專利名稱：：免疫刺激性寡核糖核苷酸的制作方法免疫刺激性寡核糖核苷酸
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及免疫刺激性分子。更特別地，本發(fā)明涉及具有免疫刺激活性的核糖核酸(RNA)分子，包括寡核糖核苷酸。
背景技術(shù)：
：Toll樣受體(TLR)是高度保守的模式識別受體(PRR)多肽家族，其識別與病原體結(jié)合的分子模式(PAMP)，在哺乳動物的先天免疫(innateimmunity)中起關(guān)鍵作用。目前已經(jīng)鑒定出了至少十個(gè)家族成員，它們被命名為TLR1-TLRIO。多種TLR的胞漿結(jié)構(gòu)域特征在于Toll-白介素1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域。MedzhitovRetal.(1998)Mo/Ce〃2:253-8。TLR對微生物侵入的識別引發(fā)信號級聯(lián)放大的激活，這在果蠅(/>0^/7")和哺乳動物中是保守的。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)含TIR結(jié)構(gòu)域的適體蛋白MyD88與TLR結(jié)合，將與白介素1受體結(jié)合的激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子(TNF)受體結(jié)合的因子6(TRAF6)募集至TLR。人們認(rèn)為，MyD88-依賴性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致NF-kB轉(zhuǎn)錄因子和c-JunNH2末端激酶(Jnk)促有絲分裂劑(mitogen)-激活的蛋白激酶(MAPK)的活化，這是免疫激活中及炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。綜述參閱AderemAetal.(2000)A^wre406:782-87和AkiraSetal.(2004)Na/Wev/附mtmo/4:499-511。已經(jīng)鑒定出了大量的特異性TLR配體。TLR2的配體包括肽聚糖和脂肽。YoshimuraAetal.(1999)//續(xù)國/163:1-5;YoshimuraAetal.(1999)/7mmw"o/163:1-5;AliprantisAOetal.(1999)5Wewce285:736-9。月旨多糖(LPS)是TLR4的配體。PoltorakAetal.(1998)5We"ce282:2085-8;HoshinoKetal.(1999)J/附mM"o/162:3749-52。細(xì)菌鞭毛蛋白是TLR5的配體。HayashiFetal.(2001)A/a似"410:1099-1103。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)肽聚糖不僅是TLR2的配體，而且還是TLR6的配體。OzinskyAetal.(2000)尸racV^/XcadSci'(7&497:13766-71;TakeuchiOetal.(2001)/m/mmo/13:933-40。最近報(bào)導(dǎo)某些低分子量合成化合物咪唑喹啉咪喹莫德(imidazoquinolinesimiquimod，R-837)和瑞喹莫德(resiquimod，R-848)是TLR7和TLR8的配體。HemmiHetal.(2002)/mww"o/3:196-200;JurkMetal.(2002)7Vi^/mmwwo/3:499。從近來發(fā)現(xiàn)未甲基化的細(xì)菌DNA及其合成的類似物(CpGDNA)是TLR9的配體(HemmiHetal.(2000)A^mm408:740-5;BauerSetal.(2001)iVoc7Vfl/Mcad5Wt/&498，9237-42)開始，已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)某些TLR的配體包括某些核酸分子。目前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)某些類型的RNA以序列非依賴性或序列依賴性形式是免疫刺激性的。另外，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)這些多種免疫刺激性RNA能刺激TLR3、TLR7或TLR8。
發(fā)明內(nèi)容一般而言，本發(fā)明涉及含有某些免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性的寡核糖核苷酸(ORN)，以及含有這類免疫刺激性O(shè)RN的相關(guān)免疫剌激性組合物，和這類免疫刺激性O(shè)RN和組合物的使用方法。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN適用于任何用于刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的裝置(setting)或應(yīng)用中。如下文所公開的，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN尤其適用于制備含有佐劑、疫苗、和其它藥劑的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療多種病癥，包括感染、癌癥、變態(tài)反應(yīng)和哮喘。因此，本發(fā)明在某些方面涉及含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的免疫刺激性組合物，以及它們的使用方法。如下文所公開的，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和免疫刺激性組合物尤其適用于下述方法中，所述方法用于激活免疫細(xì)胞，疫苗接種受試者，治療患有免疫系統(tǒng)缺陷的受試者，治療患有感染的受試者，治療患有自身免疫疾病的受試者，治療患有癌癥的受試者，治療患有變應(yīng)性病癥的受試者，治療患有哮喘、氣道重建(airwayremodeling)、促進(jìn)表位擴(kuò)展和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的受試者。如下文更詳細(xì)地公開的，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的特征在于它們包含至少一種序列依賴性的免疫刺激性RNA基序。序列依賴性的免疫刺激性RNA基序通常是短的RNA序列，盡管在某些實(shí)施方案中該基序也可以含有修飾，例如經(jīng)修飾的核苷酸間磷酸聯(lián)接、經(jīng)修飾的核堿基(rmcleobase)、經(jīng)修飾的糖、核苷酸類似物或其任何組合。如下文更詳細(xì)地描述的，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性RNA基序存在于本發(fā)明的較長免疫刺激性O(shè)RN的環(huán)境中。免疫刺激性RNA基序也可以存在于嵌合的DNA:RNA核酸分子的環(huán)境中。序列依賴性的免疫刺激性RNA基序和加入有了這些基序的免疫刺激性O(shè)RN被公開為TLR8的激動劑。更具體地，至少某些序列依賴性免疫刺激性RNA基序、免疫刺激性O(shè)RN和免疫刺激性DNA:RNA核酸分子被公開為是TLR8的激動劑而不是TLR7的激動劑。根據(jù)本發(fā)明一些方面的免疫刺激性RNA基序是N-U-RrR2。N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些實(shí)施方案中，N為腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。U是尿嘧啶或其衍生物。R是核糖核苷酸，其中R,和R2至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是U,除非N-U-RrR2含有至少兩個(gè)A。本發(fā)明的ORN含有至少一個(gè)以及在一些實(shí)施方案中含有多于一個(gè)(即2、3或4個(gè))免疫刺激性基序N-U-RrR2。ORN不含有TLR7/8基序。ORN優(yōu)選長度為4-100，并任選地含有至少一處主鏈修飾。在一些實(shí)施方案中N-U-RpR2可含有至少3個(gè)As或至少2個(gè)Cs。任選地，N-U-RrR2含有至少一個(gè)G或C。在一些實(shí)施方案中，ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQIDNO:89)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN基序通過非核苷酸接頭與5'核糖核苷酸分隔。還在其它一些實(shí)施方案中，ORN基序通過非核苷酸接頭與3'核糖核苷酸分隔。任選地，ORN基序通過非核苷酸接頭與5'和3'核糖核苷酸分隔。ORN還包含可藥用的運(yùn)載體，其任選地是脂質(zhì)運(yùn)載體如N-[l-(2,3-二油酰氧)丙基]-N，N，N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN不與DOTAP復(fù)合。ORN可以是單鏈或雙鏈的。在其它一些實(shí)施方案中，ORN含有至少一個(gè)AU。還在其它一些實(shí)施方案中，ORN含有至少一個(gè)CU。在一些實(shí)施方案中，ORN為以下之一A*U*A*G*G*C*A*C(SEQIDNO:4)、G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C(SEQIDNO:11)、A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U(SEQIDNO:12)、U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U(SEQIDNO:13)、A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A(SEQIDNO:16)、A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U(SEQIDNO:17)、A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U(SEQIDNO:18)、C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U(SEQIDNO:24)、U*U*A*U*U*A*U(SEQIDNO:30)、U*A*U*A*U*A*U(SEQIDNO:33)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C(SEQIDNO:48)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C(SEQIDNO:76)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C*C*C(SEQIDNO:42)C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C(SEQIDNO:39)C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C卿IDNO:65)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C(SEQIDNO:44)C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C(SEQIDNO:47)C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C*C*C(SEQIDNO:38)C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C(SEQIDNO:37)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQIDNO:40)C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C(SEQIDNO:55)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQIDNO:82)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A*C*C(SEQIDNO:85)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*G*U*A*C*C(SEQIDNO:63)C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C(SEQIDNO:43)C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*U*C*C*C(SEQIDNO:36)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQIDNO:87)C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C*C*C(SEQIDNO:45)C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C(SEQIDNO:41)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*G*C*C(SEQIDNO:83)C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*C*C*C*C*C(SEQIDNO:46)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQIDNO:88)C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C*C*C(SEQIDNO:35)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*C*C*C(SEQIDNO:84)，C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQIDNO:56)。ORN特別排除TLR7/8基序。TLR7/8基序可含有例如選自以下的核糖核苷酸序列①5'-C/U畫U畫G/U畫U畫3',(ii)5'-R-U隱R-G隱Y-3'，(iii)5'-G-U陽U-G-B-3',(iv)5'-G-U-G-U-G/U-3'，和(v)5'隱G/C-U誦A/C-G-G-C-A-C-3'，其中C/U為胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U為鳥嘌呤(G)或U，R為嘌呤，Y為嘧啶，B為U、G或C，G/C為G或C，且A/C為腺嘌呤(A)或C。在多種實(shí)施方案中，5'-C/U-U-G/U-U-3'為CUGU、CUUU、UUGU或uuuu。在多種實(shí)施方案中，5'-R-U-R-G-Y-3'為GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGU或AUGGC。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿基序列為GUAGUGU。在多種實(shí)施方案中，5'-G-U-U-G-B-3'為GUUGU、GUUGG或GUUGC。在多種實(shí)施方案中，5'-G-U-G-U-G/U-3'為GUGUG或GUGUU。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿基序列為GUGUUUAC。在多種實(shí)施方案中，5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'為GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC或CUCGGCAC。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN和佐劑的免疫刺激性組合物。在多種實(shí)施方案中，佐劑為產(chǎn)生儲存作用(depoteffect)的佐劑、免疫刺激性佐劑、或產(chǎn)生儲存作用并刺激免疫系統(tǒng)的佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明該方面的免疫剌激性組合物是免疫刺激性O(shè)RN和佐劑的綴合物。在根據(jù)本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN與佐劑共價(jià)連接。在其它一些實(shí)施方案中它們不綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑是TLR9的激動劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑是免疫刺激性的CpG核酸。本發(fā)明的組合物可任選地含有抗原。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了下述疫苗，其中所述疫苗含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗原。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種疫苗，所述疫苗含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗原的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明該方面的綴合物含有與抗原共價(jià)連接的免疫刺激性O(shè)RN。在其它一些實(shí)施方案中，它們不綴合。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以是抗原本身?？乖梢允侨魏慰乖?，包括癌癥抗原、微生物抗原或變應(yīng)原。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了免疫刺激性組合物，所述組合物含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN與親脂部分的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性的ORN與親脂部分共價(jià)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，親脂部分選自膽固醇基、棕櫚基和脂肪?；Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方案中，親脂部分是膽固醇的衍生物，例如膽固醇基。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN含有至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸。所述至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸通?？梢猿霈F(xiàn)在免疫刺激性RNA基序之外的任何地方。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明也考慮了包含非連續(xù)的脫氧核糖核苷酸的免疫刺激性O(shè)RN。在多個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸是免疫剌激性O(shè)RN的5'端、3'端或5'和3'兩端。所述至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸也對應(yīng)于嵌合的DNA:RNA分子的DNA部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合的DNA:RNA分子的DNA組分包括CpG核酸，即TLR9激動劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合的DNA:RNA分子的DNA和RNA部分通過核苷酸間磷酸鍵共價(jià)連接。在另一實(shí)施方案中，嵌合的DNA:RNA分子的DNA和RNA部分通過接頭(例如非核苷酸接頭)共價(jià)連接。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了免疫刺激性組合物，所述組合物包含共價(jià)閉合的、部分單鏈的、椏鈴形的核酸分子，其中該分子的至少一個(gè)單鏈部分包含本發(fā)明的免疫刺激性RNA基序。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明前述任何方面的組合物和任選的可藥用運(yùn)載體的藥物組合物，所述組合物與選自以下的遞送媒介物結(jié)合陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、螺旋狀的(cochleate;)、病毒顆粒、免疫刺激性復(fù)合物(ISCOM)、微粒、微球、毫微球、單層囊泡(LUV)、多層囊泡、水包油乳劑、油包水乳劑、乳體(emulsome)和聚陽離子肽。在根據(jù)本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含抗原?？梢栽趪婌F器或吸入器中配制ORN，例如定量吸入器(metereddoseinhaler)或干粉吸入器。在一些實(shí)施方案中，ORN還包含額外的組合物，例如化學(xué)治療劑、抗病毒劑或可藥用運(yùn)載體?？伤幱眠\(yùn)載體可以被配制為用于注射或粘膜施用。另外，根據(jù)本發(fā)明的這些方面和其它方面，在多種實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN可任選包含至少一個(gè)5'-5'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)3'-3'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)包含接頭部分的5'-5'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)包含接頭部分的3'-3'核苷酸間聯(lián)接，或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭部分是非核苷酸接頭部分。另外，還根據(jù)本發(fā)明的這些方面和其它方面，在多種實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN可任選包含至少一個(gè)2'-2'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)2'-3'核苷酸間聯(lián)接、至少2'-5'核苷酸間聯(lián)接或其任何組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)2'-2'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)2'-3'核苷酸間聯(lián)接、或至少2'-5'核苷酸間聯(lián)接存在于免疫刺激性RNA基序之外。還根據(jù)本發(fā)明的這些和其它方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN包含至少一個(gè)倍增單元(multiplierunit)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN可以具有分支結(jié)構(gòu)。分支的組合物可以包含任意組合的3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'核苷酸間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN包含至少兩個(gè)倍增單元，產(chǎn)生所謂的樹狀聚體(dendrimer)。另外，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN可包含兩個(gè)或更多的免疫刺激性RNA基序，其例如在分支結(jié)構(gòu)的不同臂上沿線性O(shè)RN隨機(jī)排列，或均沿線性O(shè)RN隨機(jī)排列并位于分支結(jié)構(gòu)的不同臂上。分支結(jié)構(gòu)(包括樹狀聚體)可任選的包含至少一個(gè)免疫剌激性的CpG核酸，例如作為分支結(jié)構(gòu)的獨(dú)立臂。還根據(jù)本發(fā)明的這些和其它方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN不包含CGDNA或RNA二核苷酸。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于下調(diào)免疫抑制性CD4+調(diào)節(jié)(Treg)細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括下述步驟將CD4+Treg細(xì)胞與有效量的含本發(fā)明的TLR8-特異性免疫刺激ORN的組合物接觸，以降低CD4+Treg細(xì)胞的抑制作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸未連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物含有TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性的ORN和免疫刺激性CpG核酸作為綴合物存在。本發(fā)明另一方面提供了用于調(diào)控受試者中免疫應(yīng)答的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一些實(shí)施方案中，ORN可以被遞送給受試者，以在受試者中治療自身免疫疾病或氣道重建。