變異的人卵透明帶蛋白1和突變基因及檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生殖工程、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，具體涉及新的變異的人卵透明 帶蛋白I (mutated human ZP1)及其編碼基因。特別是，本發(fā)明提供了可導(dǎo)致人卵透明 帶缺失的異常表型（引起婦女不孕）的突變ZPl蛋白的新的氨基酸序列（PRT，404aa)，以及 其編碼基因mutated human ZPl的脫氧核苷酸序列（DNA，9, 324bp)和核苷酸序列（mRNA， 1，909nt)。
【背景技術(shù)】
[0002] 哺乳動物透明帶是指包繞在哺乳動物卵母細胞外圍的一層透明膜狀保護層，有 3-4 種糖蛋白組成（Wassarman, P.M. and E.S. Litscher, Biogenesis of the mouse egg's extracellular coat, the zona pellucida. Curr Top Dev Biol, 2013. 102 ：p.243-66 ； Avella, M. A. , B. Xiong and J. Dean, The molecular basis of gamete recognition in mice and humans. Mol Hum Reprod, 201)，其在保護卵子早期正常發(fā)育、受精(精卵識別、精 卵結(jié)合和預(yù)防多精受精等）以及維持胚胎著床前的發(fā)育的生殖過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用， 通過對透明帶構(gòu)造、形成、變異、缺失和功能的研究，對了解生命的起源、發(fā)育和進化有著重 大的意義（Zuccotti，M.，R. C. Alberto and S. Garagna, Study an egg today to make an embryo tomorrow. Int J Dev Biol, 2012. 56 (10-11-12) :p. 761-764)。在基因敲除小鼠 的研究基礎(chǔ)上，小鼠的所有透明帶蛋白（zpl-zp3)似乎在保持透明帶完整結(jié)構(gòu)上都起著一 定的作用，因為任何一種編碼透明帶蛋白的基因敲除之后都會導(dǎo)致不同程度的透明帶缺 陷甚至透明帶的完全缺失，從而使生育能力嚴重下降或消失。近年，透明帶一直被認為與 女性不孕相關(guān)，國外一些學(xué)者對卵母細胞的異常形態(tài)透明帶蛋白進行遺傳、分子及功能學(xué) 上的研究，有學(xué)者等對卵子透明帶異常表型的原因不明不孕的女性進行基因研究，認為女 性的透明帶異常表型可能并不是由于基因突變導(dǎo)致（Margalit M, Paz G, YavetzH, Yogev L,Amit A,Hevlin-Schwartz T,Gupta SK, Kleiman SE.Genetic and physiological study ofmorphologically abnormal human zona pellucida. Eur J Obstet Gynecol R印rod Biol. 2012Nov;165 (I) :70-6.)。另外有研究探討了編碼透明帶蛋白基因序列的 突變與體外受精中受精失敗的聯(lián)系，認為不孕女性的透明帶基因序列變異頻率比較高，且 在IVF助孕中未獲得受精卵子的人群中更高（VUinnikk5 M, T5rmaia RM，Tuuri T，Haltia A, Martikainen H,Ala-Kokko L,Tapanainen JS,Lakkakorpi JT.Association between sequence variations in genes encoding human zona pellucida glycoproteins and fertilization failure in IVF.Hum Reprod. 2005 Jun ;20 (6) :1578_85)。為 了驗證 透明帶異常形態(tài)與表達透明帶糖蛋白結(jié)構(gòu)部分基因的突變的關(guān)系的假說，研究者對31名 接受IVF治療的志愿者進行基因測序，并對各自的卵子進行形態(tài)學(xué)上的分析，研究結(jié)果顯 示一些常見的透明帶異常(裂隙、橢圓形、變薄、增厚）可能在一定程度上與相關(guān)編碼人透 明帶蛋白的基因突變有關(guān)RM, Lakkakorpi JT, Nuojua-Huttunen SH, Tapanainen JS.Sequence variations in human ZP genes as potential modifiers of zona pellucida architecture. Fertil Steril.2011Jun30;95 (8) :2669_72)。已有的研究發(fā) 現(xiàn)所有透明帶基因的敲除對雄性小鼠沒有影響，而敲除zpl的雌性小鼠，卵子透明帶僅表 現(xiàn)為變薄且可以生育（Rankin T, Talbot P, Lee E, Dean J. Abnormal zonae pellucidae in mice lacking ZPlresult in early embryonic loss.Developmentl999 ；126 ： 3847-55.)