質(zhì)的遞送過程，從而運(yùn)送寡核苷酸。脂質(zhì)化的核酸還可降低寡核苷酸的 親水性。還示出脂質(zhì)性核酸改善寡核苷酸的功效，參見Shea等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6553,1989 ;0berhauser，B·和 Wagner，E·，Nucleic Acids Res·，20, 533,1992; Saison,-Behmoaras等· The EMBO Journal，10,1111，1991 ;Reed 等，Bioconjugate Chem.， 2,217，1991;Polushin 等，Nucleosides & Nucleotides，12,853，1993;Marasco 等， Tetrahedron Lett.，35, 3029,1994。將一系列疏水性基團(tuán)如金剛燒、二十碳稀酸、膽固醇以 及二（十六烷基）二醇在3'端附接至寡脫氧核苷酸序列并且雜交至互補(bǔ)的RNA序列。發(fā)現(xiàn) Tm未受影響，這指示所述基團(tuán)不干擾寡雜交特性，參見Manoharan等，Tetrahedron Lett.， 36,1995 ;Manoharan 等，Tetrahedron Lett.，36, 3651-3654,1995 ;Gerlt，J. A. Nucleases， 第二版，Linn, S. M.，Lloyd, R. S.，Roberts, R. J.，編· Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 10 頁，1993。
[0012] 為有效遞送合成的RNA分子，PEG附接至各種寡核苷酸已示出有利特性。PEG-寡 聚物已通過防止快速消化而示出酶促穩(wěn)定性。熱熔融行為不受影響，從而保留雙鏈結(jié)構(gòu) (formation)的特性。Srivastava等，Nucleic Acids Symposium Series，2008,52，103_104 最近開發(fā)了一種反向RNA合成方法，用于將親脂性且大的分子清潔不接至合成的RNA。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)說明
[0014] 已針對(duì)許多核苷和寡核苷酸進(jìn)行氘標(biāo)記研宄與NMR分析。DNA和RNA的結(jié)構(gòu)和動(dòng) 力學(xué)對(duì)于了解其生物學(xué)功能是重要的。這通過多種物理化學(xué)技術(shù)來調(diào)研。在這些技術(shù)中， 核磁共振（NMR)光譜法已廣泛用作強(qiáng)大工具，因?yàn)槠涮峁┌凳揪植拷Y(jié)構(gòu)變異的構(gòu)象信息和 一定生物學(xué)條件下的動(dòng)力學(xué)。這已使用強(qiáng)大計(jì)算機(jī)和高共振能儀器而改進(jìn)。隨著磁場(chǎng)增 大，較高靈敏度降低獲得優(yōu)質(zhì)光譜所需的寡聚物的量，并且增大共振信號(hào)的分散，從而降低 由于第二級(jí)J耦合至第一級(jí)引起的共振重疊所致的光譜復(fù)雜性。進(jìn)行描述將氘并入脫氧 核苷、核糖核苷以及修飾的核苷的特定位置的大多數(shù)研宄，以嘗試通過質(zhì)子核磁共振（NMR) 確定寡核苷的結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象細(xì)節(jié)。寡核苷酸的質(zhì)子NMR光譜通常相當(dāng)復(fù)雜并且不揭示出構(gòu) 象與結(jié)構(gòu)信息。由于寡核苷酸具有顯著重疊 NMR共振，氣化寡核苷酸的結(jié)構(gòu)確定已用于生 物功能性DNA或RNA分子的NMR結(jié)構(gòu)確定。為克服與共振相關(guān)的問題，研宄人員開發(fā)了非均 一氣標(biāo)記技術(shù)，參見 Foldesi 等，J. Tetrahedron，1992,48,9033 ;Foldesi 等，J.，Biochem. Biophys. Methods，1993, 26。氣標(biāo)記的寡核苷酸簡(jiǎn)化了 NMR光譜，從而允許按明確的方式從 大分子的小結(jié)構(gòu)域確定J親合與NOE體積，參見Glemarec等，J. Nucleic Acids Res.，1996， 24,2002 和 Ludwig，J. Acta Biochem. Biophys Acad Sci·，1981，16,131〇