ORN可以單獨(dú)或與抗原一起被施用給受試者。任選地，以例如口、鼻、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和經(jīng)皮的途徑遞送ORN。ORN可以以有效量遞送給受試者以誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)，例如TNFa、IL-IO、IL-6、IFN-7、MCP1和IL-12。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了對受試者疫苗接種的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用抗原和本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有傳染性疾病或具有患傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有病毒感染。病毒感染可以是例如乙型肝炎或丙型肝炎。也可以對受試者施用抗病毒劑。任選地，抗病毒劑與ORN連接。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有癌癥或具有患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，也對受試者施用化學(xué)治療或輻射。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有癌癥或具有患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的組合物的步驟，所述組合物含有本發(fā)明的TLR8-特異性免疫刺激性O(shè)RN以降低CD4+Treg細(xì)胞的抑制作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG不連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸作為綴合物存在。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有變應(yīng)性病癥或具有患變應(yīng)性病癥的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有變應(yīng)性鼻炎。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有哮喘或具有患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，哮喘是被病毒感染加重的哮喘。ORN可以單獨(dú)或與變應(yīng)原一起被施用。本發(fā)明的另一方面提供了用于治療患有氣道重建的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于提高抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括下述步驟對需要增加的ADCC的受試者施用有效量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗體，以增加ADCC。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是對癌癥抗原或癌細(xì)胞表達(dá)的其它抗原特異的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體為IgG抗體。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于增強(qiáng)表位擴(kuò)展的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括下述順序步驟將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞與抗原接觸，隨后將該細(xì)胞與至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下述步驟以能有效誘導(dǎo)多重表位特異性免疫應(yīng)答的量對受試者施用包含抗原和佐劑的疫苗，隨后對受試者施用至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN。該方法在一個(gè)實(shí)施方案中涉及應(yīng)用治療方案，所述方案導(dǎo)致受試者中的免疫系統(tǒng)抗原暴露，然后以能有效誘導(dǎo)多重表位特異性免疫應(yīng)答的量對受試者施用至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN。在多種實(shí)施方案中，治療方案為手術(shù)、輻射、化學(xué)治療、其它癌癥藥劑、疫苗或癌癥疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少兩份劑量的免疫刺激性O(shè)RN彼此隔開至少一天到一周被施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少兩份劑量的免疫刺激性O(shè)RN彼此隔開至少一周到一個(gè)月被施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少兩份劑量的免疫刺激性O(shè)RN彼此隔開至少一個(gè)月到六個(gè)月被施用。一方面，本發(fā)明是通過將表達(dá)TLR8的細(xì)胞與下述用量的包含N-U-RrR2的RNA寡核糖核苷酸(ORN)接觸，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中R4和R2至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，其中R不是U，除非N-U-RrR2含有至少兩個(gè)A，其中所述ORN不包含TLR7/8基序，并且其中所述ORN長度為4-100，所述用量有效剌激前炎性細(xì)胞因子生產(chǎn)并且其中應(yīng)答于ORN的IFN-ce生產(chǎn)相對于背景而言不被顯著誘導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)答于ORN的IFN-o;生產(chǎn)少于300pg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQIDNO:89)。ORN可以與N-[l-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N，N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)復(fù)合或不復(fù)合。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)TLR8的細(xì)胞是單核細(xì)胞或mDC。還在其它一些實(shí)施方案中，表達(dá)TLR8的細(xì)胞是體外的或體內(nèi)的。本發(fā)明的這些和其它特征將在發(fā)明詳述部分被更詳細(xì)地描述。附圖概述圖1是描述在PBMC刺激時(shí)由ORN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)。通過測量IFN-o;和TNF-o;細(xì)胞因子生產(chǎn)，觀察到TLR8和TLR7/8之間的差異。在完全滴定曲線上用與DOTAP(25)ig/ml，1/3稀釋度)復(fù)合的指定ORN(2pM，1/3稀釋度)或用R-848(2pM，1/3稀釋度)刺激人PBMC。16小時(shí)后收集上清液，并通過ELISA測量IFN-o;(圖la)禾nTNF-a(圖lb)。數(shù)據(jù)顯示了至少三份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三個(gè)血供體的均值。DOTAP單獨(dú)不顯示作用。ORN可與DOTAP復(fù)合，R-848不復(fù)合。DOTAP單獨(dú)是對照。在圖lc中，用與DOTAP(2.2ng/ml)或與R-848(2pM)復(fù)合的0.2pM指定的ORN刺激人PBMC。16小時(shí)后收集上清液并通過ELISA測量IFN-a(左圖)和TNF-ce(右圖)。數(shù)據(jù)顯示了3個(gè)供體的均值(士SEM)。圖2是一組柱狀圖，其描述了經(jīng)分離的pDC(圖2a)、單核細(xì)胞(圖2b)和mDC(圖2c)刺激時(shí)由ORN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)。用與lO^g/mlDOTAP、0.5nMCpGODN或DOTAP復(fù)合的0.5pMORN或單獨(dú)的培養(yǎng)基刺激細(xì)胞，并測量IFN-a(圖2a)、TNF-of(圖2c)和IL-12p40(圖2c)。圖3是一組柱狀圖，其闡述了PBMC刺激時(shí)由ORN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)。用與10jig/mlDOTAP復(fù)合的指定ORN(0.5pMORN)刺激人PBMC，并通過ELISA技術(shù)測量IFN-a(圖3A)和TNF-a(圖3B)和通過Luminex技術(shù)測量細(xì)胞因子生產(chǎn)。圖4是闡述指定ORN的(圖4a)和TNF-a(圖4b)最大活性比較的柱狀圖。用與DOTAP(從25i!g/ml開始，稀釋度1/3)復(fù)合的ORN(7種濃度，從2pg/ml開始，1/3稀釋度)刺激人PBMC，并對兩份單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中0.6pM處3-6個(gè)血供體的平均最大活性進(jìn)行了測定。圖5是闡述IFN-ce最大活性(圖5a)與IFN-aEC50(圖5b)比較的柱狀圖。用于DOTAP復(fù)合的ORN刺激人PBMC并測量IFN-a。圖6是一組圖，其比較了帶有TLR8(SEQIDNO:13)或TLR7/8(SEQIDNO:21)的ORN對3個(gè)血供體的PBMC、經(jīng)分離的pDC或經(jīng)分離的單核細(xì)胞的滴定曲線。用與DOTAP(從25pg/ml開始，％稀釋度)復(fù)合的ORN(4種濃度，從lpg/ml開始，W稀釋度)刺激細(xì)胞。16小時(shí)后收集上清液并通過Luminex技術(shù)測量細(xì)胞因子生產(chǎn)。圖顯示SEQIDNO:21(0、3nM)細(xì)胞因子生產(chǎn)百分比。圖7-1到7-4顯示了一組柱形圖，其闡述在任何濃度的3個(gè)血供體對PMBC、經(jīng)分離的單核細(xì)胞、經(jīng)分離的pDC和CD14-CD123-PBMC的平均最大活性。用與DOTAP(從25嗎/ml開始，W稀釋度)復(fù)合的ORN(4種濃度，從lpg/ml開始，^稀釋度)刺激細(xì)胞。16小時(shí)后收集上清液并通過Luminex技術(shù)測量細(xì)胞因子生產(chǎn)。紅色正方形指示在DOTAP和培養(yǎng)基的背景上的陽性反應(yīng)。圖8是一組柱形圖，其顯示了TLR8(SEQIDNO:13)和TLR7/8(SEQIDNO:21)ORN之間的差異。用與DOTAP(從25pg/ml開始，％稀釋度)復(fù)合的ORN(4種濃度，從l)ig/ml開始，W稀釋度)刺激細(xì)胞。16小時(shí)后收集上清液并通過Luminex技術(shù)測量細(xì)胞因子生產(chǎn)。圖表顯示測量的任何濃度下的平均最大細(xì)胞因子生產(chǎn)，其表示為TLR8ORN(SEQIDNO:13)比TLR7/8ORN(SEQIDNO:21)的百分比。針對經(jīng)分離的pDC、PBMC、經(jīng)分離的單核細(xì)胞和CD123-CD14-PBMC顯示。圖9是一組圖和曲線，其顯示了經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中通過TLR8作用的TLR8ORN(SEQIDNO:13)和TLR7/8ORN(SEQIDNO:21)的反應(yīng)。用指定的ORN將HEK-293細(xì)胞刺激16小時(shí)，所述HEK-293細(xì)胞用NF/cB-螢光素酶讀出報(bào)告子和人TLR8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。16個(gè)小時(shí)后去除上清液，將細(xì)胞裂解并測量螢光素酶活性或細(xì)胞因子水平。圖9a和9b顯示了刺激后NF/cB-螢光素酶的倍數(shù)誘導(dǎo)。圖9c顯示了存在抑制劑時(shí)刺激后NF/cB-螢光素酶的倍數(shù)誘導(dǎo)。圖9d顯示了通過螢光素酶測定測量的刺激后的IP-10刺激。圖IO是一組圖表，其顯示了用富含AU或富含GU的ORN刺激的人pDC上的表面標(biāo)記物表達(dá)。用與25嗎/mlDOTAP復(fù)合的lpMORN或單獨(dú)用DOTAP(圖10a)，或指定量的與DOTAP復(fù)合的ORN或單獨(dú)用DOTAP(圖10b-10c)孵育CD123+經(jīng)純化的pDC(圖10a和10b)或經(jīng)分離的單核細(xì)胞(圖lOc)。16小時(shí)后收集細(xì)胞并用CD123、CDllc和HLA-DR抗體(圖10a和10b)或CD14和CD19(圖10c)染色。通過CD86(圖10a和10b)或CD80(圖10c)表達(dá)測量細(xì)胞表面標(biāo)記物激活。圖10a顯示FACS分析，其證明了富含AU的ORN(SEQIDNO:13)和富含GU的ORN(SEQIDNO:21)在pDC剌激時(shí)的CD86表面標(biāo)記物表達(dá)中顯示差異。圖10b是闡述人pDC刺激時(shí)的CD86表面標(biāo)記物表達(dá)是劑量依賴性的。圖10c是顯示以下內(nèi)容的圖富含AU的ORN(SEQIDNO:13)和富含GU的ORN(SEQIDNO:21)在人PBMC(數(shù)據(jù)未顯示)和CD14-陽性細(xì)胞刺激時(shí)在CD80表面標(biāo)記物表達(dá)中顯示無差異。圖11是一組柱形圖，其顯示了TLR8ORN(SEQIDNO:13)和TLR7/8ORN(SEQIDNO:21)之間的差異。使用SEQIDNO:5ORN作為對照。將牛PBMC與10嗎/mlORN(HD)或2.5pg/mlORN(LD)孵育48小時(shí)。收集上清液并用ELISA分析。圖lla-c分別顯示了IL-12、IFN-y和TNF-a的水平。圖12是一組展示出下述內(nèi)容的圖表鼠細(xì)胞體內(nèi)或體外不應(yīng)答于富含AU的ORNSEQIDNO:13。使用的細(xì)胞是小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞(圖12a)、J774細(xì)胞(圖12b)、經(jīng)純化的小鼠CDllc+細(xì)胞(svl29小鼠)(圖12c-12g)和體內(nèi)小鼠細(xì)胞。通過ELISA評價(jià)細(xì)胞因子濃度。圖13是展示下述內(nèi)容的圖表大鼠脾細(xì)胞不應(yīng)答于富含AU的ORNSEQIDNO:13。將來自3只Sprague-Dawley大鼠的脾細(xì)胞合并，并用指定濃度的SEQIDNO:21、SEQIDNO:13(均與62.5pg/mlDOTAP復(fù)合，1/5稀釋度)、R-848或DOTAP單獨(dú)(62.5嗎/ml->1/5稀釋度)刺激。20小時(shí)后收集上清液并通過ELISA測量TNF-a水平。發(fā)明詳述本發(fā)明的一部分涉及本發(fā)明的發(fā)明人對大量序列特異性的免疫刺激性RNA基序的發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有免疫刺激性RNA基序的分子(單獨(dú)或與某些其它成分組合)是重要的免疫剌激性化合物，其在用于治療患有病癥或具有患病癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者的大量方法中有用，所述病癥中誘導(dǎo)、增加或更改免疫應(yīng)答會是有利的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所使用的本發(fā)明的免疫刺激性組合物是本發(fā)明的免疫剌激性O(shè)RN。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些序列特異性RNA基序是免疫刺激性的，其通過TLR8作用，與作用于TLR7和TLR8的其它基序(富含GU和富含CU)相反。RNA寡核苷酸(RON)(優(yōu)選含有富含AU的序列)通過TLR8刺激免疫應(yīng)答。己經(jīng)在不同種類的ORN(例如含有含AU和含GU重復(fù)的ORN)中觀察到IFN-a、TNF-a、IFN-y和IL-12生產(chǎn)之間的差異。有趣的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN生產(chǎn)強(qiáng)的前炎性細(xì)胞因子應(yīng)答，而IFN-a和IFN-a相關(guān)的分子除外。用這些新穎的ORN刺激時(shí)IFN-of生產(chǎn)減少或缺乏。根據(jù)本發(fā)明一些方面的免疫刺激性RNA基序?yàn)镹-U-RrR2。N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些實(shí)施方案中，N為腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。U是尿嘧啶或其衍生物。R是核糖核苷酸，其中Rt和R2至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是U，除非N-U-RrR2含有至少兩個(gè)A。本發(fā)明的ORN含有至少一個(gè)和在一些實(shí)施方案中含有多于一個(gè)(即2、3或4個(gè))免疫刺激性基序N-U-RrR2。ORN不含有TLR7/8基序。ORN是寡核苷酸。任選地，該寡核苷酸長度為4-100。ORN長度也可以是例如8-40、15-25或20-30個(gè)核苷酸。ORN任選地含有至少一個(gè)主鏈修飾。在一些實(shí)施方案中N-U-RpR2可含有至少3個(gè)As或至少2個(gè)Cs。任選地，N-U-R「R2含有至少一個(gè)G或C。在一些實(shí)施方案中，ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQIDNO:89)。ORN還可包含可藥用的運(yùn)載體，其任選地是脂質(zhì)運(yùn)載體如N-[l-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N，N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN不與DOTAP復(fù)合。在其它一些實(shí)施方案中可藥用運(yùn)載體可以是肽，如聚陽離子肽。聚陽離子肽包括例如多重的多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚肽(其在多于5個(gè)、特別是多于8個(gè)氨基酸殘基的范圍內(nèi)含有多于50%的堿性氨基酸、特別是精氨酸或賴氨酸殘基)或其混合物，并可例如含有天然存在的昆蟲抗菌蛋白質(zhì)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN含有至少一個(gè)AU。除了是序列特異性的以外，作為單鏈RNA、部分雙鏈RNA或完全雙鏈RNA的免疫刺激性RNA基序是有效的。對本發(fā)明的ORN和具有TLR7/8基序(即含GU的重復(fù))的ORN而言，觀察到IFN-o;和IFN-a相關(guān)分子和其它前炎性細(xì)胞因子如TNF-a、IFN-7、IL-IO、IL-6和IL-12的生產(chǎn)之間的清晰差異。具有N-U-R「R2基序的本發(fā)明的ORN，例如那些含有AU或AUU重復(fù)(SEQIDNO:12，SEQIDNO:13)的ORN在PBMC和pDC刺激時(shí)顯示無IFN-a細(xì)胞因子生產(chǎn)。相反，具有一列中三個(gè)或更多U(SEQIDNO:14，SEQIDNO:15)的ORN誘導(dǎo)IFN-a生產(chǎn)，盡管存在As。有趣的是，使用相同的、單室用A交換G的ORN組時(shí)，觀察到PBMC刺激時(shí)的強(qiáng)IFN-a生產(chǎn)。本文存在的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地提示兩個(gè)不同ORN種類的存在一種作用于表達(dá)TLR8的細(xì)胞，如單核細(xì)胞和mDC(SEQIDNO:12，SEQIDNO:13,SEQIDNO:16-SEQIDNO:18)、含本發(fā)明的N-U-RrR2基序的ORN，另一種作用于表達(dá)TLR7/8二者的細(xì)胞，例如含有CU、GU和GUU序列的單核細(xì)胞、mDC和pDC(SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:19-SEQIDNO:23)。因此，本發(fā)明的ORN具有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而不誘導(dǎo)相對于背景的顯著量IFN-a或IFN-ce相關(guān)分子的能力。相對于背景的顯著量的IFN-a或IFN-a相關(guān)分子優(yōu)選是相對于背景的IFN-o;或IFN-a相關(guān)分子水平改變少于20%。在一些實(shí)施方案中，其少于15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在其它一些實(shí)施方案中，被誘導(dǎo)的IFN-a或相關(guān)分子等于背景或少于背景水平。還在其它一些實(shí)施方案中，被本發(fā)明ORN誘導(dǎo)的IFN-a少于或等于被TLR7/8ORN誘導(dǎo)的IFN-ce的20%。被本發(fā)明的ORN誘導(dǎo)的IFN-a在體外測試中可任選的少于300pg/ml，或可以具有大于1.5pM的EC50。本文使用的IFN-a相關(guān)分子是與IFN-a表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞因子或因素。這些分子包括但不限于MIPl-/3、IP-10和MIPl-a。目前報(bào)導(dǎo)CD4+Treg細(xì)胞表達(dá)TLR8，且這些細(xì)胞中的TLR8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低或逆轉(zhuǎn)了它們的免疫刺激性功能。PengGetal.(2005)Science309:1380-4。在患有多種類型癌癥的患者中觀察到增加的CD4+Treg細(xì)胞種群，其中免疫抑制可有助于免疫"逃逸"和下調(diào)這些癌癥的生長。因此，預(yù)計(jì)Treg-介導(dǎo)的抑制的反轉(zhuǎn)在治療癌癥中是有利的。PRN特別排除TLR7/8基序。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TLR7/8基序可以產(chǎn)生顯性結(jié)果，其屏蔽了本發(fā)明ORN的獨(dú)特的免疫刺激特性。TLR7/8基序包括例如核糖核苷酸序列，如5'-C/U-U-G/U-U-3'、5'-R-U-R-G-Y-3'、5'-G-U-U-G-B-3'、5'-G-U-G-U-G/U-3'或5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'。C/U是胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U是鳥嘌呤(G)或U，R是嘌呤，Y是嘧啶，B是U、G或C，G/C是G或C，A/C是腺嘌呤(A)或C。5'-C/U-U-G/U-U-3'可以是CUGU、CUUU、UUGU或UUUU。在多個(gè)實(shí)施方案中，5'-R-U-R-G-Y-3'是GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGU或AUGGC。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿基序列是GUAGUGU。在多個(gè)實(shí)施方案中，5'-G-U-U-G-B-3'是GUUGU、GUUGG或GUUGC。在多個(gè)實(shí)施方案中，5'-G-U-G-U-G/U-3'是GUGUG或GUGUU。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿基序列是GUGUUUAC。在多個(gè)實(shí)施方案中，5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'是GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC或CUCGGCAC。一般而言，本發(fā)明涉及免疫刺激性寡核糖核苷酸，其包含一個(gè)或多個(gè)免疫刺激性RNA基序、含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的免疫剌激性O(shè)RN的免疫刺激性組合物，和本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和免疫剌激性組合物的使用方法。本文使用的術(shù)語"RNA"和等效的"天然RNA"旨在表示通過3'-5'磷酸二酯鍵共價(jià)連接在一起的兩個(gè)或更多的核糖核苷酸(即每個(gè)分子包含與磷酸基和嘌呤或嘧啶核堿基(例如鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)連接的一個(gè)核糖)。免疫剌激性的RNA基序可以存在于免疫刺激性O(shè)RN的末端(當(dāng)免疫刺激性O(shè)RN具有游離末端時(shí))。