lyO基因連入表達(dá)質(zhì)粒pBAD24中得到重組載體pB-ClyO,然后將其轉(zhuǎn)化大 腸桿菌 BL21(DE3)。
[0035] (3) ClyO的表達(dá)純化。
[0036] 將表達(dá)菌株BL21 (DE3)/pB-Cly0用0. 2%的L-阿拉伯糖低溫誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體 后超聲破碎，取上清用33%硫酸銨沉淀，將沉淀溶于PBS后于PBS中透析過夜。透析液即有 明顯的殺菌活性。
[0037] 透析后的粗提液，或者是超聲后的上清，過HiTrap Q Sepharose FF column (GE Healthcare)，收集柱流出物。將柱流出物過HiTrap SP Sepharose FF column，然后用IM 的NaCl梯度洗脫，分段收集洗脫峰。將有活性的各管混合后于PBS中透析過夜，即為純化 后的酶液。
[0038] 實(shí)施例2、ClyO殺滅金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CCTCC AB91118的驗(yàn)證
[0039] 將金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物，離心收集后用磷酸緩沖液（PBS)洗滌一次，再重 懸于PBS溶液中。取一定量的ClyO與上述菌液混合，同時(shí)用酶標(biāo)儀監(jiān)測混合液在600nm吸 收值的變化。用緩沖液與金黃色葡萄球菌的混合液作為負(fù)對照。最后得到的裂解曲線見圖 2。 同時(shí)，在處理不同時(shí)間后稀釋平板計(jì)算活菌數(shù)目。結(jié)果顯示ClyO能快速的裂解CCTCC AB91118菌株，導(dǎo)致菌液的濁度降低，表現(xiàn)為菌液在600nm波長的吸收值快速降低。
[0040] 實(shí)施例3、ClyO體外多種葡萄球菌以及對不同種類菌株特異性的驗(yàn)證。
[0041] 為了驗(yàn)證ClyO的殺菌譜，我們選擇了幾種發(fā)明者實(shí)驗(yàn)室保存的非葡萄球菌菌株 和臨床分離的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、松鼠葡萄球 菌、溶血性葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌以及其它菌株一起測試。首先將測試的菌株分別過夜培 養(yǎng)，離心收集后用PBS洗滌一次，然后重懸于PBS中。取一定量的ClyO與上述菌液分別混 合，同時(shí)用酶標(biāo)儀監(jiān)測混合液在600nm吸收值的變化30min。用OD 6tltl降低的速率表示不同 菌株的裂解效果。同時(shí)，用緩沖液與菌液的混合液作為負(fù)對照。試驗(yàn)得到的殺滅效果見圖 3。 結(jié)果顯示ClyO能快速的殺滅臨床分離的多種葡萄球菌而對其它種類的測試菌株沒有裂 解作用。
[0042] 實(shí)施例4、ClyO在牛奶中殺滅多種葡萄球菌菌株的效果。
[0043] 將臨床分離得到的多型MRSA菌過夜培養(yǎng)，離心收集后用PBS洗滌一次后，重懸于 無菌巴氏消毒奶中。取一定量的ClyO與上述菌液分別混合后在37度放置60min，然后稀釋 平板計(jì)算其中的活菌數(shù)目。試驗(yàn)得到的殺滅效果見圖4。結(jié)果顯示ClyO能在牛奶中快速的 殺滅多種葡萄球菌菌株。
[0044] 實(shí)施例5、ClyO清除小鼠燙傷皮膚組織上感染的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)的效果。
[0045] 實(shí)驗(yàn)中所用小鼠為6周大的BALB/c雌性鼠，重約20到22克。在實(shí)驗(yàn)小鼠（60只） 背部用80度的開水處理IOs造成皮膚燙傷。之后在燙傷這種上接種I X IO7的MRSA菌株。 24小時(shí)后，將小鼠分為三組，每組20只。實(shí)驗(yàn)組小鼠分別用無菌PBS，或者IOOmg ClyO處 理，對照組則不做任何處理。24小時(shí)后計(jì)算單位燙傷皮膚組織中的細(xì)菌載量，所得到的結(jié)果 見圖5。結(jié)果顯示ClyO能有效降低燙傷皮膚組織中MRSA菌的載量。
[0046] 實(shí)施例6、ClyO體內(nèi)殺滅金黃色葡萄球菌的驗(yàn)證。
[0047] 實(shí)驗(yàn)中所用小鼠為6周大的BALB/c雌性鼠，重約20到22克。在實(shí)驗(yàn)小鼠（40只） 腹腔注射6 X IO7金黃色葡萄球菌臨床分離菌株WHSl 1081。3小時(shí)后，將小鼠分為兩組，每組 20只。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射ClyO lOOOyg，對照組則注射PBS緩沖液。每天觀測小鼠的存 活率，所得到的結(jié)果見附圖6。結(jié)果顯示ClyO能有效的殺滅體內(nèi)的金黃色葡萄球菌，從而提 高小鼠的存活率。