[0015] 類似地，大量寡DNA和RNA的位點(diǎn)特異性氘化已用于通過"NMR窗口"概念研宄NMR 結(jié)構(gòu)，在所述窗口中僅寡核苷酸的小節(jié)段是NMR可見的。使用這種方法來解決以下各物的 NMR 結(jié)構(gòu)：21 聚體 RNA 發(fā)卡環(huán)，參見 Nucleic Acids Researchl99624:1187 和 Nucleosides and Nucleotides 1997, 5&6, 743 ;和31聚體莖-內(nèi)環(huán)-莖-內(nèi)環(huán)-莖-發(fā)卡環(huán)RNA。非對(duì) 映特異性C-2'（寡DNA中氣標(biāo)記的核苷區(qū)段（Journal Tetrahedron，1995,51，10065))成 功用在NMR解釋，降低的自旋擴(kuò)散收集以及噸1'、H2"以及噸1'、H2"耦合常數(shù)的提取中。
[0016] Huang 等，Acids Research，1997,25,4758-4763 示出在寡核苷酸的二維（2D) NOESY光譜中，如果嘌呤的H-8和嘧啶的H-6被氘置換，那么使核堿基與糖質(zhì)子相關(guān)聯(lián)的整 個(gè)交叉峰消失。類似地，研宄人員關(guān)注通過2H NMR研宄蛋白質(zhì)與DNA相互作用動(dòng)力學(xué)的作 用。固態(tài)2D NMR提供關(guān)于寡核苷酸中各種官能團(tuán)的移動(dòng)的有價(jià)值信息。Chirukul和其共 同工作者示出特異性氣化在確定所述結(jié)構(gòu)特征中起著極其重要的作用，參見Nucleosides， Nucleotides and Nucleic acids，2001，20,1903-1913。
[0017] 代替氫，用氘取代的酶識(shí)別或酶促結(jié)合未受到不利影響。特定序列的酶識(shí)別是寡 核苷酸關(guān)于其特異性作用的生物化學(xué)相互作用的第一步，并且氘標(biāo)記不會(huì)改變位點(diǎn)識(shí)別的 生物化學(xué)過程。類似地，已知雙鏈的雜交不受氘標(biāo)記影響，這是由于氘和氫原子半徑對(duì)于識(shí) 別模式的任何破壞都是極其接近的。
[0018] 預(yù)期代替氫氘在寡核苷酸的糖部分中的多個(gè)共價(jià)標(biāo)記（碳-氫鍵成為碳-氘鍵） 減緩寡核苷酸的消化速率，寡核苷酸的消化在細(xì)胞環(huán)境中用外切酶和內(nèi)切酶快速發(fā)生。寡 核苷酸的快速消化由寡核苷酸的較短半衰期和從身體的清除得以證明。與DNA分子相比， 這在RNA分子方面是更為顯著的。預(yù)期治療性寡核苷酸的緩慢消化為治療候選物增添了額 外的優(yōu)點(diǎn)，而同時(shí)其他物理或化學(xué)特性不受影響。期望氘化核糖寡核苷酸的各種生物化學(xué) 作用，預(yù)期氘化寡聚物減緩寡核苷酸消化成較小的片段，并且不具有關(guān)于氫鍵合、RNA酶H 校正活性或通過RISC復(fù)合物識(shí)別的作用。細(xì)胞內(nèi)水解或氘交換可導(dǎo)致氧化氘（D2O)的釋 出。
[0019] 已常規(guī)地進(jìn)行氘交換的酶促法用于氘標(biāo)記。然而，交換法不完全，這是由于酶促反 應(yīng)中存在平衡。期望氘標(biāo)記的寡核苷酸將在細(xì)胞環(huán)境中用氫類似地交換氘，從而導(dǎo)致氧化 氘在細(xì)胞環(huán)境中釋放。由于氧化氘已知為一種營(yíng)養(yǎng)劑，因此本發(fā)明的寡核苷酸可提供營(yíng)養(yǎng) 價(jià)值。
[0020] 已相當(dāng)廣泛地進(jìn)行使用氘交換用于核苷和寡核苷酸的光譜分配。核堿基殘基的氘 化已描述在質(zhì)子在C8-嘌呤和C5-胞嘧啶處用氘代亞硫酸氫銨在pH 7. 8下在脫氧寡聚物 中進(jìn)行交換中，所述交換導(dǎo)致90-95原子％的2H并入。Brush等，Biochemistry 1988, 27， 115 ;Brush等.Am. Chem. Soc. 1998,110,4405描述了在胸苷的C5-甲基處在2H2O中進(jìn)行的 鉑催化的交換。