例如，具有游離末端的免疫刺激性O(shè)RN和位于免疫刺激性O(shè)RN末端的免疫刺激性RNA基序可以作為XaM或作為MXb存在，其中M表示免疫刺激性RNA基序，Xa和Xb各自獨(dú)立地表示免疫刺激性O(shè)RN除免疫刺激性RNA基序外的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的核苷酸?；蛘?，免疫刺激性RNA基序可以在其兩側(cè)末端連接有免疫刺激性O(shè)RN的至少一個(gè)額外的核苷酸，無論該免疫剌激性O(shè)RN是否具有游離末端。例如，具有游離末端和免疫刺激性RNA基序側(cè)翼的核苷酸的免疫刺激性O(shè)RN可以作為XJVlXb存在，其中M表示免疫刺激性RNA基序，Xa和Xb各自獨(dú)立地表示免疫刺激性O(shè)RN除免疫刺激性RNA基序外的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的核苷酸。在不同的實(shí)施方案中，包含免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性O(shè)RN可含有單個(gè)基序或多于一個(gè)的免疫刺激性RNA基序。單個(gè)免疫剌激性O(shè)RN中具有兩個(gè)或更多免疫刺激性RNA基序被認(rèn)為可能是有利的，例如如果基序被隔開使得免疫刺激性O(shè)RN能夠結(jié)合兩個(gè)或更多的TLR的時(shí)候。例如，免疫刺激性O(shè)RN可以結(jié)合兩個(gè)或更多的TLR8受體，從而擴(kuò)增或修飾得到的免疫刺激作用。當(dāng)免疫刺激性O(shè)RN包含多于一個(gè)免疫刺激性RNA基序時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中免疫刺激性O(shè)RN可作為MtXM2存在，其中M!和M2各自獨(dú)立地表示免疫刺激性RNA基序，X表示免疫刺激性O(shè)RN除免疫刺激性RNA基序外的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，X包含本文所述的非核苷酸接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，X包含本文所述的分支單元。當(dāng)免疫刺激性O(shè)RN中存在多于一個(gè)免疫刺激性RNA基序時(shí)，該基序一般可以在沿著免疫刺激性O(shè)RN的任何位置發(fā)生。例如，當(dāng)存在兩個(gè)基序時(shí)，它們可各自存在于免疫刺激性O(shè)RN的末端?；蛘?，一個(gè)基序可以存在于一個(gè)末端，一個(gè)基序可以通過免疫刺激性O(shè)RN的至少一個(gè)外的核苷酸包圍在其兩側(cè)末端。還在另一實(shí)施方案中，各基序可以通過免疫刺激性O(shè)RN的至少一個(gè)額外的核苷酸包圍在其兩側(cè)末端。免疫刺激性O(shè)RN包括但不限于以下，以從左到右讀出5'到3'顯示在一些實(shí)施方案中，ORN是下表1和表2顯示的活性O(shè)RN之一，例如以下U*U*A*G*G*C*A*C(SEQIDNO:2)、A*U*A*G*G*C*A*C(SEQIDNO:4)、G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C(SEQIDNO:11)、A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U(SEQIDNO:12)、U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U(SEQIDNO:13)、A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A(SEQIDNO:16)、A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U(SEQIDNO:17)、A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U(SEQIDNO:18)、C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U(SEQIDNO:24)、U*U*A*U*U*A*U(SEQIDNO:30)、U*A*U*A*U*A*U(SEQIDNO:33)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C(SEQIDNO:48)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C(SEQIDNO:76)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C*C*C(SEQIDNO:42)C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C(SEQIDNO:39)C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C(SEQIDNO:65)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C(SEQIDNO:44)C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C(SEQIDNO:47)C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C*C*C(SEQIDNO:38)C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C(SEQIDNO:37)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQIDNO:40)C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C(SEQIDNO:55)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQIDNO:82)c*c*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A*C*C(SEQIDNO:85)C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*G*U*A*C*C(SEQIDNO:63)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C(SEQIDNO:43)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*U*C*C*C(SEQIDNO:36)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQIDNO:87)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C*C*C(SEQIDNO:45)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C(SEQIDNO:41)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*G*C*C(SEQIDNO:83)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*C*C*C*C*C(SEQIDNO:46)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQIDNO:88)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C*C*C,IDNO:35)、c*c*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*C*C*C(SEQIDNO:84)或C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQIDNO:56)。如上所述，RNA是通過3'-5'磷酸二酯鍵連接的核糖核苷酸的多聚物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN是RNA。然而，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN不限于RNA，如下文將描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN可以包含兩個(gè)或更多經(jīng)修飾的核堿基，即A、C、G和U的衍生物。這些經(jīng)修飾的核堿基的特定實(shí)施方案包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮雜-胞嘧啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、帶有稠環(huán)系統(tǒng)的胞嘧啶類似物(例如N，N'-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)，和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羥基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)，胸腺嘧啶衍生物(例如2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧淀、6-取代的胸腺嘧啶)，鳥苷衍生物(7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代的鳥嘌呤(例如7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤)、7-脫氮-8-取代的鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代的鳥嘌呤(例如N2-甲基-鳥嘌呤)、8-取代的鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤和8-溴代鳥嘌呤)和6-硫代鳥嘌呤)或腺苷衍生物(5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑基[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧-腺嘌呤))。堿基也可以被通用堿基(例如4-甲基』引哚、5-硝基-吲哚、3-硝基吡咯、P-堿基和K-堿基)、芳環(huán)(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、l-甲基-lH-[l,2，4]三唑-3-羧酸胺)、芳環(huán)系統(tǒng)(例如氟苯或二氟聯(lián)二苯)或氫原子(dSpacer)取代。優(yōu)選的堿基修飾是尿嘧啶和7-脫氮-鳥嘌呤。這些經(jīng)修飾的U核堿基和它們對應(yīng)的核糖核酸可從商業(yè)供應(yīng)商得來。經(jīng)修飾的G核堿基的特定實(shí)施方案包括N、二甲基鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代的鳥嘌呤、7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-脫氮-8-取代的鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫代鳥嘌昤和8-氧代鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的G核堿基是8-羥基鳥嘌呤。這些經(jīng)修飾的G核堿基和它們相應(yīng)的核糖核苷可得自商業(yè)供應(yīng)商。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)3-核糖單元可以被P-D-脫氧核糖或經(jīng)修飾的糖單元置換，其中經(jīng)修飾的糖單元例如選自e-D-核糖、a-D-核糖、/3-L-核糖(如'Spiegelmers，中)、a-L-核糖、2'-氨基-2'-脫氧核糖、2，-氟-2，-脫氧核糖、2'-0-(Cl-C6)烷基核糖，優(yōu)選2'-0-(Cl-C6)垸基核糖為2'-0-甲基核糖、2'-0-(C2-C6)鏈烯基核糖、2'-核糖、LNA和o;-LNA(NielsenPetal.(2002)Chemistry-AEuropeanJournal8:712-22)、i3-D-木-呋喃糖、a-阿拉伯呋喃糖、2，-氟代阿拉伯呋喃糖和碳環(huán)和/或開環(huán)糖類似物(描述于例如Vandendriesscheetal.(1993)Tetrahedron49:7223中)和/或雙環(huán)糖類似物(描述于例如TarkovMetal.(1993)HelvChimActa76:481中)?；蛘?，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的各核糖核苷酸和核糖核苷可以通過非核酸的接頭連接，尤其是脫堿基接頭(abasiclinkers(dSpacers))、三乙二醇單元或六乙烯基乙二醇(hexaethyleneglycol)單元。其它接頭為烷氨基(alkylamino)接頭，例如C3、C6和C12氨基接頭，以及垸基硫醇(alkylthiol)接頭，例如C3或C6硫醇接頭?；蛘撸景l(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的個(gè)體核苷酸和核糖核苷可以通過芳香族殘基連接，所述芳香族殘基還可被烷基或取代的烷基取代。RNA是通過3'-5'磷酸二酯聯(lián)接而連起來的核糖核苷酸的多聚物。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的核苷酸也可以通過3'-5'磷酸二酯聯(lián)接連起來。然而，本發(fā)明也包括具有異常核苷酸間聯(lián)接的ORN，特異地包含5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'和2'-5'核苷酸間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，這類異常聯(lián)接被排除在免疫刺激性RNA基序外，盡管一個(gè)或多個(gè)這種聯(lián)接可存在于免疫刺激性O(shè)RN的別處。對于具有游離末端的免疫刺激性O(shè)RN而言，包含一個(gè)3'-3'核苷酸間聯(lián)接可導(dǎo)致免疫刺激性O(shè)RN具有兩個(gè)游離的5'端。相反，對于具有游離末端的免疫刺激性O(shè)RN而言，包含一個(gè)5'-5'核苷酸間聯(lián)接可導(dǎo)致免疫刺激性的ORN具有兩個(gè)游離的3'末本發(fā)明的免疫刺激性組合物可含有兩個(gè)或更多的免疫刺激性RNA基序，其可以通過分支的單元連接。核苷酸間聯(lián)接可以是3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'聯(lián)接。其中，名稱2，-5，根據(jù)核糖的碳原子選擇。異常核苷酸間聯(lián)接可以是磷酸二酯聯(lián)接，但是其也可以被修飾為硫代磷酸酯或本文所述的任何其它經(jīng)修飾的聯(lián)接。下式通過核苷酸分支單元顯示本發(fā)明的分支的免疫刺激性O(shè)RN的一般結(jié)構(gòu)。其中NUl、Mi2和Nii3可以通過3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'-聯(lián)接來連接。免疫刺激性O(shè)RN的分支也可以涉及非核苷酸接頭和脫堿基間隔的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，NUl、N化和Nu3表示相同或不同的免疫刺激性RNA基序。在另一實(shí)施方案中，NUl、Nii2和N化包含至少一個(gè)免疫刺激性RNA基序和至少一個(gè)免疫刺激性CpGDNA基序。免疫剌激性O(shè)RN可含有雙倍的或三倍的單元(GlenResearch,Sterling,VA)，尤其是具有3'-3'鍵的免疫刺激性O(shè)RN。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙倍單元可以以1，3-雙-[5-(4，4'-二甲氧基三四丁酚醛)戊基酰胺基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷酰胺為基礎(chǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，三倍單元可以以丁1^-2,2，2-[3-(4，4'-二甲氧基三四丁酚醛)丙基氧甲基]乙基-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺的整合為基礎(chǔ)。多重雙倍、三倍或其它多倍單元對免疫刺激性O(shè)RN的分支導(dǎo)致樹狀聚體，其為本發(fā)明的另一實(shí)施方案。分支的免疫剌激性O(shè)RN可以導(dǎo)致免疫刺激性RNA的受體(如TLR3、TLR7和TLR8)的交聯(lián)，具有與未分枝形式的免疫刺激性O(shè)RN相比不同的免疫作用。另外，分支或其它的多體(multimeric)免疫刺激性O(shè)RN的合成可以穩(wěn)定RNA不被降解，或可以使弱的或部分有效的RNA序列顯示出治療有用的免疫活性水平。免疫刺激性O(shè)RN也可以含有接頭單元，其得自肽修飾試劑或寡核苷酸修飾試劑(GlenResearch)。另外，免疫刺激性O(shè)RN可含有通過肽(酰胺)聯(lián)接與多聚物連接的一個(gè)或多個(gè)天然的或非天然的氨基酸殘基。3'-5',5'-5',3'-3'，2'-2',2'-3'和2'-5'核苷酸間聯(lián)接可以是直接的或非直接的。在該上下文中，直接聯(lián)接是指本文公開的磷酸聯(lián)接或經(jīng)修飾的磷酸聯(lián)接，不含插入接頭部分。插入接頭部分是與本文公開的磷酸聯(lián)接或經(jīng)修飾的磷酸聯(lián)接不同的有機(jī)部分，其可包括例如聚乙二醇、三乙二醇、六乙二醇、dSpacer(即脫堿基脫氧核苷酸)、二倍單元或三倍單元。在某些實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN與另一實(shí)體綴合產(chǎn)生綴合物。本文使用的綴合物是指通過任何物理化學(xué)途徑(包括疏水相互作用和共價(jià)偶合)彼此結(jié)合的任兩個(gè)或多個(gè)實(shí)體的組合。在另一實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN可以與被免疫刺激性受體識別的小分子量配體綴合。該受體優(yōu)選是TLR家族的成員，例如TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9。小分子量配體是針對這些受體的天然配體的擬態(tài)。例子包括但不限于刺激TLR7和TLR8二者的R-848(Resiquimod)、R-837(Imiquimod;ALDARA,3MPharmaceuticals)、7-脫氮-鳥苷、7-硫代-8-氧-鳥苷和7-烯丙基-8-氧-鳥苷(Loxoribine)。D-吡喃葡萄糖衍生物如3D-MPL(TLR4配體)也可以與免疫刺激性O(shè)RN綴合。Pam3-Cys是能夠與免疫刺激性O(shè)RN綴合的TLR2配體的一個(gè)例子。含有CpG基序的寡脫氧核苷酸是TLR9配體，這些也可以與本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)包含對剌激TLR9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有效的CpG基序的寡脫氧核苷酸與本發(fā)明的免疫剌激性O(shè)RN綴合。針對不同TLR的配體進(jìn)入一個(gè)分子的綴合可導(dǎo)致受體的多聚化，這導(dǎo)致與任何單個(gè)這類配體引起的相比增強(qiáng)的免疫刺激或不同的免疫刺激譜。本發(fā)明一方面提供了本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和親脂部分的綴合物。在某些實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN與親脂性部分共價(jià)連接。親脂性部分通常會存在于具有游離末端的免疫刺激性O(shè)RN的一個(gè)或多個(gè)末端上，盡管在某些實(shí)施方案中，親脂性部分可以在免疫刺激性O(shè)RN的別處存在，并從而不要求免疫刺激性O(shè)RN具有游離末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN具有3'末端，親脂性部分與所述3'末端共價(jià)連接。親脂性基團(tuán)一般可以是膽固醇基、經(jīng)修飾的膽固醇基、膽固醇衍生物、被還原的膽固醇、被取代的膽固醇、膽甾垸、C16垸基鏈、膽汁酸、膽酸、?；悄懰?、脫氧膽酸、油?；懰?oleyllitocholicacid)、油酰膽烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、類異戊二烯如類固醇、維生素如維生素E、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸酯如甘油三酯、芘、紫菜堿、Texaphyrine、金剛烷胺、吖啶、生物素、香豆素、熒光素、羅丹明、Texas-Red、地高辛(digoxygenin)、二對甲氧三苯甲基、t-丁基二甲基甲硅烷、t-丁基聯(lián)二苯甲硅烷、花青染料(例如Cy3或Cy5)、Hoechst33258染料、補(bǔ)骨脂素或布洛芬。在某些實(shí)施方案中，親脂性部分選自膽固醇基、棕櫚基和脂肪?；?。在一個(gè)實(shí)施方案中，親脂性部分為膽固醇基。認(rèn)為本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN中包括一個(gè)或多個(gè)這類親脂性部分又賦予它們針對核酸酶降解的額外的穩(wěn)定性。當(dāng)本發(fā)明的單個(gè)免疫刺激性O(shè)RN中存在兩個(gè)或多個(gè)親脂性部分時(shí)，這類親脂性部分可以彼此獨(dú)立地被選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，親脂性部分附著在免疫刺激性O(shè)RN的核苷酸的2'位置上。親脂性基團(tuán)或者或額外地與免疫剌激性O(shè)RN的核苷酸的雜環(huán)核堿基連接。親脂性部分可以通過任何合適的直接或間接聯(lián)接與免疫刺激性O(shè)RN共價(jià)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，該聯(lián)接是直接的并且是酯或酰胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，該聯(lián)接是間接的并包括間隔部分，例如一個(gè)或多個(gè)脫堿基的核苷酸殘基、寡聚乙二醇如三乙二醇(間隔9)或六乙二醇(間隔18)或鏈垸二醇如丁二醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN有利地與陽離子脂質(zhì)或陽離子肽組合。陽離子脂質(zhì)和陽離子肽被認(rèn)為幫助將免疫刺激性O(shè)RN運(yùn)輸進(jìn)核內(nèi)體區(qū)室中，TLR8存在于其中。在一個(gè)實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)為DOTAP(N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N,N-三甲基銨甲基硫酸酯)。DOTAP被認(rèn)為將RNA寡聚體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞并特異地運(yùn)輸至核內(nèi)體區(qū)室中，在那里其可以以pH依賴性的模式釋放RNA寡聚體。在核內(nèi)體區(qū)室中時(shí)，RNA可以與某些細(xì)胞內(nèi)TLR相互作用，引發(fā)設(shè)計(jì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生的TLR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。具有相似特性(包括運(yùn)輸至核內(nèi)體區(qū)室)的其它試劑可以代替DOTAP或除DOTAP外使用。其它液體配方包括例如EFFECTENE(具有特異DNA壓縮增強(qiáng)子的非脂質(zhì)體脂質(zhì))和SUPERFECT(新穎的作用dendrimeric技術(shù))。脂質(zhì)體可商業(yè)得自GibcoBRL，例如LIPOFECTINtm和LIPOFECTACETM，它們是由陽離子脂質(zhì)如N-[l-(2，3二油酰氧)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和二甲基溴化二十八烷銨(DDAB)形成的。用于制造脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域已知的并描述于許多出版物中。脂質(zhì)體也已由GregoriadisG(1985)TrendsBiotechnol3:235-241綜述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN是具有一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的共價(jià)閉合的、啞鈴形分子的形式。如本文所公開的，在一個(gè)實(shí)施方案中這類環(huán)狀寡核糖核苷酸包含通過插入的雙鏈區(qū)段連接的兩個(gè)單鏈環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)單鏈環(huán)包含本發(fā)明的免疫刺激性RNA基序。