[0048] 實(shí)施例7、ClyO細(xì)胞毒性的測試。
[0049] 將Caco-2細(xì)胞以每孔5 X IO3的濃度接種到96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，向孔板中 加入一定濃度的Cly0(0.1-lmg/mL)以及離子霉素（15mg/mL)和絲裂霉素 C(15mg/mL)。繼 續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，向孔板中加入染色劑WST-8,靜置后在酶標(biāo)儀上讀取450nm吸 光值。所得到的結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示即使高濃度的ClyO也無細(xì)胞毒性，而作為陽性對照 的離子霉素和絲裂霉素均顯示了較高的細(xì)胞毒性。
[0050] 實(shí)施例8、ClyO用于基于ATP釋放的葡萄球菌快速檢測
[0051] 將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的過夜培養(yǎng)物離心收集，用PBS洗滌沉淀一次后重 懸于PBS中。取一定量的ClyO與上述菌液混合，同時(shí)加入0. 25 μΜ的熒光素酶和5 μΜ的 熒光素底物（其中含有12. 5 μ M輔酶Α)?；靹蚝蟮姆磻?yīng)液置于37度，用酶標(biāo)儀監(jiān)測發(fā)光強(qiáng) 度的變化。試驗(yàn)得到的鑒定結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示所測試的金黃色葡萄球菌菌液都有不同 程度的發(fā)光，原因顯然是由于ClyO能裂解金葡菌的細(xì)胞壁導(dǎo)致了胞內(nèi)ATP的釋放，熒光素 酶能利用所釋放的ATP催化底物發(fā)光，而作為空白對照的大腸桿菌溶液，由于ClyO不能裂 解其細(xì)胞壁，沒有ATP釋放，從而表現(xiàn)為沒有發(fā)光產(chǎn)生。
[0052] 實(shí)施例9、ClyO用于金黃色葡萄球菌MRSA菌株的PCR鑒定
[0053] 將臨床分離的金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物離心收集后，用PBS洗滌沉淀一次后重 懸于PBS中。取一定量的ClyO與上述菌液混合，37攝氏度裂解10-15min。將裂解后的溶 液1000 Og離心lmin，取上清1 μ 1做模板，各加入引物1 μ g進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增femB基因 所用引物為 FemB-F(5' -TTACAGAGTTAACTGTTACC-3'）（SEQ. ID. NO. 5)和 FemB-R(5' -ATACAA ATCCAGCACGCTCT-3'）（SEQ. ID.N0.6);擴(kuò)增 mecA 基因所用引物為 MecA-F(5'-GTAGAAATGACT GAACGTCCGATAA-3'）（SEQ. ID. NO. 7)和 MecA-R(5'-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3'）（SEQ. ID. NO. 8)。PCR擴(kuò)增程序如下：1) 94°C，5min ;2) 94°C，30sec，5(TC，45sec，72°C，60sec，30 個(gè) 循環(huán)；3)72°C，IOmin ;將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，電泳圖譜如圖9。femB基因大小為65Ibp， mecA基因?yàn)?10bp。耐甲氧西林金葡菌（MRSA)應(yīng)同時(shí)具有兩個(gè)基因，甲氧西林敏感的金葡 菌（MSSA)應(yīng)只有femB基因。只具有mecA基因的為金葡菌的其它菌株。結(jié)果顯示用ClyO 作用金黃色葡萄球菌后的裂解液上清做模板，可以方便的用于PCR鑒定MRSA菌株。
[0054] 實(shí)施例10、ClyO用于MRSA分型的PCR鑒定的驗(yàn)證