[0021] 已經(jīng)開發(fā)了多種多樣的酶促和化學(xué)方法來用于在糖與核苷水平二者上并入氘，從 而提供高水平的氘并入（D/Η比）。氘交換的酶促法通過具有低并入水平并且提供顯著水 平的雜散共振。酶促并入具有另外的復(fù)雜性，這是由于分離氘化單核苷酸區(qū)段所要求的繁 瑣的分離技術(shù)。Schmidt 等，Ann. Chem. 1974,1856 ;Schmidt 等，Chem. Ber.，1968, 101，590 描述了 5'，5 "-2H2-腺苷的合成，其是由2'，3' -0-異亞丙基腺苷-5' -甲酸或甲基-2, 3-異 亞丙基 _D_ 核糖呋喃酸糖酸（furanosiduronic acid)制備，Dupre, M.和 Gaudemer, A.， Tetrahedron Lett. 1978, 2783。Kintanar 等，Am. Chem. Soc. 1998,110,6367 報(bào)道了可使用 硼氘化鈉或氘化鋁鋰（98原子％的2H并入），通過還原適當(dāng)?shù)?' -醛，獲得5' -氘代腺苷與 5'（R/S)-氣化胸苷的非對(duì)映異構(gòu)體混合物。Berger等，Nucleoside & Nucleotides 1987， 6, 395描述了通過在2H2O/吡啶混合物（1:1)中加熱醛、接著用NaBD4還原醛將2'脫氧鳥苷 的5' -醛衍生物轉(zhuǎn)化成5'或4' -氘代-2' -脫氧鳥苷。
[0022] Ajmera等，Labelled Compd. 1986, 23,963描述了獲得4'-氣標(biāo)記的尿苷和胸苷 (98 原子％的 2H)的程序。Sinhababu 等，J. Am. Chem. Soc. 1985,107, 7628)證明了在糖合成 過程中，在使用硼氘化鈉立體選擇性還原1，2:5, 6-二-0-異亞丙基-B-D-己呋喃糖-3-酮 水合物成為1，2:5, 6-二-0-異亞丙基-3-氘代-B-D-己呋喃核糖并且隨后進(jìn)一步進(jìn)行核 苷合成時(shí)，氘并入在腺苷的C3'（97原子％ 2H)處。Robins等，Org. Chem. 1990, 55,410報(bào) 道了在通過硼氘化鈉在乙酸中還原2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基（TBDMS)3-酮核苷時(shí)， 以實(shí)際上完全的立體選擇性在腺苷的C3'處大于95原子％的2H并入的合成。David, S. 和 Eustache, J.，Carbohyd. Res. 1971，16,46 以及 David, S.和 Eustache，J.，Carbohyd. Res. 1971，20, 319描述了 2'-脫氧-2'（S)-氘代-尿苷和胞苷的合成。所述合成通過使用 1-甲基-2-脫氧-2' -(S)-氘代呋喃核糖苷進(jìn)行。
[0023] Radatus,等，J. Am. Chem. Soc. 1971，93, 3086 描述了用于合成 2' -單氣化（R 或 S) _2'_脫氧胞苷的化學(xué)程序。這些結(jié)構(gòu)是由在用氘化鋁鋰立體特異性還原2, 3-脫氫-己 P比喃糖并且氧化所得稀糖獲得的選擇性2-單氣化-2-脫氧-D-核糖合成的。Wong等J. Am. Chem. Soc. 1978,100, 3548報(bào)道了通過涉及形成的反應(yīng)序列和LiAlD4還原烯酮二硫縮醛衍 生物，由D-阿拉伯糖獲得-脫氧-1-氘代-D-赤型-戊糖、2-脫氧-2 (S)-氘代-D-赤型-戊 糖以及2-脫氧-1，2 (S)-二氣代-D-赤型-戊糖。
[0024] Pathak 等· J.，Tetrahedron 1986,42, 5427 報(bào)道了通過用 LiAlD4還原性打開適 當(dāng)甲基2, 3-無水-β -D-呋喃核糖苷或β -D-呋喃木糖苷，立體特異性合成所有八種2'或 2"_氘代_2' -脫氧核苷。Wu等· J. Tetrahedron 1987,43, 2355描述了對(duì)于脫氧與核糖核 苷二者所有2'，2"_二氘代-2' -脫氧核苷的合成，其是由糖的C2'的氧化開始并且隨后 似804或LiAlD 4用還原，接著用氘化三丁基錫脫氧。Roy等.J. Am. Chem. Soc. 1986,108,1675 報(bào)道了 2'，2" -二氘代-2' -脫氧鳥苷和胸苷可由2-脫氧核糖5-磷酸使用2-脫氧核糖 5-磷酸醛縮酶在2H2O中制備，從而取得大約90原子％的氘化。
[0025] 因此，顯然糖殘基的各位置可選擇性地進(jìn)行標(biāo)記。許多這些氘化核苷已用于關(guān)于 核苷和寡核苷酸的內(nèi)部運(yùn)動(dòng)的固態(tài) 2H-NMR研宄，參見Hiyama等J. Am. Chem. Soc. 1989，111， 8609 ;Alam，T 和 Drobny，G.P.，Biochemistry，1990,29,3421 ;Alam 等，.Biochemistry， 1990, 29,9610 ;Huang 等，J. Am. Chem. Soc. 1990,112,9059 ;Drobny，G. Ρ·等，Biochemistry， 1991，30,9229。在固態(tài)2H-NMR光譜法的溫度依賴性線形分析中，2'對(duì)比2"標(biāo)記的立