本發(fā)明的其它共價(jià)閉合的、啞鈴形的分子包括嵌合的DNA:RNA分子，其中例如雙鏈區(qū)段至少部分是DNA(例如同源二聚體dsDNA或醫(yī)院二聚體DNA:RNA)且至少一個(gè)單鏈的環(huán)包含本發(fā)明的免疫刺激性RNA基序。或者，嵌合分子的雙鏈區(qū)段為RNA。在某些實(shí)施方案中，免疫刺激性的ORN是經(jīng)分離的。經(jīng)分離的分子是基本純凈的并且不含其它物質(zhì)的分子，所述其它物質(zhì)與所述分子通常一起存在于自然界中或體內(nèi)系統(tǒng)中，存在程度達(dá)到對所述分子目的用途而言能夠?qū)嵺`的并且適當(dāng)?shù)某潭取Ｃ庖叽碳ば設(shè)RN尤其是足夠純凈和足夠不含細(xì)胞的其它生物學(xué)組分的，從而適用于例如生產(chǎn)藥物制劑。因?yàn)榻?jīng)分離的本發(fā)明的刺激性O(shè)RN可以與可藥用運(yùn)載體在藥物制劑中混合，所以免疫刺激性O(shè)RN可僅包含按重量計(jì)小量百分比的制劑。但是免疫刺激性O(shè)RN是基本純凈的，因?yàn)樗鯫RN己經(jīng)基本與生活系統(tǒng)中可與之結(jié)合的物質(zhì)分離。為了本發(fā)明中的用途，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN可以使用或適應(yīng)本領(lǐng)域公知的大量步驟的任何來從新合成。例如e氰乙基亞磷酰胺方法(BeaucageSLetal.(1981)TetrahedronLett22:1859);核苷H-磷酸酯方法(GareggPetal.(1986)TetrahedronLett27:4051-4;FroehlerBCetal.(1986)NuclAcidRes14:5399-407;GareggPetal.(1986)TetrahedronLett27:4055-8;GaffneyBLetal.(1988)TetrahedronLett29:2619-22)。這些化學(xué)可以通過市售的大量自動化核酸合成儀進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明適用的其它合成方法公開于UhlmannEetal.(1990)ChemRev90:544-84禾卩GoodchildJ(1990)BioconjugateChem1:165中。對寡核糖核苷酸的合成可以在溶液中或在固相支持物上進(jìn)行。在溶液中，優(yōu)選阻滯偶聯(lián)反應(yīng)(二聚體、三聚體、四聚體等)，而固相合成優(yōu)選使用單體構(gòu)件塊在分步的過程中進(jìn)行。已經(jīng)描述(EcksteinF(1991)OligonucleotidesandAnalogues,APracticalApproach,IRLPress,Oxford)了不同的化學(xué)，例如磷酸三酯法、H-磷酸酯方法和亞磷酰胺方法。盡管在磷酸三酯方法中，反應(yīng)性的磷基團(tuán)在氧化速率+V中，但是根據(jù)亞磷酰胺和H-磷酸酯途徑，偶聯(lián)反應(yīng)中使用更具反應(yīng)性的Phosphor+111衍生物。在后兩種途徑中，磷在偶聯(lián)步驟后被氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的P(V)衍生物。如果氧化劑是碘/水/堿基，則在脫保護(hù)后獲得磷酸二酯。相反，如果氧化劑是硫化劑如Beaucage，s試劑，則在脫保護(hù)后獲得硫代磷酸酯。用于寡核糖核苷酸合成的一個(gè)有效方法是使用(如MatteucciandCaruthers最初針對寡聚脫氧核苷酸所描述的)亞磷酰胺化學(xué)的固體支持合成法的組合。MatteucciMDetal.(1981)JAmChemSoc103:3185。對寡核糖核苷酸的合成與對寡脫氧核苷酸的合成是類似的，差異在于寡核糖核苷酸中存在的2'羥基必須被合適的羥基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。單體可以例如被RNA單體構(gòu)件塊中的2'-0-t-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基團(tuán)保護(hù)。然而，使用含有2'-O-三異丙基甲硅烷基氧甲基(TOM)基團(tuán)(TOM-Protecting-GroupTM)的單體合成RNA已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)產(chǎn)生更高的偶聯(lián)效力，因?yàn)門OM保護(hù)基團(tuán)顯示比TBDMS基團(tuán)更低的位阻。盡管使用氟化物去除TBDMS保護(hù)基團(tuán)，但是使用乙醇/水中的甲胺在室溫下達(dá)成TOM基團(tuán)的快速脫保護(hù)。在寡聚(核糖)核苷酸合成中，優(yōu)選從3'-5'末端的鏈延伸，這通過將具有3'-磷(in)基團(tuán)的核糖核苷酸單元或其被活化的衍生物與另一核苷酸單元的游離5'羥基基團(tuán)偶聯(lián)達(dá)成。合成可以使用自動化DNA/RNA合成儀便利地進(jìn)行。其中可使用合成儀供應(yīng)商推薦的合成循環(huán)。對于核糖核苷亞磷酰胺單體而言，偶聯(lián)時(shí)間與脫氧核苷單體相比更長(例如400秒)。作為固體支持物，可以使用500到1000A的可控多孔玻璃(CPG)支持物或有機(jī)多聚體支持物，例如引物支持物PS200(Amersham)。固體支持物通常含有通過其3'-末端結(jié)合的第一個(gè)核苷，例如5'-0-二對甲氧三苯甲基-N-6-苯甲酰腺苷。用三氯乙酸切割5，-O-二對甲氧三苯甲基基團(tuán)后，使用例如5，-0-二對甲氧三苯甲基-^保護(hù)的-2，-0-叔丁基二甲基甲硅垸基-核苷-3'-0-亞磷酰胺達(dá)成鏈延伸。連續(xù)的重復(fù)循環(huán)后，通過用濃氨水/乙醇(3:l，v:v)在30'C處理24小時(shí)將完成的寡核糖核苷酸從支持物上切割并脫保護(hù)。最后使用三乙胺/HF將TBDMS封閉基團(tuán)切除?？梢酝ㄟ^離子交換柱高壓液相色譜(HPLC)、離子對反相HPLC或聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化粗的寡核糖核苷酸并通過質(zhì)譜法來分析。5'綴合物的合成后直接在固相合成中將待連接的的分子的亞磷酰胺與末端核苷酸的5'羥基偶聯(lián)。可商業(yè)獲得這類配體的多種亞磷酰胺衍生物，例如膽固醇、吖啶、生物素、普素拉倫(psoralene)、乙二醇或氨基垸基殘基?；蛘?，可以在固相合成期間引入氨基烷基功能，其允許通過活化的綴合物分子(例如活性酯、異硫脲或碘-乙酰胺)進(jìn)行合成后衍生化。3'端綴合物的合成通常通過使用相應(yīng)被修飾的固體支持物完成，所述支持物例如可商業(yè)獲得的膽固醇基衍生的固體支持物。然而，綴合也可以在核苷酸間鍵、核堿基或核糖殘基(例如核糖的2，-位置)上進(jìn)行。對于環(huán)狀寡核糖核苷酸而言，寡核苷酸鏈的延伸可以使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)在核苷酸PS固體支持物(GlenResearch)上進(jìn)行。然后使用磷酸三酯偶聯(lián)步驟(Alazzouzietal.(1997)NucleosidesNucleotides16:1513-14)在固體支持物上進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。在用氫氧化銨最終脫保護(hù)時(shí)，事實(shí)上進(jìn)入溶液中的唯一產(chǎn)物是期望的環(huán)狀寡核苷酸。本發(fā)明的環(huán)狀寡核糖核苷酸包括閉環(huán)形式的RNA，并可包括帶有或不帶有雙鏈RNA的單鏈RNA。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)狀寡核糖核苷酸包括雙鏈的RNA并呈現(xiàn)具有兩個(gè)單一標(biāo)準(zhǔn)環(huán)的啞鈴構(gòu)象，所述兩個(gè)環(huán)通過插入的雙鏈區(qū)段連接。共價(jià)閉合的、椏鈴形的CpG寡脫氧核苷酸已經(jīng)描述于U.S.Pat.No.6,849,725中。在另一實(shí)施方案中，環(huán)狀寡核糖核苷酸包括雙鏈的RNA并呈現(xiàn)下述構(gòu)型，所述構(gòu)型具有通過插入的雙鏈區(qū)段連接的三個(gè)或更多的單鏈環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性RNA位于一個(gè)或多個(gè)單鏈區(qū)段中。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN適用于單獨(dú)或與其它試劑如佐劑組合使用。本文使用的佐劑表示除抗原以外增強(qiáng)應(yīng)答抗原的免疫細(xì)胞活化(例如體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)的物質(zhì)。佐劑促進(jìn)佐細(xì)胞的聚集和/或活化，以增強(qiáng)抗原特異的免疫應(yīng)答。佐劑被用于增強(qiáng)疫苗的效率，所述疫苗即用于誘導(dǎo)針對抗原的保護(hù)性免疫的含抗原組合物。佐劑通常包括傳見儲存效應(yīng)的佐劑、免疫刺激佐劑和創(chuàng)建儲存效應(yīng)并刺激免疫系統(tǒng)的佐劑。本文使用的創(chuàng)建儲存效應(yīng)的佐劑是指引起抗體在體內(nèi)緩慢釋放，從而延長免疫細(xì)胞對抗原暴露的佐劑。這種佐劑包括但不限于明礬(例如氫氧化鋁、磷酸鋁)；基于乳劑的配方，包括礦物油、非礦物油、油包水或油包水包油乳劑，水包油乳劑例如Montanide佐劑的SeppicISA系列(例如MontanideISA720;AirLiquide,Paris，法國);MF畫59(用Span85和Tween80穩(wěn)定的水包角鳘烯乳劑，ChironCorporation,Emeryville,Calif.);和PROVAX(含有穩(wěn)定洗滌劑和成微團(tuán)劑的水包油乳齊O;IDECPharmaceuticalsCorporation,SanDiego,Calif.)。免疫刺激佐劑是引起免疫系統(tǒng)細(xì)胞活化的佐劑。其可例如引起免疫細(xì)胞的生產(chǎn)和細(xì)胞因子的分泌。這類佐劑包括但不限于從Q.saponaria樹樹皮中純化的皂苷，如QS21(在HPLC級分的第21個(gè)峰中洗脫的糖脂；AquilaBiopharmaceuticals，Inc.,Worcester,Mass.);多聚[二(羧酸苯氧基(carboxylatophenoxy))磷月青](PCPP多聚物；VirusResearchInstitute,美國)；脂多糖衍生物如單磷酸類脂A(MPL;RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,Mont.)、胞壁酰二肽(MDP;Ribi)、andthreonyl-胞壁酰二肽(t-MDP;Ribi);OM-174(與脂質(zhì)A相關(guān)的葡糖胺二糖；OMPharmaSA,Meyrin,Switzerland)禾口Leishmania延伸因子(經(jīng)純《七的Leishmania蛋白；CorixaCorporation,Seattle,Wash.)。該種類的佐劑也包括CpGDNA。創(chuàng)建儲存作用并刺激免疫系統(tǒng)的佐劑是具有上述兩種功能的化合物。這類佐劑包括但不限于ISCOMS(免疫刺激復(fù)合物，其含有混合的皂苷、脂質(zhì)并與可保留抗原的孔形成病毒大小的顆粒；CSL,Melbourne,Australia);SB-AS2(SmithKlineBeecham佐劑系統(tǒng)弁2，其為含有MPL和QS21的水包油乳劑SmithKlineBeechamBiologicals[SBB],Rixensart，比利時(shí))；SB-AS4(SmithKlineBeecham佐劑系統(tǒng)#4,其含有明礬和MPL;SBB，比利時(shí))；非離子嵌段共聚物，其形成微團(tuán)如CRL1005(這些含有側(cè)翼為聚氧乙烯鏈的疏水性聚氧丙烯線性鏈；Vaxcel,Inc.，Norcross,Ga.);和Syntex佐劑配方(SAF，含有Tween80的水包油乳劑和非例子的嵌段共聚物；SyntexChemicals,Inc.,Boulder,Colo.)。本發(fā)明一方面提供了自身包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的佐劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和至少一種其它佐劑的佐劑(組合佐劑)。所述其它佐劑可包含創(chuàng)建儲存作用的佐劑、免疫刺激的佐劑、創(chuàng)建儲存作用并刺激免疫系統(tǒng)的佐劑及其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和至少一種其它佐劑彼此共價(jià)連接。根據(jù)本發(fā)明的組合佐劑與免疫刺激ORN單獨(dú)和至少一種其它佐劑單獨(dú)的作用之和相比，可顯示協(xié)同的免疫刺激作用。另外或或者，根據(jù)本發(fā)明的組合佐劑可顯示與免疫刺激性O(shè)RN單獨(dú)或至少一種其它佐劑單獨(dú)相比，改變的免疫刺激譜。例如，組合佐劑可以在一個(gè)實(shí)施方案中提供更分支形式的Thl/Th2免疫刺激，或其可以在另一實(shí)施方案中提供更傾斜(skewed)形式的Thl/Th2免疫刺激。本領(lǐng)域的這些技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白如何選擇個(gè)體組分以促進(jìn)期望類型的免疫刺激，例如關(guān)于Thl和Th2特征更加分支或更傾斜。Thl和Th2在下文中有進(jìn)一步描述。還提供了一種組合物，所述組合物包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN加上另一佐劑，其中所述其它佐劑為細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和細(xì)胞因子的綴合物。細(xì)胞因子是由許多種細(xì)胞生產(chǎn)的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的可溶性蛋白質(zhì)和糖蛋白。細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫系統(tǒng)細(xì)胞之間的交流，局部和全身性地作用以募集細(xì)胞和調(diào)節(jié)它們的功能和增殖。細(xì)胞因子的范疇包含先天免疫的介質(zhì)和調(diào)節(jié)器、適應(yīng)性免疫的介質(zhì)和調(diào)節(jié)器，以及血細(xì)胞生成的刺激器。包括在細(xì)胞因子內(nèi)的是白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL畫7、IL-8、IL-9、IL畫IO、IL畫ll、IL-12、IL隱13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18和白介素19-32(IL-19-IL-32)，除了別的以外)、趨化因子(例如IP-IO、RANTES、MlP-la、MIP-l/3、MIP-3o;、MCP-1、MCP陽2、MCP畫3、MCP-4、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、I-TAC禾HBCA畫1，除了別的以外)以及其它細(xì)胞因子，包括1型干擾素(例如IFN-a禾口IFN-/3)、2型干擾素(例如IFN-7)、腫瘤壞死因子-a(TNF-ce)、轉(zhuǎn)化生長因子-/3(TGF-Z3)和多種集落刺激因子(CSF)，包括GM-CSF、G-CSF和M-CSF。還提供了包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN加上免疫刺激性CpG核酸的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合為本發(fā)明的免疫剌激性O(shè)RN和CpG核酸的綴合物，例如RNA:DNA綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN與CpG核酸的混合物，即不是RNA:DNA綴合物。本文使用免疫刺激性CpG核酸是指天然或合成的DNA序列，其含有CpG基序并刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞的活化或增殖。免疫刺激性CpG核酸已經(jīng)在大量出版的專利、公開的專利申請和其它出版物中描述，包括U.S.Pat.Nos.6，194，388;6，207，646;6,214,806;6,218,371;6,239,116和6,339,068。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性CpG核酸是6-100個(gè)核苷酸長的CpG寡脫氧核苷酸(CpGODN)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性CpG核酸是8-40個(gè)核苷酸長的CpG寡脫氧核苷酸(CpGODN)。免疫刺激性CpG核酸包括不同種類的CpG核酸。一種能夠激活B細(xì)胞但是在誘導(dǎo)IFN-o;和NK細(xì)胞活化時(shí)相對弱；該種類已經(jīng)被命名為B類。典型地，B類CpG核酸被完全穩(wěn)定，其在某些優(yōu)選的堿基環(huán)境中具有未甲基化的CpG二核苷酸。參閱例如U.S.Pat.Nos.6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116禾Q6,339,068。另一種類能夠誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞活化，但是在刺激B細(xì)胞時(shí)相對弱，該種類己經(jīng)被稱作A類。A類CpG核酸在5'和3'兩個(gè)末端典型地具有回文的至少6個(gè)核苷酸的含磷酸二酯CpG二核苷酸的序列和穩(wěn)定的多聚G序列。參閱例如公開的國際專利申請WO01/22990。CpG核酸的再一種類激活B細(xì)胞和NK細(xì)胞并誘導(dǎo)IFN-a;該種類已經(jīng)被稱作C類。如首先分析的，C類CpG核酸典型地被完全穩(wěn)定，包括B類型序列和富含GC的回文序列或近似回文序列。該種類己經(jīng)描述于公開的U.S.專利申請2003/0148976中，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。免疫刺激性CpG核酸也包括如公開的U.S.專利申請2003/0148976中所公開的所謂的軟性和半軟性CpG核酸，所述申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。這類軟性和半軟性免疫刺激性CpG核酸整合核酸酶抗性和核酸酶敏感性核苷酸間鍵的組合，其中不同類型的鍵根據(jù)某些原則定位。還提供了包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN系上另一佐劑的組合物，其中所述另一佐劑是脂肽如Pam3Cys、陽離子多糖如殼聚糖，或陽離子肽如魚精蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物為本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和另一佐劑的綴合物。本發(fā)明一方面提供了包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗原的疫苗。本文使用的"抗原"表示能夠被T細(xì)胞抗原受體或B細(xì)胞抗原受體識別的任何分子。該術(shù)語廣泛地包含被宿主免疫系統(tǒng)識別為外源的任何類型的分子?？乖话惆ǖ幌抻诩?xì)胞、細(xì)胞提取物、蛋白質(zhì)、多肽、肽、多糖、多糖綴合物、多糖和其它分子的肽和非肽擬態(tài)、小分子、脂質(zhì)、糖脂、多糖、碳水化合物、病毒和病毒提取物以及多細(xì)胞生物如寄生蟲和變應(yīng)原。對于為蛋白質(zhì)、多肽或肽的抗原而言，這類抗原可包括編碼這類抗原的核酸分子。抗原更特異地包括但不限于癌癥抗原，其包括癌細(xì)胞和在癌細(xì)胞中或癌細(xì)胞上表達(dá)的分子；微生物抗原，其包括微生物和在微生物中或微生物上表達(dá)的分子；和變應(yīng)原。因此，本發(fā)明在某些實(shí)施方案中提供了用于癌癥、傳染原和變應(yīng)原的疫苗。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于疫苗接種受試者。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于制備疫苗的方法。該方法包括下述步驟將本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN置于與抗原和任選的可藥用運(yùn)載體的直接結(jié)合中。在多種實(shí)施方案中，抗原為微生物抗原、癌癥抗原或變應(yīng)原。本文使用的"微生物抗原"是指微生物的抗原，其包括但不限于病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌。這類抗原包括完整的微生物及其天然的隔離群或片段或衍生物，也包括與天然微生物抗原相同或相似并誘導(dǎo)對該微生物特異的免疫應(yīng)答的合成化合物。如果化合物誘導(dǎo)對天然微生物抗原的免疫應(yīng)答(體液和/或細(xì)胞)，則其與天然微生物抗原類似。這類抗原是本領(lǐng)域常規(guī)使用的并是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員公知的。病毒是小傳染原，其一般含有核酸核心和蛋白質(zhì)外殼，但是不能獨(dú)立生活的生物。病毒也可以采取缺乏蛋白質(zhì)的傳染性核酸的形式。不存在病毒在其中能夠復(fù)制的生活細(xì)胞時(shí)，病毒不能存在。病毒通過胞吞作用或直接注射DNA(噬菌體)進(jìn)入特異的生活細(xì)胞并繁殖，引起疾病。然后繁殖的病毒可以被釋放或感染其它細(xì)胞。一些病毒是含DNA的病毒，其它是含RNA的病毒。在一些方面，本發(fā)明也旨在治療疾病，所述疾病中感染性月元蛋白質(zhì)(prion)在疾病進(jìn)展中被復(fù)制，所述疾病例如牛海綿狀腦病(即瘋牛病，BSE)或動物中的綿羊瘙癢病感染，或人中的Creutzfeldt-Jakob疾病。病毒包括但不限于腸道病毒(包括但不限于/^com"WnW^科，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus)、艾柯病毒(echovirus))、輪狀病毒、腺病毒、肝炎病毒。已經(jīng)在人中發(fā)現(xiàn)的病毒的特異例子包括但不限于7"rav/nV/ae(例如人免疫缺陷病毒如HIV-1(也稱作HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III;和其它隔離群，例如HIV-LP));乃'cwmmW^e(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；O^^W^e(例如引起胃腸炎的菌株)；7bgaWnV/ae(例如馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；F/aWvzWdae(例如登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒)；Gra"avzW^e(例如冠形病毒)；A/wMovz'nV/ae(例如皰疹性口炎病毒、狂犬病病毒)；Fz7ov/nWae(例如埃博拉病毒)；(例如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；(9r/Aom;;xoWn'fi^e(例如流感病毒)；_8t/"_yavzWfifae(例如漢坦病毒(Hantaanviruses)、bunya病毒、靜脈病毒(phleboviruses)禾口Nairo病毒)；Jre"謂'nV/ae(出血熱病毒)；/e<rw>^/ae(例如呼月3病毒、orbiviurses禾口輪狀病毒)；說r"aWnV/ae;//e/a^"crw'nV/ae(乙型肝炎病毒)；尸arvovzVWae(細(xì)小病毒組)；尸apovavzWdae(乳頭瘤病毒屬、多瘤病毒)；A;fe"ovzWfi^e(大部分月泉病毒)；//e/77asW^/ae(單純皰疹病毒(HSV)1和2、水痘一帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV));尸oxv/r油e(類天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；7nW頻W(iae(例如非洲豬瘟病毒)；和未分類的病毒(例如海綿狀腦病的病原(etiologicalagent),丁型病毒性肝炎的病原(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的有缺陷的隨體)，非甲型、非乙型肝炎的病原(種類1=內(nèi)部傳輸；種類2=腸胃外傳輸)(即丙型肝炎)；Norwalk及相關(guān)病毒和星狀病毒)。細(xì)菌是通過二元裂變無性繁殖的單細(xì)胞生物。根據(jù)其形態(tài)學(xué)、染色反應(yīng)、營養(yǎng)和代謝需要、抗原結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和遺傳同源性對它們進(jìn)行分類和命名。細(xì)菌根據(jù)其形態(tài)學(xué)形式可以被分為三類球形(球菌)、直棒狀(桿菌)和彎曲或螺旋棒狀(弧菌、彎曲桿菌、螺菌和螺旋體)。細(xì)菌也更通常根據(jù)它們的染色反應(yīng)被分為兩類生物，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性。