[0055] 將臨床分離的MRSA菌過夜培養(yǎng)物離心收集后，用PBS洗滌沉淀一次后重懸于PBS 中。取一定量的ClyO與上述菌液混合，37攝氏度裂解10-15min。將裂解后的溶液1000 Og 離心lmin，取上清1 μ 1做模板，各加入分型所需的引物1 μ g進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序 如下：l)94°C，5min ;2)94°C，30sec，5(TC，30sec，72°C，30sec，30 個(gè)循環(huán)；3)72°C，IOmin ;將 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，電泳圖譜如圖10。結(jié)果顯示用ClyO作用后的裂解液上清做模板， 可以方便的用于MRSA的PCR分型鑒定。各種型別的MRSA菌株均能得到很好的鑒定。其中 分型所需的4對引物及各型的基因特征如下表所示。
[0056]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能裂解葡萄球菌的裂解酶，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述裂解酶的基因，其核酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3. 權(quán)利要求1所述的裂解酶可溶表達(dá)與純化的方法，其特征在于，將權(quán)利要求2所述基 因克隆后連入表達(dá)載體PBAD24中，然后將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)， 所表達(dá)的蛋白質(zhì)先經(jīng)過離子交換純化，再用磷酸鹽緩沖液透析處理。
4. 權(quán)利要求1所述的裂解酶在體外殺滅表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、 頭葡萄球菌、白色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球 菌、以及金黃色葡萄球菌的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌包括甲氧西林敏感 的金黃色葡萄球菌和甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌。
6. 權(quán)利要求1所述的裂解酶在作為治療葡萄球菌感染藥物中活性成分的用途。
7. 權(quán)利要求1所述的裂解酶在葡萄球菌檢測和鑒定中的用途，其特征在于，用權(quán)利要 求1所述裂解酶與待測細(xì)菌作用后，釋放菌內(nèi)的ATP或DNA，通過檢測釋放的ATP或DNA來 用于葡萄球菌的檢測和鑒定。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，將待測細(xì)菌與權(quán)利要求1所述裂解酶混合 后，加入熒光素酶及其底物于37攝氏度孵育，同時(shí)用酶標(biāo)儀檢測混合液發(fā)光強(qiáng)度的變化， 同時(shí)用沒有加入權(quán)利要求1所述裂解酶的菌混合液作為陰性對照。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，將待測細(xì)菌與權(quán)利要求1所述裂解酶混 合后于37攝氏度孵育10-15 min，對混合液10000 g離心I min，取上清做模板，加入MRSA 鑒定的兩對引物進(jìn)行PCR來對菌株是否為MRSA進(jìn)行鑒定；對鑒定為MRSA的菌株，則進(jìn)一步 加入SCCmec分型所需的5對引物進(jìn)行PCR，對MRSA菌株進(jìn)行分型。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能殺滅葡萄球菌的裂解酶及其應(yīng)用，屬于生物制劑領(lǐng)域。本發(fā)明公開了該酶的氨基酸序列和編碼基因序列。該酶發(fā)揮作用的pH范圍寬，在pH4-11都保持有裂解葡萄球菌的活力，采用編碼基因構(gòu)建的重組蛋白酶能在大腸桿菌BL21(DE3)中可溶表達(dá)。該酶能用于在體外高效殺滅各種葡萄球菌，包括臨床分離的甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌和甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌。該酶能用作治療體內(nèi)葡萄球菌感染的抗生素。所公開的酶也能快速裂解葡萄球菌的細(xì)胞壁并釋放胞內(nèi)的物質(zhì)，如三磷酸腺苷和DNA等，利用所釋放的物質(zhì)來對葡萄球菌進(jìn)行檢測。
【IPC分類】C12Q1-66, C12Q1-527, A61P31-04, C12Q1-68, C12Q1-14, C12N9-88, C12N15-60, C12N15-70, A61K38-51
【公開號(hào)】CN104805066
【申請?zhí)枴緾N201510252947
【發(fā)明人】危宏平, 楊航, 余軍平
【申請人】武漢賽思銳微生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月18日