG，誘導(dǎo) AbrB蛋白的表達(dá)，阻遏枯草芽孢桿菌芽孢的生成，從而獲得高濃度枯草芽孢桿菌菌體發(fā)酵 液。
[0038] 所述高濃度枯草芽孢桿菌芽孢的獲得步驟為：
[0039] 在發(fā)酵過程中控制發(fā)酵液中乳糖濃度為l_5g/L，誘導(dǎo)AbrB蛋白的表達(dá)，阻遏枯草 芽孢桿菌芽孢的生成，促進(jìn)枯草芽孢桿菌菌體濃度增加，當(dāng)達(dá)到所需要菌體濃度時停止補 加乳糖使發(fā)酵液中乳糖消耗完全，AbrB蛋白停止表達(dá)，同時，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為40-45°C，促 進(jìn)枯草芽孢桿菌生成芽孢，從而獲得高濃度枯草芽孢桿菌芽孢。
[0040] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明利用調(diào)控芽孢生成關(guān)鍵基因和乳糖操縱子的調(diào)控機(jī) 理構(gòu)建基因工程質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，通過比較原始菌株和基因工程菌株生長 過程，發(fā)現(xiàn)基因工程質(zhì)粒對菌體生長沒有影響。利用本發(fā)明得到的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵生 產(chǎn)，能夠方便有效地調(diào)節(jié)菌體的生長狀態(tài)和芽孢生成的時機(jī)，可用于發(fā)酵條件的調(diào)控和優(yōu) 化，實現(xiàn)獲得高濃度枯草芽孢桿菌菌體或者高濃度枯草芽孢桿菌芽孢的目的，從而提高生 產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明PCR方法擴(kuò)增AbrB產(chǎn)物電泳圖；
[0042] 圖2為本發(fā)明BamHI、Hind III酶切質(zhì)粒pDG148-AbrB電泳圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實施例只是描述性的， 不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0044] 以下實驗所用主要材料來源：大腸桿菌DH5 a菌株、核酸操作工具酶來自寶生物 工程（大連）有限公司，引物合成、核苷酸序列人工合成以及基因測序委托上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司完成?？莶菅挎邨U菌Bacilus subtiis CGMCC NO. 2270的保藏單位為 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101，保藏時間：2007年11月27日，保藏編號： CGMCC NO. 2270〇
[0045] 實施例1 :制備含有pDG148_AbrB和pDG148-AbrB_mutant質(zhì)粒的枯草芽抱桿菌
[0046] 根據(jù)《分子克隆》（科學(xué)出版社，第二版，2002年），以枯草芽孢桿菌基因組為模板， 分別設(shè)計引物克隆添加合適酶切位點的AbrB基因，經(jīng)過序列測定與分析正確后，采用限制 性內(nèi)切酶處理后，與大腸桿菌/枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pDG148-stu質(zhì)粒連接而成。對于本 發(fā)明其具體步驟如下：
[0047] (1)調(diào)控芽孢形成關(guān)鍵基因的獲取
[0048] 以枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis168為模板（購自中國微生物菌種保藏管理 委員會普通生物中心），根據(jù)引物AbrB-1、AbrB-2,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出調(diào)控芽孢形成關(guān)鍵 基因片段AbrB(見序列表SEQID NO. 1)，其對應(yīng)的氨基酸序列見序列表SEQID NO. 3。
[0049] ?〇?方法擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95°0預(yù)變性51^11，951：