革蘭氏是指在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中通常進(jìn)行的染色方法。革蘭氏陽性生物在染色步驟后保持染色并顯示深紫色。革蘭氏陰性生物不保持染色但是吸收復(fù)染，并從而顯示粉色。傳染性的細(xì)菌包括但不限于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于PaWew"http://"的種、5"to//^/ococcz'的種和5V印tococa^的種。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于_Esc/^hc/'aco/z'、尸w^/owo"^的種和5Wmo"e〃a的種。傳染性細(xì)菌的特異例子包括但不限于//e/z.coZacter/j/o/7S、5o/re/z'a6t/廠gc/o/^n'、丄egz'owe〃a/wewmo//7z'a、Afyco^cte".as戸(例女口M.勵ercw/c^、Mav/wm、M./w加ce/Zw/are、M.7Ve/^m'a艦m'wg"W5、Z^e"'amowoc_ytogeway、5^"，ococct^/_yogew&y(A組5Wptococctw)、5Yr一ococcMSagfl/aWae(B組》SV，tococc—、5Vre;tococct^(厭氧禾中)、5^印tococcus/wet/mom'fle、戶aAogew/cCam/3^o6acter平、五wteracoccws5p.、//ae附o//n7wsz'w^Zwewzae、SacZ〃iw7Vej90打ema/a〃iWwm、7>e/owemapeWewwe、Z/e/>to5pz>"、J^'c&e"w'a禾口寄生蟲是依賴于其它生物而存活的生物，因此其必須進(jìn)入或感染其它生物以持續(xù)它們的生命周期。被感染的生物(即宿主)對寄生蟲提供營養(yǎng)和生境。盡管該術(shù)語寄生蟲以其最廣泛的含義可以包括所有的傳染原(即細(xì)菌、病毒、真菌、原生動物和蠕蟲)，但是一般而言，該術(shù)語用于單獨(dú)表示原生動物、蠕蟲和外寄生節(jié)肢動物(例如蜱、螨等)。原生動物是單細(xì)胞的生物，其可細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外復(fù)制，尤其是在血、腸道或組織的細(xì)胞外基質(zhì)中。蠕蟲是幾乎總是在細(xì)胞外的多細(xì)胞生物(除7WC/n>ze//aspp.外)。蠕蟲通常需要從初級宿主中退出并轉(zhuǎn)移進(jìn)入次級宿主中，從而復(fù)制。與這些上述的種類相反，外寄生節(jié)肢動物形成與宿主身體外表面的寄生關(guān)系。寄生蟲包括細(xì)胞內(nèi)寄生蟲和專性的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。寄生蟲的例子包括fS不限于尸/osmod/i/m聲/c^an/zw、尸/asmo&wmova/e、/Vosmo^w/w附a/fln'ae、尸/asm^/otZ/MWv/vflx、^/as^wotZ/w/wAwc>v/asz'、Sa^e^am/crod、Mocfesi'ewse禾口Sc/n'stosomama朋om'。真菌是真核生物，只有一部分在脊椎動物哺乳動物中引起感染。因?yàn)檎婢钦婧松?，所以它們與原核的細(xì)菌在尺寸、結(jié)構(gòu)組建、生命周期和繁殖機(jī)制上顯著不同。真菌通常以其形態(tài)學(xué)特征、生殖模式和培養(yǎng)特征被分類。盡管真菌可在受試者中引起不同類型的疾病，例如吸入真菌抗原后的呼吸變態(tài)反應(yīng)、由于攝取毒性物質(zhì)(例如由毒蘑菇生產(chǎn)的Jm"m'to毒素和毒蕈肽和由曲霉的種生產(chǎn)的黃曲霉毒素)引起的真菌中毒，但是不是所有的真菌引起傳染病。傳染性真菌可以引起全身性的或淺表性的感染。初級全身性感染可以在正常的健康受試者中發(fā)生，機(jī)會性感染最經(jīng)常存在于免疫妥協(xié)的受試者中。引起初級全身性感染的最常見真菌物質(zhì)包括別mtom;;c"、Cocc^o^es和//^to;/aww。在免疫妥協(xié)的或免疫抑制的受試者中引起機(jī)會性感染的常見真菌包括但不限于OwA^a/Z^c"似、Co^tococc^weo/oma似和多種A^w^7/m的種。全身性真菌感染是內(nèi)部器官的侵入性感染。生物通常經(jīng)過肺、胃腸道或靜脈內(nèi)導(dǎo)管進(jìn)入身體。這些類型的感染可以由初級病原真菌或機(jī)會性真菌引起。淺表性的真菌感染涉及真菌在外部表面的生長而不侵入內(nèi)部組織。典型的淺表性真菌感染包括涉及皮膚、毛發(fā)或指甲的表皮真菌感染。與真菌感染相關(guān)的疾病包括曲霉病，芽生菌病，念珠菌病，著色芽生菌病，球孢子菌病，隱球菌病，真菌眼感染，真菌毛發(fā)、指甲和皮膚感染，組織胞漿菌病，瘢痕疙瘩性芽生菌病，足菌腫，耳真菌病，副球孢子菌病，散布的尸em'd〃/"mwame^e"暗色絲孢霉病，鼻孢子菌病，孢子絲菌病和接合菌病。其它醫(yī)學(xué)相關(guān)的微生物己經(jīng)在文獻(xiàn)中廣泛描述，例如參閱C.G.AThomas,MedicalMicrobiology,BailliereTindall,GreatBritain1983，其整體內(nèi)容通過引用并入本文。前述列表的每一內(nèi)容都是闡述性的而非旨在限制。本文使用的術(shù)語"癌癥抗原"和"腫瘤抗原"可交換地使用來表示化合物，如肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白，其與腫瘤或癌細(xì)胞相關(guān)，并且在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子環(huán)境中的抗原呈遞細(xì)胞表面上表達(dá)時(shí)能夠激發(fā)免疫應(yīng)答。由癌細(xì)胞差異表達(dá)的癌癥抗原能夠被利用以耙向癌細(xì)胞。癌癥抗原是可能明顯地刺激腫瘤特異免疫應(yīng)答的抗原。這些抗原中的一些由正常細(xì)胞編碼，盡管不必須由正常細(xì)胞表達(dá)。這些抗原可以被表征為在正常細(xì)胞中通常沉默(即不表達(dá))的、僅在分化的某些階段表達(dá)的，和短暫表達(dá)的抗原(例如胚胎抗原和胎兒抗原)。其它癌癥抗原由突變的細(xì)胞基因編碼，例如癌基因(例如激活的ms癌基因)、抑制基因(例如突變的p53)、得自內(nèi)部缺失或染色體易位的融合蛋白。還有其它癌癥抗原可以由病毒基因編碼，例如RNA和DNA腫瘤病毒上載有的病毒基因。癌癥抗原可以通過制備癌細(xì)胞粗提物(例如CohenPAetal.(1994)CancerRes54:1055-8中所述)、通過部分純化抗原、通過重組激素或通過己知抗原的從新合成從癌細(xì)胞中制備。癌癥抗原包括但不限于被重組表達(dá)的抗原、其免疫原性部分或其完整的腫瘤或癌癥或細(xì)胞。這類抗原可以被重組地或通過本領(lǐng)域己知的任何其它手段分離或制備。腫瘤抗原的例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫氨酶結(jié)合蛋白(ADAbp)、親環(huán)蛋白b、結(jié)腸直腸相關(guān)抗原(CRC)--C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、amll、前列腺特異抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-l、PSA-2禾HPSA畫3、前列腺特異膜抗原(PSMA)、T-細(xì)胞受體/CD3;鏈、MAGE-家族的腫瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE隱A4、MAGE畫A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AIO、MAGE-All、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE畫B3)、MAGE畫Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE-家族的腫瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE畫2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE隱7、GAGE扁8、GAGE畫9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT隱V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、Qf-肽蛋白、E-鈣粘蛋白、ce-連環(huán)蛋白、/3-連環(huán)蛋白和7連環(huán)蛋白、pl20ctn、gpl00Pmelll7、PRAME、NY-ESO-l、cdc27、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(APC)、胞影蛋白、連接蛋白37、Ig-獨(dú)特型、p15、gp75、GM2和GD2神經(jīng)節(jié)苷酯、病毒產(chǎn)物如人乳頭狀瘤病毒蛋白、Smad家族的腫瘤抗原、lmp-l、P1A、EBV-編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX隱1、SSX-4、SSX-5、SCP隱1和CT-7，以及c-erbB-2。該列表不表示限制。本文使用的"變應(yīng)原"是能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的分子，所述免疫應(yīng)答特征在于生產(chǎn)IgE。變應(yīng)原也是能夠在易感的受試者中誘導(dǎo)變應(yīng)性應(yīng)答或哮喘應(yīng)答的物質(zhì)。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語變應(yīng)原表示特異類型的抗原，其引發(fā)由IgE抗體介導(dǎo)的變應(yīng)性應(yīng)答。變應(yīng)原的列表是龐大的并可包括花粉、昆蟲毒液、動物皮屑粉塵、真菌孢子和藥物(例如青霉素)。天然的動物和植物變應(yīng)原的例子包括對以下屬特異的蛋白質(zhì)Canis(C朋z、々mz7zYm'力；Dermatophagoides(例如Z)e/7wa/opAagc^fifesy^tn.wae);Felis(Fe/z'sdom&y"cws》Ambrosia(^mZros7.aaWem^/^/b/Zfl);Lolium(例如Zo//wm/e;-e朋e禾口丄o/z.wmmw/^/7oram);Cryptomeria(O^/^owen'ay.opom'ca);Alternaria(yl/te/7zan.afl/ferwato);Aider;Alnus(yl/ww51gw/riwosa);Betula(5e似/avem/cos");Quercus(2w"ctwa腸)；Olea(6/eaewraj:a);Artemisia(v^te/m'w'avw/gan力；Plantago(例如尸/朋tago/awceo/ata);Parietaria(例如尸an'etan'aq^c/wafo禾口/wdaz'ca);Blattella(例如5/a"e〃agermaw'ca);Apis(例如J/^wwtoy7on/m);Cupressus(例如Cw/7ray5m"/w/erv7'rera、Q/pms;ywj禾口Cw/mwtwwacracarpa);Juniperus(例如Jwm)emssaZH'"o/cfes1、c/wm)en^Wr^"Zawa、/wm》en^cowmwm^禾口/wm》en^;Thuya(例如77w少a;Chamaecyparis(例如CAawaecj^"n'51oZ)A"fl);Periplaneta(例如尸en》/"/2etofl/we"'c"wa);Agropyron(例如v4gra/_>ro"repe/iy);Secale(例如Seca/ecerea/e);Triticum(例如7h'ric簡aeWv腿);Dactylis(例如Z)ac(ytog7omerata);Festuca(例如FeWwcae/a"or);Poa(例如尸oapratewsz、禾口尸oflcompreMa);Avena(例如Xvewasa&va);Holcus(例如i/o/ci^/awa^y);Anthoxanthum(例如JwAoxaw/Aw/Mocfora,wm);Arrhenatherum(例如J/rAewaAen/Ane/ari"s);Agrostis(例如jgrostoa/6a);Phleum(例如尸^/ewm/rate似e);Phalaris(例如尸Aa/an、anw&"acea);Paspalum(例如尸as/a/ww);Sorghum(例如5brgAwmAa/e/ew57^)禾口Bromus(例如5ramtw/weA7m、)。本發(fā)明一方面提供了本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗原的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN與抗原共價(jià)連接。免疫刺激性O(shè)RN和抗原之間的共價(jià)聯(lián)接可以是任何合適種類的共價(jià)聯(lián)接，只要免疫刺激性O(shè)RN和抗原如此結(jié)合時(shí)保留各自組建的可測量的功能活性即可。在一個(gè)實(shí)施方案中，共價(jià)聯(lián)接是直接的。在另一實(shí)施方案中，共價(jià)聯(lián)接是間接的，例如通過接頭部分。共價(jià)連接的免疫刺激性O(shè)RN和抗原可以在細(xì)胞內(nèi)被加工以彼此釋放。以此種方式，任一組分遞送至細(xì)胞與作為獨(dú)立制劑或獨(dú)立組分施用時(shí)其遞送相比可被增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是抗原本身，即其為預(yù)先形成的抗原。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種藥物組合物，其包含與遞送媒介結(jié)合的本發(fā)明的組合物。在多種實(shí)施方案中，遞送媒介可選自陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、螺旋體、病毒顆粒、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)、微粒、微球、毫微球、單層囊泡(LUV)、多層囊泡、水包油乳劑、油包水乳劑、乳體和聚陽離子肽，和任選的可藥用的運(yùn)載體。可藥用的運(yùn)載體在下文討論。本發(fā)明的藥物組合物任選地可以進(jìn)一步包含抗原。本發(fā)明的組合物與存在的抗原一起，使用合適的方法被送入與遞送媒介的物理結(jié)合中。免疫刺激性組合物可以包含在遞送媒介中，或其可以存在于遞送媒介的溶劑暴露的表面上或與之結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN存在于遞送媒介的溶劑暴露的表面上或與之結(jié)合，且如果存在抗原的話，其包含在遞送媒介中。在另一實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN和抗原二者均存在于遞送媒介的溶劑暴露表面上或與之結(jié)合。還在另一實(shí)施方案中，抗原存在于遞送媒介的溶劑暴露表面上或與之結(jié)合，免疫刺激性O(shè)RN包含在遞送媒介中。還在另一實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN和抗原二者(如果包含抗原的話)均包含在遞送媒介中。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的免疫刺激性組合物的使用方法。本發(fā)明一方面提供了激活免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括下述步驟將免疫細(xì)胞與有效量的本發(fā)明組合物體外或體內(nèi)接觸，以激活免疫細(xì)胞。本發(fā)明的組合物可任選地含有抗原。本文使用的"免疫細(xì)胞"是指任何骨髓衍生的細(xì)胞，其參與先天的或適應(yīng)的免疫應(yīng)答。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞包括，但不限于樹狀突細(xì)胞(DC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及其前體細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"有效量"是指導(dǎo)致期望的生物效應(yīng)的必要或充分的物質(zhì)量。有效量能夠但是不必須受限于單次施用中施用的量。本文使用的術(shù)語"激活免疫細(xì)胞"是指誘導(dǎo)免疫細(xì)胞進(jìn)入與免疫應(yīng)答相關(guān)的活化狀態(tài)。術(shù)語"激活免疫細(xì)胞"是指誘導(dǎo)和增加免疫應(yīng)答二者。本文使用術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指先天的或適應(yīng)的免疫應(yīng)答的任何方面，所述免疫應(yīng)答反映了免疫細(xì)胞增殖、進(jìn)行效應(yīng)器免疫功能或生產(chǎn)涉及免疫應(yīng)答的基因產(chǎn)物的活化。涉及免疫應(yīng)答的基因產(chǎn)物可包括分泌的產(chǎn)物(例如抗體、細(xì)胞因子和趨化因子)以及免疫功能的特征性的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面分子(例如某些分化抗原簇(CD)、轉(zhuǎn)錄因子和基因轉(zhuǎn)錄物)。術(shù)語"免疫應(yīng)答"可以應(yīng)用于單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞種群?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的若干方法中的任何方法來評估細(xì)胞因子的生產(chǎn)，所述方法包括生物反應(yīng)測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、細(xì)胞內(nèi)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析和反轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答涉及前炎性細(xì)胞因子免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。前炎性細(xì)胞因子免疫應(yīng)答可包括某些細(xì)胞因子和趨化因子中任何的表達(dá)，包括IFN-7、TNF-a、IL-12、IL-IO、IL-6及其任何組合。其特異地就本發(fā)明的目的排除IFN-o;。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答涉及免疫細(xì)胞激活的細(xì)胞表面標(biāo)記的上調(diào)，例如CD25、CD80、CD86和CD154。用于測量這類標(biāo)記的細(xì)胞表面表達(dá)的方法是本領(lǐng)域公知的并包括FACS分析。為了測量細(xì)胞或細(xì)胞種群中的免疫應(yīng)答，在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞種群表達(dá)TLR8。細(xì)胞可以天然地表達(dá)TLR，或可以通過向細(xì)胞中引入TLR的合適表達(dá)載體將其操作為表達(dá)TLR。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的細(xì)胞或細(xì)胞種群為外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的細(xì)胞或細(xì)胞種群為表達(dá)TLR的細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的細(xì)胞或細(xì)胞種群為表達(dá)TLR的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的細(xì)胞或細(xì)胞種群是表達(dá)TLR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。還為了用于測量細(xì)胞或細(xì)胞種群中的免疫應(yīng)答，向細(xì)胞或細(xì)胞種群中引入報(bào)告子構(gòu)建體可以是便利的，所述構(gòu)建體應(yīng)答于TLR引起的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這里報(bào)告子是位于NF-zcB啟動子調(diào)控下的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于所述啟動子調(diào)控下的基因是螢光素酶。在合適的激活條件下，螢光素酶報(bào)告子構(gòu)建體被表達(dá)并發(fā)出可檢測的光信號，所述信號可以使用發(fā)光計(jì)定量地測量。這類報(bào)告子構(gòu)建體和其它合適的報(bào)告子構(gòu)建體是可商業(yè)獲得的。本發(fā)明還考慮了監(jiān)測TLR激活的無細(xì)胞方法的用途。本發(fā)明在某些方面涉及用于治療用途的組合物和方法。本發(fā)明的免疫刺激性組合物可以單獨(dú)使用或與其它治療劑組合使用。免疫剌激性組合物和其它治療劑可以同時(shí)或連續(xù)施用。當(dāng)本發(fā)明的免疫刺激性組合物和其它治療劑同時(shí)施用時(shí)，它們可以在相同或獨(dú)立的配方中施用，但是同時(shí)施用。另外，當(dāng)本發(fā)明的免疫刺激性組合物和其它治療劑同時(shí)施用時(shí)，它們可以通過相同或獨(dú)立的施用途徑被施用，但是同時(shí)施用。當(dāng)本發(fā)明的免疫刺激性組合物的施用暫時(shí)與另一治療劑的施用分離時(shí)，本發(fā)明的免疫刺激性組合物和另一治療劑被連續(xù)施用。這些化合物施用之間時(shí)間上的分離可以是大約數(shù)分鐘或可以更久。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性組合物在施用另一治療劑之前被施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性組合物在施用另一治療劑之后被施用。另外，當(dāng)本發(fā)明的免疫刺激性組合物和另一治療劑被連續(xù)施用時(shí)，它們可以通過相同或獨(dú)立的施用途徑被施用。其它治療劑包括但不限于適用于治療感染、癌癥、變態(tài)反應(yīng)和哮喘的佐劑、抗原、疫苗和藥物。本發(fā)明的一方面提供了對受試者疫苗接種的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用抗原和本發(fā)明組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用抗原包括施用編碼抗原的核酸。本文使用的"受試者"是指脊椎動物。在多個(gè)實(shí)施方案中，受試者是人、非人靈長類、或其它哺乳動物。在某些實(shí)施方案中，受試者是小鼠、大鼠、荷蘭豬、兔、貓、犬、豬、綿羊、山羊、?；蝰R。為了在疫苗接種受試者的方法中使用，本發(fā)明的組合物在一個(gè)實(shí)施方案中包含抗原?？乖梢詮谋景l(fā)明的ORN中分離或與之共價(jià)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物自身不包含抗原。在該實(shí)施方案中，該抗原可以與本發(fā)明的組合物分離地或與本發(fā)明的組合物一起被施用給受試者。獨(dú)立的施用包括時(shí)間的獨(dú)立、位點(diǎn)或施用途徑的獨(dú)立，或時(shí)間和位點(diǎn)或施用途徑均獨(dú)立。當(dāng)本發(fā)明的組合物和抗原在時(shí)間上被獨(dú)立施用時(shí)，抗原可以在本發(fā)明的組合物之前或之后被施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原在本發(fā)明的組合物施用之后48小時(shí)到4周被施用。該方法還考慮了在最初施用抗原和組合物之后，一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)免疫劑量的抗原單獨(dú)施用、組合物單獨(dú)施用、或抗原和組合物的施用。本發(fā)明還包括可以通過對受試者施用本發(fā)明的組合物來制備將來遭遇未知抗原的受試者，其中所述組合物不含有抗原。根據(jù)該實(shí)施方案，受試者的免疫系統(tǒng)被制備為具有對受試者稍后遭遇的抗原更有力的應(yīng)答，所述遭遇例如通過環(huán)境或職業(yè)暴露。這類方法可用于例如可能暴露于微生物物質(zhì)的旅行者、醫(yī)療工作者和戰(zhàn)士。本發(fā)明的一方面提供了治療患有免疫系統(tǒng)缺陷的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明的組合物以治療受試者的步驟。本文使用的"免疫系統(tǒng)缺陷"是指被異常阻抑的免疫系統(tǒng)針對抗原發(fā)生免疫應(yīng)答的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫系統(tǒng)缺陷是一種疾病或病癥，其中受試者的免疫系統(tǒng)不以正常的能力作用，或其中加強(qiáng)受試者的免疫應(yīng)答會適用于例如消除受試者中的腫瘤或癌癥或感染。本文使用的"患有免疫缺陷的受試者"是指下述受試者，其中受試者的免疫系統(tǒng)針對抗原發(fā)生免疫應(yīng)答的能力被阻抑?