一種晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種 功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據(jù)干細胞的發(fā)育潛 能分為三類：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。干細胞（stem Cell)是一種未充分分 化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學界稱為"萬用細胞"。
[0003] 晶狀體是一個雙凸透鏡狀的透明組織，由懸韌帶懸掛在虹膜后方、玻璃體正前方， 是眼內(nèi)重要的屈光間質(zhì)。人類晶狀體前表面的曲率半徑約1〇_，后表面的曲率半徑約6_。 晶狀體表面包裹了一層無細胞的透明彈性薄膜，分布在晶狀體前表面的叫做前囊膜，由位 于其下的晶狀體上皮細胞分泌的膠原纖維形成，晶狀體上皮附著在前囊膜上。晶狀體上皮 細胞呈單層柱狀，附著在晶狀體前囊膜上，其可分為中央?yún)^(qū)（central region)和兩側(cè)對稱 的赤道區(qū)（equatorial region)。中央?yún)^(qū)上皮細胞（central anterior epithelium)單層 排列在前囊膜下，代謝緩慢；赤道區(qū)上皮細胞（equatorial epithelial)分裂活躍,通過分 裂產(chǎn)生子細胞逐步向晶狀體內(nèi)部移動并分化成為晶狀體纖維。晶狀體赤道部上皮細胞在整 個生命活動中分裂活躍，其不斷分裂產(chǎn)生子細胞的現(xiàn)象和干細胞的自我更新特性類似。
[0004] 王瀠，"小鼠晶狀體干細胞的初步研究"，第四軍醫(yī)大學2013年碩士論文，利用干細 胞的特性，通過BrdU標記滯留細胞實驗，檢測到晶狀體上皮中存在表達干細胞標志物S0X2 的細胞，確定晶狀體上皮中存在干細胞。但是未分離得到晶狀體上皮干細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，它包括以下 步驟：
[0006] (1)取晶狀體前囊膜及附著的上皮，剪成碎片，消化，將獲得的細胞鋪于包被有基 質(zhì)的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中；
[0007] (2)加入添加有 15 ~25% FBS、50 ~150ii g/L FGF、5-10mg/L 胰島素、5-10mg/ L氫化可的松、5-10mg/L霍亂弧菌毒素、0. 01-0. 05mg/L3, 3'，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸、 l-5mg/L腺噪呤、5~10mg/L甘氨酸、6~12mg/L丙氨酸、10~16mg/L天冬酰胺、10~16mg/ L天冬氨酸、12~18mg/L谷氨酸、8~15mg/L脯氨酸、7~14mg/L絲氨酸的MEM培養(yǎng)液，放 入37°C孵箱中培養(yǎng)，2-3天形成克隆，10-14天可形成單層活性的晶體干細胞細胞。
[0008] 所述消化的方法是：將碎片加0. 2%的膠原酶IV溶液中，消化2h，去除膠原酶，加 入0. 25%胰蛋白酶-EDTA溶液，混勻，過濾，即得細胞。
[0009] 其中，步驟（1)中，所述基質(zhì)為基質(zhì)膠、明膠、膠原、多聚賴氨酸和/或?qū)诱尺B蛋白 中的一種或兩種以上的組合。
[0010] 進一步地，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿包被基質(zhì)膠的方法為：加入含1 %~3%基質(zhì) 膠的DMEM/F12培養(yǎng)液或無菌PBS溶液，完全覆蓋底部即可，在37°C孵箱中孵育0. 5~2小 時，孵育完后吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS清洗3~5次。
[0011] 更進一步地，基質(zhì)膠的濃度為2% ;孵育時間為1小時。
[0012] 其中，步驟（2)中，F(xiàn)BS濃度為20%，F(xiàn)GF濃度為100ii g/L，胰島素濃度為10mg/L， 氫化可的松濃度為l〇mg/L，霍亂弧菌毒素濃度為10mg/L，3,3'，5_碘-L-對羥基苯丙氨酸 濃度為〇. 〇lmg/L，腺噪呤濃度為5mg/L，甘氨酸濃度為7. 5mg/L、丙氨酸濃度為8. 9mg/L、天 冬酰胺濃度為13. 2mg/L、天冬氨酸濃度為13. 3mg/L、谷氨酸濃度為14. 7mg/L、脯氨酸濃度 為11. 5mg/L、絲氨酸濃度為10. 5mg/L。
[0013] 其中，步驟（2)中，培養(yǎng)液中還含有抗生素。
[0014] 進一步地，所述的抗生素為50~100U/mL的青霉素和50~100 ii g/mL的鏈霉素。
[0015] 本發(fā)明還提供了晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)液，它是添加有15~25% FBS、 50~150 y g/L FGF、5_10mg/L胰島素、5-10mg/L氫化可的松、5-10mg/L霍亂弧菌毒素、 0? 01-0. 05mg/L3, 3'，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸、l_5mg/L腺噪呤、5~10mg/L甘氨酸、6~ 12mg/L丙氨酸、10~16mg/L天冬酰胺、10~16mg/L天冬氨酸、12~18mg/L谷氨酸、8~ 15mg/L脯氨酸、7~14mg/L絲氨酸的MEM培養(yǎng)液。