，但是分別敲除zp2和zp3的雌性小鼠，各階段卵子及卵母細胞完全沒有透明帶 (Conner, S. J. , L. Lefievre, et al. (2005) ·''Cracking the egg !increased complexity in the zona pellucida. ^Hum Reprod20 (5):1148-1152.) (ffassarman, P. M. , H. Qi, et al. (1997) · "Mutant female mice carrying a single mZP3allele produce eggs with a thin zona pellucida, but reproduce normally. ^Proc Biol Sci264 (1380): 323-328. )。（ZP3+/_)雜合缺失小鼠有透明帶，厚度變薄但對繁殖沒有影響（Jovine, L.，H. Qi, et al. (2004). ^Aduplicated motif controls assembly of zona pellucida domain proteins. "Proc Natl Acad Sci USAlOl (16) :5922-5927.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的突變ZPl蛋白可導(dǎo)致人類卵母細胞透明帶發(fā)育障礙，即透明帶缺失從而 引起不孕。編碼基因的c. 1，169_1，176del TGGGAAAA為HGMD中未記載的新突變，以往沒有 報道這種類型突變，也未在200多個正常人群中檢測到該種突變。使用BCM在線分析軟件 分析患者突變后的cDNA，根據(jù)密碼子配對原則，在突變基因第1，287個堿基處出現(xiàn)了終止 子，對應(yīng)gDNA位置在zpl基因的8號外顯子中。ZPl氨基酸序列的大小由原來的638aa突 變?yōu)?04aa，其中突變后編碼的氨基酸中p. 391后有15aa為新編碼氨基酸（I390fs404X)。 該基因突變只有在純合缺失時才出現(xiàn)臨床異常表型(不孕，透明帶缺失)，目前只在一個透 明帶缺失導(dǎo)致不孕的家系中的患者中出現(xiàn)，該家系中患者所患疾病為一種新的常染色體隱 性遺傳病。這是世界上首次發(fā)現(xiàn)的透明帶缺失病例及基因突變，首次克隆出該致病突變，首 次人工合成出導(dǎo)致人卵透明帶缺失異常的DNA脫氧核苷酸序列，RNA核苷酸序列和蛋白質(zhì) 氨基酸序列。本發(fā)明的目的在于提供了可導(dǎo)致人卵透明帶缺失的異常表型(引起婦女不孕） 的突變ZPl蛋白的新的氨基酸序列（PRT，404aa)，以及其編碼基因mutated human ZPl的 脫氧核苷酸序列（DNA，9, 324bp)和核苷酸序列（mRNA，1，909nt)。本發(fā)明提供的ZPl蛋白質(zhì) 和mRNA能夠用于透明帶缺失疾病的機制研究的蛋白質(zhì)表達設(shè)計，并建立相應(yīng)的動物模型； DNA可用于分析鑒定不孕患者中是否存在致病突變，作為不孕的女性患者基因診斷的目的 基因，并為患者提供基因治療的靶向位點。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括：
[0005] 1. -種突變的人卵透明帶蛋白1的完整基序肽，其特征在于具有SEQID No. 4所示 氨基酸序列，記為mutantZPl1 _4°4,或者I390fs404X，大小為404aa，最后15個氨基酸序列 為 TPIACSYDPARPPAA。
[0006] 2. -種權(quán)利要求1所述的突變的人卵透明帶蛋白1的完整基序肽的編碼基因， 其特征在于該編碼基因的一級結(jié)構(gòu)具有SEQ. ID No. 1所示脫氧核苷酸序列，記為mutant ZPl，長度為9, 324bp，其中第6, 256至6, 263bp與正常ZPl相比缺少8個bp的脫氧核苷酸 TTTTCCCA，記為 c. 1，169_1，176delTTTTCCCA。
[0007] 3. -種翻譯第1項所述的突變的人卵透明帶蛋白1的完整基序肽的核苷酸 (mRNA)，其特征在于該mRNA具有SEQ. ID No. 3所示的核苷酸序列，記為mutant ZPl(mRNA)， 長度為l，909nt，其中第1，169至1，176與正常ZPl的mRNA相比缺少8個bp的核苷酸 UUUUCCCA。
[0008] 4. 一種由第3項所述的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，其特征在于該CDNA具有SEQ IDN0. 2所示的脫氧核苷酸序列，記為mutant ZPl (cDNA)，長度為1，909bp。
[0009] 5. -種檢測人卵透明帶蛋白1的完整基序肽的編碼基因突變的方法，其包括以下 步驟：1)從待測樣本提取DNA ;2)通過PCR對人卵透明帶蛋白1編碼基因zpl的整個編碼 區(qū)進行擴增獲得PCR產(chǎn)物；3)使用DNA純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收與純化；4)對所有 PCR片段進行雙向測序；5)對測序結(jié)果進行分析，以NCBI中目的基因標準序列為參照，進行 序列比對，以檢測基因的突變情況。
[0010] 6.根據(jù)第5項所述的方法，其中步驟2)中所使用的引物選自下列組中的至少一 種：
[0011] zp I-e I