；加忻庖呷毕莸氖茉囌甙ň哂蝎@得性免疫缺陷的受試者以及具有先天性免疫系統(tǒng)缺陷的受試者?；加蝎@得性免疫缺陷的受試者包括但不限于患有慢性炎性病癥的受試者、患有慢性腎功能不全或腎功能衰竭的受試者、患有感染的受試者、患有癌癥的受試者、接受免疫抑制藥的受試者、接受其它免疫抑制治療的受試者和患有營養(yǎng)不良的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有被抑制的CD4+T細(xì)胞種群。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者感染了人免疫缺陷病毒(HIV)或患有獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法從而提供了用于在需要更有力的免疫應(yīng)答的受試者中加強(qiáng)免疫應(yīng)答或加強(qiáng)發(fā)生免疫應(yīng)答的能力的方法。本發(fā)明的組合物和方法可以單獨(dú)使用或與適用于治療感染的其它試劑和方法結(jié)合使用。本發(fā)明一方面提供了治療患有感染的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括向患有感染的受試者施用有效量的本發(fā)明組合物以治療受試者的步驟。本發(fā)明的一方面提供了治療患有感染的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括向患有感染的受試者施用有效量的本發(fā)明組合物和感染藥物以治療受試者的步驟。本發(fā)明的一方面提供了本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中的感染。本發(fā)明的一方面提供了適用于治療感染的組合物。根據(jù)該方面的組合物包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和感染藥物。本文關(guān)于患有疾病或病癥的受試者的方面使用的術(shù)語"治療"應(yīng)當(dāng)表示在受試者中預(yù)防、改善或消除疾病或病癥的至少一個(gè)征兆或癥狀。"患有感染的受試者"是下述受試者，所述受試者患有由傳染性微生物對受試者淺表的、局部的或全身性的入侵引起的病癥。傳染性微生物可以是如上所述的病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲。感染藥物包括但不限于抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗寄生蟲劑。例如"抗感染劑"、"抗生素"、"抗菌劑"、"抗病毒劑"、"抗真菌劑"、"抗寄生蟲劑"、"殺寄生蟲劑"對本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員而言具有確定的含義并在標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)文章中定義。簡言之，抗菌劑殺死或抑制細(xì)菌，并包括抗生素以及其它具有類似功能的合成或天然的化合物?？共《緞┛梢詮奶烊粊碓粗蟹蛛x或合成，并適用于殺死或抑制病毒?？拐婢鷦┍挥糜谥委煖\表的真菌感染以及機(jī)會性的和初級全身性真菌感染。抗寄生蟲劑殺死或抑制寄生蟲。很多抗生素是低分子量分子，其作為細(xì)胞如微生物的刺激代謝產(chǎn)物被生產(chǎn)?？股匾话愀腥疚⑸锾禺惖?、不存在于宿主細(xì)胞中的一種或多種功能或結(jié)構(gòu)?？垢腥警煼ǖ膯栴}之一是用抗感染劑治療時(shí)宿主中發(fā)生的副作用。例如，許多抗感染劑可殺死或抑制廣譜的微生物，而不對具體類型的物種特異。用這些類型的抗感染劑治療導(dǎo)致殺死宿主中生活的正常菌群以及感染性微生物。所述菌群的喪失可導(dǎo)致疾病并發(fā)癥并使宿主易于被其它病原體感染，因?yàn)樗鼍号c傳染性病原體競爭并起到對傳染性病原體的屏障的作用。其它副作用可以由這些化學(xué)實(shí)體對宿主的非微生物細(xì)胞細(xì)胞或組織的特異性或非特異性作用引起。廣泛使用抗感染劑的另一問題在于抗生素抗性的微生物菌株的發(fā)展。已經(jīng)發(fā)展了萬古霉素抗性的ewteracoc"'、青霉素抗性的戶"ewmococ"'、多重抗性的5".aM"t^和多重抗性的似&rcw/a^菌株，并且成為主要的臨床問題?？垢腥緞┑膹V泛使用可能會產(chǎn)生許多抗生素抗性的細(xì)菌菌株。因此，需要新的抗感染策略來抗擊這些微生物。能有效殺死或抑制大范圍細(xì)菌的抗菌抗生素是指廣譜抗生素。其它類型的抗菌抗生素主要對革蘭氏陽性或革蘭氏陰性種類的細(xì)菌有效。這些類型的抗生素被稱作窄譜抗生素。對單個(gè)生物或疾病有效而不針對其它類型的細(xì)菌的其它抗生素被稱作限譜抗生素(limited-spectrumantibiotics)。抗菌劑有時(shí)根據(jù)它們的主要作用模式被分類。抗菌劑一般是細(xì)胞壁合成抑制劑、細(xì)胞膜抑制劑、蛋白質(zhì)合成抑制劑、核酸合成或功能抑制劑和競爭性抑制劑。細(xì)胞壁合成抑制劑抑制細(xì)胞壁合成過程中的一個(gè)步驟，通常在細(xì)菌肽聚糖的合成中。細(xì)胞壁合成抑制劑包括^-內(nèi)酰胺抗生素、天然青霉素、半合成青霉素、氨芐西林、克拉維酸、頭孢菌素類和桿菌肽。/3-內(nèi)酰胺是含有四元/3-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，其抑制肽聚糖合成的最后一步。i3-內(nèi)酰胺抗生素可以是合成的或天然的。由；^m'a7/^m生產(chǎn)的/3-內(nèi)酰胺抗生素是天然的青霉素，例如青霉素G或青霉素V。這些通過尸em'c/〃^mcAo^oge肌m的發(fā)酵產(chǎn)生。天然青霉素具有窄譜的活性，并通常針對》eptococcws、Gowococcws禾口5Vap/i_v/ccoccws有效。X寸革蘭氏陽性細(xì)菌也有效的其它類型的天然青霉素包括青霉素F、X、K和O。半合成的青霉素通常是由霉菌生產(chǎn)的6-氨基青霉烷酸分子的修飾。6-氨基青霉垸酸可以通過添加側(cè)鏈被修飾，這產(chǎn)生了與天然青霉素相比具有更廣譜的活性或多種其它有利特征的青霉素。一些類型的半合成青霉素具有針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的廣譜，但是被青霉素酶滅活。這些半合成的青霉素包括氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林。其它類型的半合成青霉素具有針對革蘭氏陽性細(xì)菌的較窄的活性，但是具有發(fā)達(dá)的特性從而不被青霉素酶滅活。這些包括例如甲氧西林、雙氯西林和萘夫西林。一些廣譜半合成青霉素可以與/-內(nèi)酰胺酶抑制劑例如克拉維酸和舒巴坦(sulbactam)組合使用。^內(nèi)酰胺酶抑制劑不具有抗菌作用，但是它們作用于抑制青霉素酶，從而保護(hù)半合成的青霉素不被降解。另一種類型的/3-內(nèi)酰胺抗生素是頭孢菌素類。它們對細(xì)菌^-內(nèi)酰胺酶的降解敏感，并從而通常不單獨(dú)有效。然而，頭孢菌素類是青霉素酶抗性的。它們對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌是有效的。頭孢菌素類包括，但不限于頭孢噻吩、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢孟多、頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢磺啶、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶和拉氧頭孢。桿菌肽是另一種類的抗生素，其通過抑制胞壁肽亞單元或肽聚糖從下述分子的釋放來抑制細(xì)胞壁合成，所述分子將亞基遞送至膜的外側(cè)。盡管桿菌肽對革蘭氏陽性細(xì)菌是有效的，但是因?yàn)樗母叨拘?，其用途通常被限制在局部施用中。碳青霉烯類是另一種廣譜/3-內(nèi)酰胺抗生素，其能夠抑制細(xì)胞壁合成。碳青霉烯的例子包括，但不限于亞胺培南(imipenem)。單環(huán)/5-內(nèi)酰胺也是廣譜/3-內(nèi)酰胺抗生素，其包括優(yōu)特納(euztreonam)。由生產(chǎn)的一種抗生素萬古霉素，也是通過抑制細(xì)胞膜合成對革蘭氏陽性菌有效的。另一類抗菌劑是屬于細(xì)胞膜抑制劑的抗菌劑。這些化合物破壞細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)或抑制其功能。屬于細(xì)胞膜抑制劑的抗菌劑的一個(gè)問題是因?yàn)榧?xì)菌和真核生物膜中磷脂的類似性，它們可以在真核細(xì)胞中以及細(xì)菌中產(chǎn)生作用。因此，這些化合物很少足夠特異以允許這些化合物被全身性地使用，并預(yù)防高劑量的局部施用。一種臨床有用的細(xì)胞膜抑制劑為多粘菌素(Polymyxin)。多粘菌素通過與膜磷脂結(jié)合干涉膜功能。多粘菌素主要針對革蘭氏陰性細(xì)菌有效，并通常被用于對較小毒性抗生素有抗性的嚴(yán)重的尸^^/omo"^感染或Aei^omo"^感染中。與全身性施用該化合物相關(guān)的嚴(yán)重副作用包括對腎和其它器官的損傷。其它細(xì)胞膜抑制劑包括兩性霉素B(AmphotericinB)和制霉菌素(Nystatin),其為主要用于治療全身性真菌感染和Om^'c/a酵母感染中的抗真菌劑。咪唑是屬于細(xì)胞膜抑制劑的另一類抗生素。咪唑被用作抗菌劑以及抗真菌劑，例如用于治療酵母感染、皮膚寄生蟲感染和全身性真菌感染。咪唑包括但不限于克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑(itraconazole)和氟康唑(fluconazole)。許多抗菌劑是蛋白質(zhì)合成抑制劑。這些化合物阻止細(xì)菌合成結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和酶，從而引起細(xì)菌細(xì)胞生長或功能的抑制或細(xì)胞死亡。通常，這些化合物干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯的過程。妨礙轉(zhuǎn)錄的抗菌劑包括但不限于利福平(Rifampins)和乙胺丁醇(Ethambutol)。抑制RNA聚合酶的利福平具有廣譜活性，并對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌以及A^coZwcte〃'wm/w&rc"/a;y有效。乙胺丁醇對Afyco6acten'應(yīng)^^eraz/os^有效。封閉轉(zhuǎn)錄的抗菌劑千擾細(xì)菌核糖體，以阻止mRNA被翻譯為蛋白質(zhì)。通常，該種類的化合物包括但不限于四環(huán)素類、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(例如紅霉素)和氨基糖苷類(例如鏈霉素)。氨基糖苷類是由細(xì)菌^reptom少c^生產(chǎn)的一種抗生素，例如鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星(amikacin)和慶大霉素。氨基糖苷類已經(jīng)用于針對由革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌引起的多種細(xì)菌感染。鏈霉素已經(jīng)被廣泛地用作治療結(jié)核病(似6ww/o^)的主要藥物。慶大霉素被用于(特別是與妥布霉素組合)針對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌包括尸wt^omo"^的感染?？敲顾乇挥糜卺槍υS多革蘭氏陽性細(xì)菌，包括青霉素抗性的Stoj^;;fococa'。限制氨基糖苷類臨床用途的一個(gè)副作用是在功效必需的劑量下，長期使用顯示損傷腎功能并引起導(dǎo)致耳聾的聽神經(jīng)損傷。另一種類型的翻譯抑制劑抗菌劑是四環(huán)素類。四環(huán)素類是一種抗生素，其為廣譜的并針對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌有效。四環(huán)素類的例子包括四環(huán)素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素和金霉素。它們對于治療許多類型的細(xì)菌是重要的，但是在萊姆病(Lymedisease)的治療中尤其重要。因?yàn)樗鼈兊牡投拘院妥钚〉闹苯痈弊饔?，四環(huán)素類已經(jīng)被醫(yī)學(xué)界超量使用和濫用，弓l起多個(gè)問題。例如，它們的超量使用已經(jīng)引起抗性的廣泛產(chǎn)生?？咕鷦┤绱蟓h(huán)內(nèi)酯類與50S核糖體亞基可逆結(jié)合，并通過肽基轉(zhuǎn)移酶抑制蛋白質(zhì)的延伸或阻止不帶電的tRNA從細(xì)菌核糖體上釋放，或二者兼有。這些化合物包括紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、竹桃霉素和阿奇霉素。紅霉素對多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌、A^^en'a、丄eg/o"e〃a禾卩ifoewo;/n7i^是活性的，但是對五w/eraZ^cten'aceae不是活性的。封閉蛋白質(zhì)合成期間肽鍵形成的林可霉素和克林霉素用于針對革蘭氏陽性細(xì)菌。另一種類型的翻譯抑制劑是氯霉素。氯霉素結(jié)合70S核糖體，抑制細(xì)菌酶肽基轉(zhuǎn)移酶，從而阻止蛋白質(zhì)合成期間肽鏈的生長。與氯霉素相關(guān)的一個(gè)嚴(yán)重的副作用是再生障礙性貧血。在小部分(l/50,000)患者中，再生障礙性貧血在有效治療細(xì)菌的氯霉素劑量下發(fā)生。由于貧血導(dǎo)致的死亡，曾經(jīng)被大量開處方的抗生素氯霉素現(xiàn)在很少使用。其因?yàn)橛行远匀挥糜谖＜吧臓顩r(例如傷寒病)。一些抗菌劑破壞核酸合成或功能，例如與DNA或RNA結(jié)合從而它們的信號不能被閱讀它們包括但不限于喹諾酮類和復(fù)方新諾明(COtrimoxazole)(二者均為合成的化學(xué)品)和利福霉素(天然或半合成的化學(xué)品)。喹諾酮通過抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)封閉細(xì)菌的DNA復(fù)制，細(xì)菌需要所述旋轉(zhuǎn)酶來生產(chǎn)它們的環(huán)狀DNA。它們是廣譜的，例子包括諾氟沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、萘啶酸和替馬沙星。萘啶酸是結(jié)合DNA旋轉(zhuǎn)酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶)的殺菌劑，其對于DNA的復(fù)制是關(guān)鍵的，并允許超螺旋被釋放和再形成，抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶活性。萘啶酸的主要用途是治療下泌尿道感染(UTI)，因?yàn)槠鋵TI的常見原因——若干種革蘭氏陰性菌如co/z'、5Vz/era6acferaeragewa5、AT./wewwom'ae禾口尸ra&tw的禾中是有效的。復(fù)方新諾明是磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)和甲氧芐啶(trimeth叩rim)的組合，其封閉制造DNA核苷酸所需的葉酸的細(xì)菌合成。利福平是對革蘭氏陽'性細(xì)菌(包括Afyco6(3cten'wm^/6ercw/a^5禾口由7Ve/Men'fl引起的腦膜炎)和一些革蘭氏陰性細(xì)菌有活性的利福霉素的衍生物。利福平與聚合酶的/3亞基結(jié)合并封閉第一個(gè)核苷酸(其是激活聚合酶所必需的)的添加，從而封閉mRNA合成。另一類抗菌劑是起到細(xì)菌酶的競爭性抑制劑作用的化合物。競爭性抑制劑幾乎全部與細(xì)菌生長因子結(jié)構(gòu)類似并競爭結(jié)合，但是在細(xì)胞中不進(jìn)行代謝功能。這些化合物包括磺胺類和化學(xué)修飾形式的磺胺，其具有更高或更廣泛的抗菌活性。磺胺類(例如磺胺異噁唑和甲胺芐啶)適用于治療^r印tococct^j9wewwow'ae、/3-溶血性鏈球菌和co//，并已經(jīng)用于治療由五.引起的不復(fù)雜的UTI和用于腦膜炎球菌性腦膜炎的治療中?？共《緞┦欠乐辜?xì)胞被病毒感染或防止細(xì)胞中病毒復(fù)制的化合物。存在比抗菌藥更少的抗病毒藥，因?yàn)椴《緩?fù)制的過程與宿主細(xì)胞中的DNA復(fù)制密切相關(guān)，使得非特異性的抗病毒劑通常對宿主細(xì)胞有毒。在病毒感染的過程中存在若干階段，其可以被抗病毒劑封閉或抑制。這些階段包括病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合(免疫球蛋白或結(jié)合肽)、病毒脫殼(例如金剛烷胺)、病毒mRNA的合成或翻譯(例如干擾素)、病毒RNA或DNA的復(fù)制(例如核苷類似物)、新的病毒蛋白質(zhì)的成熟(例如蛋白酶抑制劑)和病毒的出芽和釋放?？共《緞┑牧硪环懂犑呛塑疹愃莆?。核苷類似物是與核苷類似的合成的化合物，但是具有不完全的或異常的脫氧核糖或核糖基團(tuán)。核苷類似物一旦處于細(xì)胞中就被磷酸化，產(chǎn)生三磷酸鹽形式，其與正常的核苷酸競爭整合進(jìn)病毒DNA或RNA中。一旦核苷類似物的三磷酸鹽形式被整合進(jìn)生長的核酸鏈中，其引起與病毒聚合酶的不可逆的結(jié)合和由此導(dǎo)致的鏈終止。核苷類似物包括，但不限于阿昔洛韋(用于治療單純皰疹病毒和水痘一帶狀皰疹病毒)、更昔洛韋(gancyclovir)(用于治療巨細(xì)胞病毒)、碘苷、利巴韋林(用于治療呼吸道合胞病毒(respiratorysyncitialvirus))、雙脫氧肌苷、扎西他濱和齊多夫定(疊氮胸苷)。另一類抗病毒劑包括細(xì)胞因子，例如干擾素。干擾素是由病毒感染的細(xì)胞以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。干擾素如下作用與被感染細(xì)胞鄰近細(xì)胞上的特異受體結(jié)合，引起細(xì)胞中的改變，所述改變保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染。a和/3干擾素也誘導(dǎo)被感染的細(xì)胞表面上I類和II類MHC分子的表達(dá)，導(dǎo)致增加的抗原出現(xiàn)用于宿主免疫細(xì)胞識別。a和/3干擾素可作為重組體形式獲得，并已經(jīng)被用于治療慢性乙型肝炎和丙型肝炎感染。在對抗病毒治療有效的劑量下，干擾素具有嚴(yán)重的副作用例如發(fā)燒、不適和體重減輕。免疫球蛋白療法被用于預(yù)防病毒感染。用于病毒感染的免疫球蛋白療法與用于細(xì)菌感染的不同，因?yàn)槊庖咔虻鞍庄煼ㄍㄟ^結(jié)合細(xì)胞外病毒體并阻止它們攻擊和進(jìn)入對病毒感染易感的細(xì)胞，而不是抗原特異的。該療法適用于在抗體存在于宿主中的一段時(shí)期內(nèi)預(yù)防病毒感染。通常有兩種類型的免疫球蛋白療法，正常的免疫球蛋白療法和超免疫球蛋白療法。正常的免疫球蛋白療法利用一種抗體產(chǎn)物，所述抗體產(chǎn)物從正常血供體的血清中制備并合并。該合并的產(chǎn)物具有對大范圍的人病毒的低抗體效價(jià)，所述病毒例如甲型肝炎、細(xì)小病毒、腸道病毒(特別是在新生兒中)。超免疫球蛋白療法利用從下述個(gè)體的血清中制備的抗體，所述個(gè)體具有對具體病毒的高抗體效價(jià)。然后使用這些抗體針對特異的病毒。超免疫球蛋白的例子包括帶狀皰疹免疫球蛋白(適用于在免疫妥協(xié)的兒童和新生兒中預(yù)防水痘)、人狂犬病免疫球蛋白(適用于被患狂犬病的動物咬傷的受試者的暴露后預(yù)防中)、乙型肝炎免疫球蛋白(適用于預(yù)防乙型肝炎病毒，特別是在暴露于該病毒的受試者中)和RSV免疫球蛋白(適用于治療呼吸道合胞病毒感染)。抗真菌劑適用于治療和預(yù)防感染性真菌?？拐婢鷦┯袝r(shí)通過它們的作用機(jī)制被分類。一些抗真菌劑通過抑制葡萄糖合酶作為細(xì)胞壁抑制劑作用。這些包括但不限于bashmgin/ECB。其它抗真菌劑通過使膜完整性失穩(wěn)定而作用。這些包括，但不限于咪唑，例如克霉唑、sertaconzole、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和伏立康唑，以及FK463、兩性霉素B、BAY38-9502/MK991、普拉米星、UK292、布替萘芬和特比萘芬。其它抗真菌劑通過降解殼多糖(例如殼多糖酶)或免疫抑制(501乳霜)作用。殺寄生蟲劑是直接殺死寄生蟲物質(zhì)。這類化合物是本領(lǐng)域已知的并通常可商業(yè)獲得。適用于人施用的殺寄生蟲劑的例子包括但不限于阿苯達(dá)唑、兩性霉素B、芐硝唑、硫氯酚、氯喹HC1、磷酸氯喹、克林霉素、去氫依米丁、乙胺嗪、二氯尼特(diloxanidefiiroate)、依氟鳥氨酸、呋喃唑酮、糖皮質(zhì)激素、氯氟菲醇(halofantrine)、雙碘喹啉(iodoquinol)、伊維菌素(ivermectin)、甲苯達(dá)唑(mebendazole)、甲氟喹(mefloquine)、葡甲胺銻酸鹽(meglumineantimoniate)、美拉月申醇(melarsoprol)、美曲憐酉旨(metrifonate)、甲硝唑(metronidazole)、氯硝柳胺(niclosamide)、硝呋替莫(nifbrtimox)、奧沙、尼喹(oxamniquine)、巴龍霉素(paromomycin)、l圣乙石黃酸戊氧苯脒(pentamidineisethionate)、哌嗪(piperazine)、卩比喹酮(praziquantel)、伯氨喹(primaquinephosphate)、氯胍(proguanil)、噻嘧啶(pyrantelpamoate)、乙月安嘧徒匿石黃胺類(pyrimethanmine-sulfonamides)、乙月安嘧啶-磺胺多辛(pyrimethanmine-sulfadoxine)、鹽酸喹納克林(quinacrineHC1)、硫酸奎寧、奎尼丁葡萄糖酸鹽(quinidinegluconate)、螺旋霉素、葡萄糖酸銻鈉(葡萄糖酸銻鈉sodiumantimonygluconate)、蘇拉明、四環(huán)素、多西環(huán)素、噻苯達(dá)唑、替硝唑、trimethroprim-sulfamethoxazole和錐蟲胂胺。ORN也適用于治療和預(yù)防自身免疫疾病。自身免疫疾病是一類疾病，其中受試者自身的抗體與宿主組織反應(yīng)，或其中免疫效應(yīng)T細(xì)胞與內(nèi)源的自身肽自動反應(yīng)并引起組織破壞。因此，引發(fā)了針對受試者自身的抗原(稱作自體抗原)的免疫應(yīng)答。自身免疫疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Crohn's病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫腦脊髓炎、重癥肌無力(MG)、Hashimoto's甲狀腺炎、Goodpasture's綜合征、天皰瘡(例如尋常天皰瘡)、Grave's病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、帶有抗膠原抗體的硬皮病、混合性結(jié)締組織病、多肌炎、惡性貧血、原發(fā)性Addison's病、自身免疫相關(guān)性不育、腎小球腎炎(例如新月體腎小球腎炎、增生性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡、Sj6gren's綜合征、胰島素抵抗和自身免疫糖尿病。本文使用"自體抗原"是指正常宿主組織的抗原。正常的宿主組織不包括癌細(xì)胞。因此，在自身免疫病的上下文中，針對自體抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答是不期望的免疫應(yīng)答，并有助于破壞和損傷正常組織，而針對癌癥抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答是期望的免疫應(yīng)答，并有助于腫瘤或癌癥的破壞。因此，在本發(fā)明針對治療自身免疫病癥的一些方面，不推薦將ORN與自體抗原一起施用，尤其是屬于自身免疫病癥的靶標(biāo)的那些自體抗原。在其它情況下，ORN可以與低劑量的自體抗原一起被遞送。大量動物研究已經(jīng)證明低劑量抗原的粘膜施用可以導(dǎo)致免疫低反應(yīng)性或"耐受"的狀態(tài)。有效機(jī)制顯示是細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫偏差，所述偏差是從Thl到主要為Th2和Th3(即TGF-b支配的)的應(yīng)答偏差。低劑量抗原遞送的有效抑制也可以抑制不相關(guān)的免疫應(yīng)答(旁觀者抑制)，其在自身免疫疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE)治療中受到重要關(guān)注。旁觀者抑制涉及Thl-反-調(diào)節(jié)的、抑制劑細(xì)胞因子在局部環(huán)境中的分泌，所述局部環(huán)境中促炎癥的細(xì)胞因子和Thl細(xì)胞因子以抗原特異的或抗原非特異的方式被釋放。本文使用"耐受"是指該現(xiàn)象。事實(shí)上，口服耐受在動物中大量自身免疫病的治療中己經(jīng)是有效的，所述疾病包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性自身免疫重癥肌無力、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)和胰島素依賴性糖尿病。在這些模型中，自身免疫疾病的預(yù)防和抑制與抗原特異的體液和細(xì)胞應(yīng)答從Thl到Th2/Th3應(yīng)答的遷移相關(guān)。本發(fā)明的組合物和方法可以單獨(dú)使用或與適用于治療癌癥的其它試劑和方法結(jié)合使用。