[0016] 其中，F(xiàn)BS濃度為20%，F(xiàn)GF濃度為100iig/L，胰島素濃度為10mg/L，氫化可的 松濃度為l〇mg/L，霍亂弧菌毒素濃度為lOmg/Ldj' ,5-碘-L-對羥基苯丙氨酸濃度 為0. 01mg/L，腺噪呤濃度為5mg/L，甘氨酸濃度為7. 5mg/L、丙氨酸濃度為8. 9mg/L、天冬 酰胺濃度為13. 2mg/L、天冬氨酸濃度為13. 3mg/L、谷氨酸濃度為14. 7mg/L、脯氨酸濃度為 11. 5mg/L、絲氨酸濃度為10. 5mg/L。
[0017] 所述培養(yǎng)液中還含有抗生素。其中，所述的抗生素為50~100U/mL的青霉素和 50~100 y g/mL的鏈霉素。但人眼晶狀體囊膜小，用消化法難以獲得大量細胞，而直接用組 織塊培養(yǎng)如長時間不能貼壁，亦將導致細胞死亡，因此晶狀體干細胞原代培養(yǎng)較難獲得成 功。
[0018] 本發(fā)明通過對培養(yǎng)液的成分及用量的特定選擇和配合，在本發(fā)明特定方法下，分 離培養(yǎng)得到了原代晶狀體上皮干細胞。
[0019] 本發(fā)明方法可以分離得到原代晶狀體上皮干細胞，干細胞的活性高，本發(fā)明方法 簡便、易操作，應用前景良好。
[0020] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0021] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0022] 說明書附圖
[0023] 圖1人晶狀體上皮干細胞呈現(xiàn)其鵝卵石狀細胞形狀特征（100x);
[0024]圖2人晶狀體上皮干細胞的免疫熒光組化染色A. Pax6 (紅色），B. Sox2 (紅色）；
[0025] 圖3兔晶狀體上皮干細胞：A :兔晶狀體上皮干細胞相差顯微照片（40x) ;B_D : 共聚焦顯微觀察干細胞標記物免疫熒光染色：增殖標記Ki67(B);晶狀體干細胞標記物 Sox2(C)、Pax6(D) ;E :成熟的晶體纖維細胞；F:兔晶狀體上皮干細胞和成熟的晶體纖維細 胞的基因表達比較。
【具體實施方式】
[0026]PBSIX(LifeTechnologies,cat.no. 14190-144)
[0027] ?PenicillinStreptomycin(LifeTechnologies,cat.no. 15140-122)
[0028] ?CollagenaseIV(LifeTechnologies,cat.no. 17104019)
[0029] ? 0. 25%Trypsin-EDTAIX(LifeTechnologies,cat.no. 25200-056)
[0030] ?MatrigelMatrixGrowthFactorReduced(Corning,cat.no. 354230)
[0031] ?SterileCellCultureGradeWater(Corning,cat.no. 25-055-CV)
[0032] ?MEMIX(LifeTechnologies,cat.no. 11095-072)
[0033]Insulinfrombovinepancreas(Sigma,cat.no.I5500-100MG)
[0034] ?HydrocortisoneChroma(VWR,cat.no. 386698-25MG)
[0035] ?CholeraToxinVibrio(Millipore,cat.no. 227036-1MG)
[0036]?3,3' ,5-Triiodo-L-Thyronine(Sigma,cat.no.T25752)
[0037] ?Adenine(EMDMillipore,cat.no. 1152-25GM)
[0038] 實施例1人眼晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定
[0039] 1、方法
[0040]1. 1分離培養(yǎng)
[0041] (1)六孔板在使用前先用含2%Matrigel(Matrigel是基質(zhì)膠）的DMEM/F12培養(yǎng) 液包被1小時，吸棄培養(yǎng)液，無菌PBS清洗5次；
[0042] (2)用含青霉素/鏈霉素的PBS沖洗眼組織3遍，在超凈臺中環(huán)形剪除角膜，放射 狀剪開并撕除虹膜，充分暴露晶狀體赤道部，用眼科鑷盡量靠近赤道部撕下晶狀體前囊膜 及附著的上皮，將其剪成IX 1mm2的碎片，碎片加入放有5ml 0.2%的膠原酶IV的離心管 中，獲得細胞團。再將離心管放入37°C培養(yǎng)箱中輕輕搖動2小時進行消化。2小時后，離心 細胞，在lOOOrpm離心5分鐘，在室溫下真空抽吸的膠原酶。添加0. 25%胰蛋白酶-EDTA 5 毫升，并通過l〇〇um的細胞過濾網(wǎng)。濾過細胞鋪于包被有2% Matrigel的六孔板中；
[0043] (3)加入添加有20%?85、10〇1^/1^6?、1〇11^/1胰島素、1〇11^/1氫化可的松1〇11^/ L霍亂弧菌毒素、0? 01mg/L3, 3 '，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸、5mg/L腺噪呤、7. 5mg/L甘氨 酸、8. 9mg/L丙氨酸、13. 2mg/L天冬酰胺、13. 3mg/L天冬氨酸、14. 7mg/L谷氨酸、11. 5mg/L 脯氨酸、