本發(fā)明一方面提供了治療患有癌癥的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對患有癌癥的受試者施用有效量的本發(fā)明組合物以治療受試者的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了治療患有癌癥的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對患有癌癥的受試者施用有效量的本發(fā)明的組合物和抗癌療法以治療受試者的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中的癌癥。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了適用于治療癌癥的組合物。根據(jù)該方面的組合物包括本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和癌癥藥物?；加邪┌Y的受試者是具有可檢測到的癌細(xì)胞的受試者。癌癥可以是惡性或非惡性的癌癥。本文使用"癌癥"是指不受控制的細(xì)胞生長，其干擾身體器官和系統(tǒng)的正常功能。從它們最初位置遷移并進(jìn)入重要器官的癌癥可通過受影響的器官的功能衰退最終導(dǎo)致受試者死亡。造血癌癥例如白血病能夠在受試者中戰(zhàn)勝正常的造血區(qū)室，從而導(dǎo)致造血失敗(以貧血、血小板減少和中性粒細(xì)胞減少的形式)，最終引起死亡。轉(zhuǎn)移灶是一個(gè)區(qū)域的癌細(xì)胞，其與原發(fā)性腫瘤的位置不同，得自癌細(xì)胞從最初的腫瘤散布至身體的其它部分。診斷原發(fā)性腫瘤塊時(shí)，可以監(jiān)測受試者的轉(zhuǎn)移灶的存在。除監(jiān)測特異的癥狀外，轉(zhuǎn)移灶通常通過單獨(dú)或組合使用磁共振成像(MRI)掃描、計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)掃描、血和血小板計(jì)數(shù)、肝功能研究、胸X射線檢查和骨掃描來探測。癌癥包括但不限于基底細(xì)胞癌、膽管癌；膀胱癌；骨癌；腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌；乳腺癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；結(jié)腸和直腸癌；結(jié)締組織癌；消化系統(tǒng)癌；子宮內(nèi)膜癌；食管癌；眼癌；頭與頸癌；上皮內(nèi)新生物；腎癌；喉癌；白血?。桓伟?；肺癌(例如小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌)；淋巴瘤，包括Hodgkin，s禾卩Non-Hodgkin，s淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、嘴和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統(tǒng)癌癥；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌癥以及其它癌(carcinomas)、腺癌禾口肉瘤(sarcomas)。本發(fā)明的免疫刺激性組合物還可以與抗癌療法一起被施用?？拱┋煼òò┌Y藥劑、輻射和手術(shù)操作。本文使用的"癌癥藥劑"是指被使用給受試者、目的在于治療癌癥的試劑。本文使用的"治療癌癥"包括預(yù)防癌癥的發(fā)生、減少癌癥的癥狀，和/或抑制確定的癌癥的生長。在其它方面，癌癥藥劑被施用給處于發(fā)生癌癥風(fēng)險(xiǎn)下的受試者，目的在于降低發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。本文公開了用于治療癌癥的多種類型的藥劑。就該說明書的目的而言，癌癥藥劑被分類為化學(xué)治療劑、免疫治療劑、癌癥疫苗、激素治療和生物學(xué)反應(yīng)修飾劑?；瘜W(xué)治療劑可選自甲氨喋呤、長春新堿、阿霉素、順鉑、不含糖的氯乙基亞硝基脲類、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、博來霉素、多柔比星、達(dá)卡巴嗪、泰素、fragyline、MeglamineGLA、戊柔比星、卡莫司汀和poliferposan、MMI270、BAY12-9566、RAS法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、MMP、MTA/LY231514、LY264618/Lometexo1、Glamolec、CI-994、TNP-470、和美新/托泊替康(Hycamtin/Topotecan)、PKC412、伐司樸達(dá)(Valspodar)/PSC833、諾安托(Novantrone)/Mitroxantrone、Metaret/蘇拉明(Suramin)、巴馬司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9陽AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN698、TA2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、LemonalDP2202、FK317、溶鏈菌(Picibanil)/OK-432、AD32/戊柔比星(Valrubicin)、氯化鍶(Metastron)/鍶衍生物、Temodal/替莫唑胺(Temozolomide)、阿霉素脂質(zhì)體(Evacet)/多柔比星脂質(zhì)體、Yewtaxan/紫杉醇(Paclitaxel)、泰素(Taxol)/紫杉醇(Paclitaxel)、西羅達(dá)(Xeload)/卡培他濱(Capecitabine)、氟鐵龍(Furtulon)/去氧氟尿苷(Doxifluridine)、Cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/順鉬、HMR1275/Flavopirido1、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制劑、BMS-182751/口服鉑、UFT(替加氟/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋咪唑(Levamisole)、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增強(qiáng)子、Campto/左旋咪唑(Levamisole)、Camptosar/伊立替康(Irinotecan)、Tumodex/Ralitrexed、Leustatin/克拉屈、)賓(Cladribine)、Paxex/紫杉醇、Doxil/多柔比星脂質(zhì)體、Caelyx/多柔比星脂質(zhì)體、福達(dá)華(Fludara)/氟達(dá)拉濱(Fludarabine)、Pharmarubicin/表柔比星(Epirubicin)、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis-Naphtalimide、LU103793/多拉司他汀(Dolastain)、Caetyx/多柔比星脂質(zhì)體、健擇(Gemzar)/吉西他濱(Gemcitabine)、ZD0473/Anormed、YM116、碘粒子(Iodineseeds)、CDK4和CDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/異環(huán)磷酰胺(Ifosamide)、威猛(Vumon)/替尼泊苷(Teniposide)、伯爾定(Paraplatin)/卡鉑(Carboplatin)、順鉑(Plantinol)/順鉑、足葉乙苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD9331、泰索帝(Taxotere)/多西紫杉醇(Docetaxel)、鳥嘌呤阿糖胞苷的前藥、紫杉烷類似物、亞硝基脲、烷化劑如melphelan和環(huán)磷酰胺、氨魯米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶、白消安(Busulfan)、卡鉑、苯丁酸氮芥(Chlorombucil)、鹽酸阿糖胞苷(CytarabineHC1)、更生霉素(Dactinomycin)、鹽酸柔紅霉素(DaunorubicinHC1)、雌莫司汀磷酸鈉(Estramustinephosphatesodium)、依托泊苷(VP16-213)、氟尿嘧啶脫氧核苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羥基脲(羥基尿素)、異磷酰胺(Ifosfamide)、干擾素a-2a、a-2b、醋酸亮丙瑞林(Leuprolideacetate)(LHRH-釋放因子類似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、鹽酸雙氯乙基甲胺(MechlorethamineHC1)(氮芥)、巰嘌呤(Mercaptopurine)、美司鈉(Mesna)、米托坦(Mitotane)(o.p'-DDD)、鹽酸米托蒽酉昆(MitoxantroneHC1)、奧曲肽(Octreotide)、普卡霉素(Plicamycin)、鹽酸丙卡巴阱(ProcarbazineHC1)、鏈佐星(Streptozocin)、枸櫞酸他莫昔芬(Tamoxifencitrate)、硫代鳥嘌呤、塞替派(Thiotepa)、長春堿(Vinblastinesulfate)、安吖啶(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、Erthropoietin、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)(HMM)、白細(xì)胞介素(Interleukin)2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG;甲基丙酮醛二-丙咪腙；MGBG)、噴司他丁(Pentostatin)(2'脫氧柯福霉素)、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VM-26)和硫酸長春地辛，但不僅限于此。免疫治療劑可選自3622W94、4B5、ANAAb、抗-FLK-2、抗-VEGF、ATRAGEN,AVASTIN(貝伐單抗(bevacizumab);Genentech)、BABS、BEC2、BEXXAR(托西莫單抗(tositumomab);GlaxoSmithKline)、C225、CAMPATH(阿侖單抗(alemtuzumab);GenzymeCorp.)、CEACIDE、CMA676、EMD-72000、ERBITUX(西妥昔單抗(cetuximab);ImCloneSystems,Inc.)、Gliomab-H、GNI-250、HERCEPTIN(曲妥單抗(trastuzumab);Genentech)、IDEC畫Y2B8、ImmuRAIT-CEA、iorc5、ioregf.r3、iort6、LDP-03、LymphoCide、MDX-ll、MDX畫22、MDX-210、MDX-220、MDX-260、MDX-447、MELIMMUNE-1、MELIMMUNE-2、Monopharm-C、NovoMAb-G2、Oncolym、OV103、Ovarex、Panorex、Pretarget、Quadramet、Ributaxin、RITUXAN(美羅華(rituximab);Genentech)、SMARTID10Ab、SMARTABL364Ab、、SMARTMl95、TNT禾卩ZENAPAX(daclizumab;Roche)，但不僅限于此。癌癥疫苗可選自EGF、抗個(gè)體基因型的癌癥疫苗、Gp75抗原、GMK黑瘤疫苗、MGV神經(jīng)節(jié)苷脂綴合物疫苗、HeR2/neu、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHLtheratope、BLP25(MUC-1)、脂質(zhì)體個(gè)體基因型疫苗、黑素瘤疫苗(Meladne)、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、BCGvacine、TA-HPV、TA隱CIN、DISC-virusandImmuCyst/TheraCys，但不僅限于此。本發(fā)明的組合物和方法可以單獨(dú)使用，或與適用于治療變態(tài)反應(yīng)的其它試劑和方法組合使用。本發(fā)明一方面提供了治療患有變應(yīng)性病癥的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對患有變應(yīng)性病癥的受試者施用有效量的本發(fā)明的組合物以治療受試者。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了治療患有變應(yīng)性病癥的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對患有變應(yīng)性病癥的受試者施用有效量的本發(fā)明的組合物和抗變態(tài)反應(yīng)療法以治療受試者。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中的變應(yīng)性病癥。本發(fā)明一方面提供了適用于治療變應(yīng)性病癥的組合物。根據(jù)該方面的組合物包含本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和變態(tài)反應(yīng)藥劑。"患有變應(yīng)性病癥的受試者"表示目前正在經(jīng)歷或先前曾經(jīng)經(jīng)歷過應(yīng)答于變應(yīng)原的變應(yīng)性反應(yīng)的受試者。"變應(yīng)性病癥"或"變態(tài)反應(yīng)"是指對物質(zhì)(變應(yīng)原)的獲得性超敏感性。變應(yīng)性病癥包括但不限于濕疹、變應(yīng)性鼻炎或鼻炎(coryza)、枯草熱(hayfever)、變應(yīng)性結(jié)膜炎、支氣管哮喘、蕁麻疹(hives)和食物變態(tài)反應(yīng)，其它的特異反應(yīng)性病癥，包括特異性皮炎；過敏癥(anaphylaxis);藥物變態(tài)反應(yīng)和血管性水腫。典型地，變態(tài)反應(yīng)是與針對變應(yīng)原的抗體生產(chǎn)相關(guān)的短暫病癥，所述抗體來自具體的免疫球蛋白種類IgE。由IgE介導(dǎo)的對一般氣源性過敏源應(yīng)答的發(fā)生也是指示趨向于發(fā)生哮喘的誘因的一個(gè)因素。如果變應(yīng)原遭遇嗜堿白細(xì)胞(在血中循環(huán))或肥大細(xì)胞(分散于固體組織各處)表面上與IgEFc受體(FceR)結(jié)合的特異IgE，則細(xì)胞被激活，導(dǎo)致介質(zhì)的生產(chǎn)和釋放，所述介質(zhì)例如組胺、5-羥色胺和脂質(zhì)介質(zhì)。當(dāng)IgE型的組織敏感免疫球蛋白與外源變應(yīng)原反應(yīng)時(shí)，發(fā)生變應(yīng)性反應(yīng)。IgE抗體與肥大細(xì)胞和/或嗜堿白細(xì)胞結(jié)合，然后在受到與抗體分子末端橋接的變應(yīng)原刺激時(shí)，這些專門化的細(xì)胞釋放變應(yīng)性反應(yīng)的化學(xué)介質(zhì)(血管活性胺)。組胺、血小板活化因子、花生四烯酸代謝產(chǎn)物和5-羥色胺是人中變應(yīng)性反應(yīng)的己知的最好介質(zhì)。組胺和其它血管活性胺通常儲存于肥大細(xì)胞和嗜堿性白細(xì)胞中。肥大細(xì)胞分散在動物組織各處，嗜堿白細(xì)胞在維管系統(tǒng)中循環(huán)。這些細(xì)胞制造組胺并將其儲存在細(xì)胞中，除非涉及IgE結(jié)合的專門化序列的事件發(fā)生，引發(fā)其釋放。變應(yīng)性反應(yīng)的癥狀根據(jù)身體中的位置而不同，所述位置是IgE與抗原反應(yīng)的位置。如果反應(yīng)在呼吸上皮上發(fā)生，則癥狀通常是打噴嚏、咳嗽和哮喘反應(yīng)。如果相互作用發(fā)生在消化道中(例如在食物變態(tài)反應(yīng)的情況下)，則常見腹痛和腹瀉。全身性的變應(yīng)性反應(yīng)(例如在蜜蜂叮咬后或?qū)κ茉囌呤┯们嗝顾睾?可以是嚴(yán)重的，并常常是危及生命的。變態(tài)反應(yīng)與Th2型免疫應(yīng)答相關(guān)，其至少部分由Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-5以及抗體同種型轉(zhuǎn)換為IgE表征。Thl和Th2免疫應(yīng)答是互相反調(diào)節(jié)的，從而免疫應(yīng)答朝向Thl型免疫應(yīng)答的偏移可以預(yù)防或改善Th2型的免疫應(yīng)答，包括變態(tài)反應(yīng)。因此，本發(fā)明的免疫剌激性O(shè)RN自身適用于治療患有變應(yīng)性病癥的受試者，因?yàn)槊庖叽碳ば設(shè)RN可以使免疫應(yīng)答偏向Thl型的免疫應(yīng)答?；蛘呋蛄硗猓景l(fā)明的免疫剌激性O(shè)RN可以與變應(yīng)原組合使用以治療患有變應(yīng)性病癥的受試者。本發(fā)明的免疫刺激性組合物也可以與抗變態(tài)反應(yīng)療法組合施用。用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的常規(guī)方法涉及變態(tài)反應(yīng)藥劑或脫敏療法的使用。用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的一些發(fā)展中療法包括中和抗IgE抗體的使用。封閉變應(yīng)性反應(yīng)的化學(xué)介質(zhì)的抗組胺和其它藥物幫助調(diào)節(jié)變應(yīng)性癥狀的嚴(yán)重性，但是不能預(yù)防變應(yīng)性反應(yīng)，并且對隨后的變應(yīng)性應(yīng)答沒有作用。優(yōu)選脫敏療法，所述脫敏療法通過給予(通常通過皮下注射)小劑量變應(yīng)原來誘導(dǎo)針對變應(yīng)原的IgG型應(yīng)答。認(rèn)為IgG的存在幫助中和介質(zhì)的生產(chǎn)，所述介質(zhì)的生產(chǎn)得自IgE抗體的誘導(dǎo)。最初用非常低劑量的變應(yīng)原治療受試者以避免誘導(dǎo)嚴(yán)重的反應(yīng)，將劑量緩慢增加。該類型的療法是危險(xiǎn)的，因?yàn)槭茉囌邔?shí)際上被施用了引起變應(yīng)性應(yīng)答的化合物并能夠?qū)е聡?yán)重的變應(yīng)性反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)藥劑包括但不限于，抗組胺、皮質(zhì)激素和前列腺素誘導(dǎo)物?？菇M胺是抵消肥大細(xì)胞或嗜堿粒細(xì)胞釋放的組胺的化合物。這些化合物是本領(lǐng)域公知的，并通常用于治療變態(tài)反應(yīng)?？菇M胺包括，但不限于阿伐斯汀(acrivastine)、阿司咪唑(astemizole)、阿扎他定(azatadine)、氮卓斯汀(azelastine)、betatastine、溴苯夷卩敏(brompheniramine)、布克力嗪(buclizine)、西替利嗪(cetirizine)、西替利嗪類似物、氯苯那敏(chlorpheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、CS560、賽庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、4衣巴其jfT(ebastine)、亍衣匹其/fff(epinastine)、一一索3^那定(fexofenadine)、HSR609、羥嗪(hydroxyzine)、左卡巴斯汀(levocabastine)、loratidine、甲基東莨菪石咸(methscopolamine)、咪唑其jf汀(mizolastine)、諾阿其j咪唑(norastemizole)、苯茚胺(phenindamine)、異丙嗪(promethazine)、甲氧苯二胺(pyrilamine)、特非那定(terfenadine)禾卩曲尼司特(tranilast)。虔質(zhì)、激表^fel:t壬/AX阻不.田、準(zhǔn)f3"B^mPth、,1nrpdn;c^1nnP、、、滯尼朽、龍(prednisolone)、^發(fā)尼豐公(prednisone)、^f咅氯米松(beclomethasone)、布土也奈《惠(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、氟尼縮松(flunisolide)、氟替卡松丙酸鹽(fluticasonepropionate)和曲安西龍(triamcinolone)。盡管地塞米松是具有抗炎作用的皮質(zhì)類固醇，但是它通常不以吸入的形式用于治療變態(tài)反應(yīng)或哮喘，因?yàn)樗桓叨任詹⑶以谟行┝肯掠虚L期的抑制性副作用。然而，地塞米松可以根據(jù)本發(fā)明被用于治療變態(tài)反應(yīng)或哮喘，因?yàn)榕c本發(fā)明的組合物組合施用時(shí)，其能夠以低劑量使用從而減少副作用。與皮質(zhì)類固醇使用相關(guān)的一些副作用包括咳嗽、發(fā)聲困難、鵝口瘡(念珠菌病)和在更高劑量時(shí)的全身效應(yīng)，例如腎上腺抑制、葡萄糖耐受不良、骨質(zhì)疏松癥、骨無菌性壞死、白內(nèi)障生成、生長抑制、高血壓、肌無力、皮膚變薄(skinthinning)禾口容易擦傷。Barnes&Peterson(1993)AmRevRespirDis148:S1-S26和KamadaAKetal.(1996)AmJRespirCritCareMed153:1739-48。本發(fā)明的組合物和方法可以單獨(dú)使用或與適用于治療哮喘的其它試劑和方法結(jié)合使用。本發(fā)明一方面提供了治療患有哮喘的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對患有哮喘的受試者施用有效量的本發(fā)明組合物以治療受試者的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了治療患有哮喘的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對患有哮喘的受試者施用有效量的本發(fā)明的組合物和抗哮喘療法以治療受試者的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中的哮喘。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了適用于治療哮喘的組合物。根據(jù)該方面的組合物包括本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和哮喘藥劑。本文使用的"哮喘"是指呼吸系統(tǒng)的病癥，其特征在于氣道的炎癥和狹窄，以及氣道對吸入劑的提高的反應(yīng)性。哮喘通常(但不專有地)與特異反應(yīng)性或變應(yīng)性病癥結(jié)合。哮喘的癥狀包括由氣流阻礙引起的喘鳴、氣喘、胸部緊迫和咳嗽的周期性發(fā)作。與哮喘相關(guān)的氣道炎癥可以通過觀察大量生理學(xué)改變被監(jiān)測，例如氣道上皮的剝蝕、基底膜下的膠原沉著、水腫、肥大細(xì)胞活化、炎性細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤。作為氣道炎癥的結(jié)果，哮喘患者常經(jīng)歷氣道高反應(yīng)性、氣道限制、呼吸癥狀和疾病慢性。氣道限制包括極性支氣管收縮、氣道水腫、宮頸粘液塞形成和氣道重建，這些特征常導(dǎo)致支氣管梗阻。在哮喘的一些情況下可發(fā)生半基底膜纖維化(sub-basementmembranefibrosis),導(dǎo)致肺功能永久性異常。過去幾年間的研究顯示哮喘可能是由炎癥細(xì)胞、介質(zhì)和氣道中固有的其它細(xì)胞和組織間的復(fù)雜相互作用引起的。肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和激活的T細(xì)胞均在與哮喘相關(guān)的炎癥過程中起到重要的作用。DjukanovicRetal.(1990)AmRevRespirDis142:434-457。認(rèn)為這些細(xì)胞可以通過分泌預(yù)先形成的和新近合成的介質(zhì)影響氣道功能，所述介質(zhì)可以直接或間接地作用于局部組織。已經(jīng)認(rèn)為T淋巴細(xì)胞(Th2)亞群通過釋放選擇性的細(xì)胞因子和建立疾病慢性在調(diào)節(jié)氣道的變應(yīng)性炎癥中起重要作用。RobinsonDSetal.(1992)NEnglJMed326:298-304。哮喘是一種復(fù)雜的病癥，其在發(fā)育的不同階段發(fā)生，并可以根據(jù)癥狀的程度被分類為急性、亞急性或慢性。急性的炎癥應(yīng)答與細(xì)胞進(jìn)入氣道的早期募集相關(guān)。亞急性炎癥應(yīng)答涉及細(xì)胞的募集以及固有細(xì)胞的激活，這引起更持久的炎癥模式。慢性炎癥應(yīng)答特征在于持久水平的細(xì)胞損傷和進(jìn)行中的修復(fù)過程，其可導(dǎo)致氣道中的永久性異常。"患有哮喘的受試者"是指患有呼吸系統(tǒng)病癥的受試者，所述病癥的特征在于氣道的炎癥和狹窄，以及氣道對吸入劑的提高的反應(yīng)性。與哮喘發(fā)作相關(guān)的因素包括，但不限于變應(yīng)原、冷的溫度、運(yùn)動、病毒感染和so2。如上所述，哮喘可能與Th2型免疫應(yīng)答相關(guān)，其至少部分由Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-5以及抗體同種型轉(zhuǎn)換為IgE表征。Thl和Th2免疫應(yīng)答是互相反調(diào)節(jié)的，從而免疫應(yīng)答朝向Thl型免疫應(yīng)答的偏移可以預(yù)防或改善Th2型的免疫應(yīng)答，包括變態(tài)反應(yīng)。因此，本發(fā)明的經(jīng)修飾的寡核糖核苷酸類似物自身適用于治療患有哮喘的受試者，因?yàn)樗鲱愃莆锬軌蚴姑庖邞?yīng)答偏向Thl型的免疫應(yīng)答?；蛘呋蛄硗?，本發(fā)明的經(jīng)修飾的寡核糖核苷酸類似物可以與變應(yīng)原組合使用以治療患有哮喘的受試者。本發(fā)明的免疫刺激性組合物也可以與哮喘療法組合施用。用于治療或預(yù)防哮喘的常規(guī)方法涉及抗變態(tài)反應(yīng)療法(如上所述)和大量其它試劑(包括吸入劑)的使用。用于治療哮喘的藥物通常被分為兩類，快速釋放藥物和長期控制藥物。哮喘患者在每日的基礎(chǔ)上采用長期控制藥物以達(dá)到和維持長期哮喘的控制。長期控制藥物包括抗炎劑，例如皮質(zhì)激素、克羅默(chromolyn)鈉和奈多羅米(nedocromil);長效支氣管擴(kuò)張劑，例如長效&-激動劑和甲基黃嘌呤；和白細(xì)胞三烯修飾劑?？焖籴尫潘幬锇ǘ绦?52-激動劑、抗膽堿能藥物和全身性皮質(zhì)激素。存在與這些藥物中每種相關(guān)的許多副作用，沒有一種藥物或其組合能夠預(yù)防或完全治療哮喘。哮喘藥物包括，但不限于PDE-4抑制劑、支氣管擴(kuò)張劑//3-2激動劑、K+通道開放劑、VLA-4拮抗劑、神經(jīng)激肽(neurokin)拮抗劑、血栓素(thromboxane)A2(TXA2)合成抑制劑、黃嘌呤、花生四烯酸拮抗劑、5脂肪氧化酶抑制劑、TXA2受體拮抗劑、TXA2拮抗劑、5-lipox活化蛋白質(zhì)的抑制劑和蛋白酶抑制劑。支氣管擴(kuò)張劑//32-激動劑是引起支氣管擴(kuò)張或平滑肌松弛的一類化合物。支氣管擴(kuò)張劑/&-激動劑包括，但不限于沙美特羅(salmeterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、沙丁胺醇(albuterol)、特布他林(terbutaline)、D2522/福莫特羅(formoterol)、非諾特羅(fenoterol)、比托特羅(bitolterol)、吡布特羅甲基黃嘌呤(pirbuerolmethylxanthines)和奧西那林(orciprenaline)。長效/32激動劑和支氣管擴(kuò)張劑是除抗炎療法外用于長期預(yù)防癥狀的化合物。長效&激動劑包括，但不限于沙美特羅和沙丁胺醇。這些化合物通常與皮質(zhì)激素組合使用，并且不在沒有任何炎癥療法時(shí)使用。它們已經(jīng)與超劑量中例如心動過速、骨骼肌震顫、低鉀血和QTc間隔延長的副作用相關(guān)。甲基黃嘌呤(包括例如茶堿)已經(jīng)被用于長期控制和預(yù)防癥狀。這些化合物引起由磷酸二酯酶抑制和可能的腺苷拮抗導(dǎo)致的支氣管擴(kuò)張。劑量相關(guān)的急性毒性是這些類型化合物的具體問題。因此，必需監(jiān)測常規(guī)血清濃度從而計(jì)算毒性并限制代謝清除率個(gè)體差異引起的治療性范圍(therapeuticrange)。副作用包括心動過速、過速心律市場、惡心和嘔吐、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮、頭痛、癲癇發(fā)作、嘔血、高血糖癥和低鉀血。短效/32激動劑包括，但不限于沙丁胺醇(albuterol)、比托特羅(bitolterol)、吡布特羅(pirbuterol)和特布他林(terbutaline)。與短效/32激動劑施用相關(guān)的一些不良作用包括心動過速、骨骼肌震顫、低鉀血、乳酸增加、頭痛和高血糖。克羅默(chromolyn)鈉和奈多羅米被用作長期控制藥物，所述藥物用于預(yù)防由運(yùn)動引起的原發(fā)性哮喘癥狀或由變應(yīng)原引起的變應(yīng)性癥狀。這些化合物被認(rèn)為通過干擾氯化物途徑功能來封閉對變應(yīng)原的早期和晚期反應(yīng)。它們也穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜并抑制介質(zhì)的活化及其從inosineophils和上皮細(xì)胞中的釋放。通常需要四到六周的施用以達(dá)到最大的益處?？鼓憠A能類通常被用于緩解急性支氣管痙攣。這些化合物被認(rèn)為通過競爭性抑制毒蕈堿膽堿能受體來發(fā)揮作用?？鼓憠A能類包括，但不限于異丙托溴銨。這些化合物僅能逆轉(zhuǎn)類膽堿方式(cholinerigically)介導(dǎo)的支氣管痙攣，并不改變對抗原的任何反應(yīng)。副作用包括口干和呼吸分泌(respiratorysecretions)、在一些個(gè)體中增加的喘鳴和如果噴入眼睛時(shí)的視野模糊。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN也可適用于治療氣道重建。氣道重建由氣道中平滑肌細(xì)胞增殖和/或粘膜下層增厚導(dǎo)致，并最終引起氣道狹窄，導(dǎo)致氣流受限。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN可預(yù)防進(jìn)一步重建，并且甚至可能減少重建過程導(dǎo)致的組織構(gòu)建。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN也適用于促進(jìn)樹狀突細(xì)胞的存活、分化、活化和成熟。免疫刺激性的寡核糖核苷酸具有促進(jìn)樹狀突細(xì)胞的細(xì)胞存活、分化、活化和成熟的獨(dú)特能力。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN也提高天然殺傷細(xì)胞溶解活性和抗體依賴性的細(xì)胞毒性(ADCC)。ADCC可以通過與抗體組合使用免疫刺激性O(shè)RN進(jìn)行，所述抗體對細(xì)胞靶標(biāo)如癌細(xì)胞特異。當(dāng)免疫刺激性O(shè)RN與抗體組合施用給受試者時(shí)，受試者的免疫系統(tǒng)被誘導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞。適用于ADCC過程中的抗體包括與細(xì)胞在體內(nèi)相互作用的抗體。對細(xì)胞靶標(biāo)特異的許多這類抗體已經(jīng)在本領(lǐng)域被描述，并且許多可以商業(yè)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體為IgG抗體。在某些方面，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)表位擴(kuò)展的方法。本文使用"表位擴(kuò)展"是指表位特異性從最初集中的、主要的表位特異性免疫應(yīng)答(指向自身或外源蛋白質(zhì))多樣化為所述蛋白質(zhì)(分子內(nèi)擴(kuò)展)或其它蛋白質(zhì)(分子間擴(kuò)展)上的次要的和/或隱藏的表位。表位擴(kuò)展引起多表位特異的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答由初始的放大期(magnificationphase)和后來的下調(diào)期組成，所述放大期可以是有害的(如在自身免疫疾病中)或有益的(如在疫苗接種中)，所述下調(diào)期將免疫系統(tǒng)恢復(fù)為穩(wěn)態(tài)并產(chǎn)生記憶。表位擴(kuò)展可以是這兩個(gè)階段的重要部分。在腫瘤發(fā)生中表位擴(kuò)展的增強(qiáng)允許受試者的免疫系統(tǒng)確定額外的靶表位(其最初不被應(yīng)答于原始治療方案的免疫體系識別)，同時(shí)減少腫瘤種群中逃逸變體的可能性，從而影響疾病的發(fā)展。本發(fā)明的寡核糖核苷酸可適用于促進(jìn)治療上有益的適應(yīng)癥(例如癌癥、病毒和細(xì)菌感染，以及變態(tài)反應(yīng))中的表位擴(kuò)展。所述方法在一個(gè)實(shí)施方案中包括下述步驟對受試者施用包含抗原和佐劑的疫苗，隨后對受試者施用一定用量的至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN，所述用量有效誘導(dǎo)多表位特異的免疫應(yīng)答。該方法在一個(gè)實(shí)施方案中包括下述步驟對受試者施用包含腫瘤抗原和佐劑的疫苗，隨后對受試者施用一定用量的至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN，所述用量有效誘導(dǎo)多表位特異的免疫應(yīng)答。該方法在一個(gè)實(shí)施方案中涉及應(yīng)用一種治療方案，所述治療方案導(dǎo)致受試者中的免疫系統(tǒng)抗原暴露，隨后施用至少兩次本發(fā)明的免疫刺激性寡核糖核苷酸，以誘導(dǎo)多表位特異的免疫應(yīng)答，即促進(jìn)表位擴(kuò)展。在多個(gè)實(shí)施方案中，該治療方案是外科手術(shù)、輻射、化學(xué)療法、其它癌癥藥物、疫苗或癌癥疫苗。除了隨后的免疫刺激療法外，治療方案可以與免疫促進(jìn)劑組合進(jìn)行。例如，當(dāng)治療方案是疫苗時(shí)，其可以與佐劑結(jié)合施用。疫苗和佐劑的組合可以是混合物或獨(dú)立的施用，即注射(即相同的引流區(qū)(drainagefield))。施用不必須是同時(shí)的。如果使用非同時(shí)的注射，則時(shí)間安排可包括先注射佐劑，然后是疫苗配方。完成治療方案后，開始免疫刺激單一療法。最佳的施用頻率、持續(xù)時(shí)間和位點(diǎn)應(yīng)取決于耙標(biāo)和其它因素，但是可例如是在六個(gè)月到兩年的時(shí)間段內(nèi)每月或每兩月的施用。或者，施用可以基于每日、每周或每兩周進(jìn)行，或施用可以是一天、一周或一月內(nèi)多次。在一些情況下，施用的持續(xù)時(shí)間可取決于療法的長度，例如其可以在一周后、一個(gè)月后、一年后或數(shù)年后停止。在其它情況下，單一療法可以是連續(xù)的，如使用靜脈滴注。免疫刺激劑可以被施用給靶標(biāo)常見的引流區(qū)。就療法中的用途而言，不同的劑量對于治療受試者可能是必需的，這取決于化合物的活性、施用途徑、免疫的目的(即預(yù)防性或治療性)、病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性受試者的年齡和體重。給定劑量的施用可以以個(gè)體劑量單位的形式或若干個(gè)小劑量單位的形式通過單一施用完成。以分開數(shù)周或數(shù)月的特異間隔多次施用劑量適用于加強(qiáng)抗原特異性的免疫應(yīng)答。結(jié)合本文提供的教導(dǎo)，通過在多種活性化合物和稱量因子(例如潛能、相對的生物可利用率、患者體重、不良副作用的嚴(yán)重性和施用的優(yōu)選模式)中選擇，可以計(jì)劃有效的預(yù)防性或治療性治療制度，所述治療制度不引起顯著毒性并對于治療具體受試者而言是完全有效的。用于任何具體應(yīng)用的有效量可根據(jù)下述因素而不同，所述因素如治療的疾病或病癥、施用的具體治療劑、受試者的塊頭，或疾病或病癥的嚴(yán)重性。本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員之一可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定具體核酸和/或其它治療劑的有效量而不必需進(jìn)行不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。本文所述的化合物的受試者劑量典型地在從約0.1mg到10,000mg、更典型地從約1mg/到8000mg、最典型地從約10mg至lj100mg的范圍內(nèi)。以受試者體重而言，典型的劑量在從約0.1mg到20mg/kg/天、更典型地從約1到10mg/kg/天、最典型地從約1到5mg/kg/天的范圍內(nèi)。含有核酸和/或其它化合物的藥物組合物可以通過用于施用藥物的任何合適途徑被施用。可以獲得多種施用途徑。當(dāng)然，選擇的具體模式將取決于選擇的一種或多種具體試劑、治療的具體病癥和治療效果所需的劑量。一般而言，本發(fā)明的方法可以施用醫(yī)學(xué)可接受的任何施用模式進(jìn)行，即產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答水平而不引起臨床上不可接受的不良作用的任何模式。優(yōu)選的施用模式在本文討論。對治療中的用途而言，有效量的核酸和/或其它治療劑可以通過任何模式被施用給受試者，所述模式將所述試劑遞送至期望的表面，例如粘膜的、全身性的。施用本發(fā)明的藥物組合物可以通過技術(shù)人員己知的任何途徑完成。施用的途徑包括但不限于口、腸胃外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、舌下、氣管內(nèi)、吸入、皮下、眼、陰道和直腸。就哮喘或變態(tài)反應(yīng)的治療或預(yù)防而言，這類化合物優(yōu)選地被吸入、攝入或通過全身性途徑被施用。全身性途徑包括口服和腸胃外。在一些實(shí)施方案中優(yōu)選吸入的藥物，因?yàn)橹苯舆f送至肺，哮喘患者中原發(fā)的炎癥位點(diǎn)。通常使用若干類型的設(shè)備用于通過吸入施用。這些類型的設(shè)備包括計(jì)量吸入器(MDI)、呼吸開動的MDI、干粉吸入器(DPI)、與MDI組合的間隔/儲藏倉和噴霧器。本發(fā)明的治療劑可以借助于載體被遞送至具體的組織、細(xì)胞類型，或遞送至免疫系統(tǒng)，或二者兼有。"載體"在其最廣泛的含義中是指能夠便于將組合物轉(zhuǎn)移至耙細(xì)胞的任何媒介。載體通常將免疫刺激性核酸、抗體、抗原和/或疾病特異性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞，具有相對于不存在載體時(shí)得到的降解范圍而言減少的降解。通常，適用于本發(fā)明的載體被分為兩類生物學(xué)載體和化學(xué)/物理載體。生物學(xué)載體和化學(xué)/物理載體適用于本發(fā)明的治療劑的遞送和/或攝入。多種生物學(xué)載體被用于遞送核酸，這在屬于免疫剌激性核酸或包含免疫刺激性核酸的治療劑遞送中最為合適。除了本文討論的生物學(xué)載體外，化學(xué)/物理載體可被用于遞送包含免疫刺激性核酸、抗體、抗原和病癥特異性藥劑的治療劑。本文使用"化學(xué)/物理載體"是指除了來自細(xì)菌或病毒來源之外的天然或合成分子，其能夠遞送核酸和/或其它藥物。本發(fā)明優(yōu)選的化學(xué)/物理載體是膠體分散體系。膠體分散體系包括以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的體系，包括水包油乳劑、微團(tuán)、混合的微團(tuán)和脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是適用于體內(nèi)或體外遞送載體的人工膜脈管(vessd)。已經(jīng)顯示尺寸范圍從0.2-4,0mm的大單層囊泡(LUV)可以將大的大分子包膠。RNA、DNA和完整的病毒?？梢员话z在水性內(nèi)部中并以生物活性形式被遞送至細(xì)胞。Fraleyetal.(1981)TrendsBiochemSci6:77?？梢酝ㄟ^將脂質(zhì)體與特異的配體(例如單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白質(zhì))偶聯(lián)將脂質(zhì)體靶向具體的組織?？捎糜趯⒅|(zhì)體靶向免疫細(xì)胞的配體包括但不限于與免疫細(xì)胞特異受體和分子(如抗體)相互作用的完整分子或片段，所述受體和分子與免疫細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物相互作用。這類配體可容易地通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的結(jié)合測定鑒定。還在其它一些實(shí)施方案中，可以通過將脂質(zhì)體與前文討論的免疫治療性抗體之一偶聯(lián)使脂質(zhì)體被靶向癌癥。另外，載體可以與核靶向肽偶聯(lián)，所述核靶向肽會將載體指向宿主細(xì)胞核。用于轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)配方可從QIAGEN以商業(yè)途徑獲得，例如EFFECTENEtm(具有特異的DNA壓縮增強(qiáng)子的非脂質(zhì)體脂質(zhì))和SUPERFECTtm(新穎的作用樹狀聚體技術(shù))。脂質(zhì)體可從GibcoBRL以商業(yè)途徑獲得，例如LIPOFECTINtm和LIPOFECTACE,其由陽離子脂質(zhì)如N-[l-(2,3dioleyloxy)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和二甲基二十八烷基溴化鉸(DDAB)形成。用于制造脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域公知的，并在許多出版物中被描述過。脂質(zhì)體也已經(jīng)由GregoriadisG(1985)TrendsBiotechnol3:235-241綜述。某些陽離子脂質(zhì)(尤其包括N-[l-(2,3二油酰氧)-丙基]-N,N,N-三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP))顯示與本發(fā)明的經(jīng)修飾的寡核糖核苷酸類似物組合時(shí)特別有利。在一個(gè)實(shí)施方案中，媒介是適用于植入或施用至哺乳動物受體的生物相容的微粒或植入物。適用于該方法的示范性生物蝕解植入物描述于PCT國際申請no,PCT/US/03307(公開No.W095/24929,題為"PolymericGeneDeliverySystem")。PCT/US/0307描述了生物相容的、優(yōu)選生物可降解的多聚體基質(zhì)，所述基質(zhì)用于包含處于適當(dāng)啟動子調(diào)控下的外源基因。多聚體基質(zhì)可被用于達(dá)成治療劑在受試者中的持續(xù)釋放。多聚體基質(zhì)優(yōu)選是微粒的形式，例如微球(其中核酸和/或其它治療劑被分散于固體多聚體基質(zhì)各處)或微膠囊(其中核酸和/或其它治療劑被儲存于多聚體殼的核心中)。用于包含治療劑的其它形式的多聚體基質(zhì)包括薄膜、包衣、凝膠、埋植劑和支架。選擇多聚體基質(zhì)設(shè)備的尺寸和組成，使得在所述基質(zhì)被引入的組織中產(chǎn)生良好的釋放動力學(xué)。該根據(jù)待使用的遞送方法選擇多聚體基質(zhì)的尺寸，所述遞送方法典型地是注射進(jìn)組織或通過氣霧劑將懸浮液施用進(jìn)鼻和/或肺區(qū)域。優(yōu)選地，當(dāng)使用氣霧劑途徑時(shí)，多聚體基質(zhì)和核酸和/或其它治療劑包括在表面活性劑媒介中?？梢赃x擇多聚體基質(zhì)組合物，使其既具有良好的降解率，又由生物粘附的材料形成，從而當(dāng)基質(zhì)被施用給持續(xù)損傷的鼻和/或肺表面時(shí)進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)移的有效性。也可以選擇不降解但是通過擴(kuò)散在延長的時(shí)間段中釋放的基質(zhì)組合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)其它治療劑被急性施用時(shí)通過植入物將核酸施用給受試者。適用于遞送(例如口或粘膜遞送)的生物相容的微球公開于Chickeringetal.(1996)BiotechBioeng52:96-101和MathiowitzEetal.(1997)Nature386:410-414和PCT專利申請WO97/03702中。非生物可降解的和生物可降解的多聚體基質(zhì)均可以用于將核酸和/或其它治療劑遞送給受試者。優(yōu)選生物可降解的基質(zhì)。這類多聚體可以是天然的或合成的多聚體。多聚體根據(jù)所期望的釋放時(shí)間段選擇，通常按數(shù)小時(shí)到一年或更久的順序。典型地，范圍在數(shù)小時(shí)和三到十二個(gè)月之間的時(shí)間段上的釋放是最期望的，尤其是對于核酸試劑而言。多聚體任選地是水凝膠(其在水中能夠吸附至多約其重量的99%)的形式，或者任選地與多價(jià)離子或其它多聚體交聯(lián)。人們特別感興趣的生物粘附多聚體包括H.S.Sawhney,C.P.PathakandJ.A,HubellinMacromolecules，(1993)26:581-587描述的生物蝕解水凝膠，該參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)并入本文。這些包括多聚透明質(zhì)酸、酪蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸鹽、殼聚糖、多聚(甲基丙烯酸酸甲酯)、多聚(甲基丙烯酸乙酯)、多聚(甲基丙烯酸丁酯)、多聚(甲基丙烯酸異丁酯)、多聚(甲基丙烯酸己酯)、多聚(甲基丙烯酸異癸酯)、多聚(甲基丙烯酸十二垸基酯)、多聚(甲基丙烯酸苯酯)、多聚(丙烯酸甲酯)、多聚(丙烯酸異丙酯)、多聚(丙烯酸異丁酯)和多聚(丙烯酸十八烷基酯)。如果治療劑是核酸，則也期望使用壓縮劑(compactionagent)。壓縮劑也可以單獨(dú)使用或與生物載體或化學(xué)/物理載體組合使用。本文使用"壓縮劑"是指中和核酸上的負(fù)電荷從而允許核酸壓縮為精細(xì)顆粒的一種試劑，例如組蛋白。核酸的壓縮便于核酸被靶細(xì)胞攝入。壓縮劑可以單獨(dú)使用，即以被細(xì)胞更有效吸收的形式遞送核酸，或更優(yōu)選其與一種或多種上述載體組合使用。可用于促進(jìn)核酸吸收的其它示范性組合物包括磷酸鈣和胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)钠渌瘜W(xué)媒介、微注射組合物、電穿孔和同源重組組合物(例如用于將核酸整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組中預(yù)先選定的位點(diǎn)中)?；衔锟梢詥为?dú)施用(例如在鹽水或緩沖液中)或使用本領(lǐng)域已知的任何遞送媒介施用。例如以下的遞送媒介己經(jīng)被描述螺旋體(Gould-Fogeriteetal.,1994,1996);Emulsomes(Vancottetal.,1998,Lowelletal.，1997);ISCOMs(Mowatetal"1993，Carlssonetal.，1991,Huet.,1998,Moreinetal.，1999);脂質(zhì)體(Childersetal.,1999，Michaleketal.,1989，1992,deHaan1995a,1995b);活細(xì)菌載體(例如Sa/mo"e〃a、」&c/ien'c/'acoZi'、5acZ〃wsCa/附"te-GWn'w、57n'ge〃a、丄acto6a"'〃M51)(Honeetal"1996，Pouwelsetal.,1998，Chatfieldetal.,1993,Stoveretal.，1991,Nugentetal.,1998);活病毒載體(例如牛痘、腺病毒、單純皰疹)(Gallichanetal.,1993,1995，Mossetal.，1996，Nugentetal"1998，F(xiàn)lexneretal.,1988,Morrowetal.，1999);微球(Guptaetal"1998,Jonesetal"1996,Maloyetal"1994,Mooreetal.，1995，O，Haganetal.,1994,Eldridgeetal.,1989);核酸疫苗(Fynanetal.，1993,Kuklinetal.，1997，Sasakietal.，1998，Okadaetal.,1997，Ishiietal"1997);多聚體(例如羧甲基纖維素、殼聚糖)(Hamajimaetal.，1998，Jabbal-Gilletal.，1998);多聚體環(huán)(Wyattetal.,1998);蛋白體(Vancottetal.,1998,Lowelletal.，1988,1996,1997);氟化鈉(Hashietal.,1998);轉(zhuǎn)基因植物(Tacketetal.,1998,Masonetal.,1998,Haqetal.,1995);病毒小體(Glucketal.,1992，Mengiardietal.，1995,Cryzetal.,1998)和病毒樣顆粒(Jiangetal.,1999,Leibletal.,1998)。本發(fā)明的配方在可藥用的溶液中被施用，所述溶液常規(guī)地含有可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、適合的運(yùn)載體、佐劑和任選的其它治療成分。術(shù)語可藥用運(yùn)載體表示適用于施用給人或其它脊椎動物的一種或多種適合的固體或液體填充劑、稀釋劑或包膠物質(zhì)。術(shù)語運(yùn)載體表示天然或合成的有機(jī)或無機(jī)成分，活性成分與之組合以便于應(yīng)用。藥物組合物的成分也能夠以下述方式與本發(fā)明的化合物彼此混合不存在會顯著損傷期望的藥物有效性的相互作用。對于口服施用而言，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域公知的可藥用運(yùn)載體混合來容易地對化合物(即核酸、抗原、抗體和其它治療劑)加以配制。這類運(yùn)載體使得本發(fā)明的化合物能夠被配制為片劑、垸基、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等，用于被待治療的受試者口服攝取。用于口服用途的藥物制劑可以作為固體賦形劑獲得，如果期望的話在添加合適的輔料后任選地研磨得到的混合物并加工混合物顆粒，獲得片劑或錠劑核。合適的賦形劑尤其是填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃芪樹膠(gumtragacanth)、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果期望的話，可以添加崩解劑例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。任選地，口服制劑也可以被配制在鹽水或緩沖液中用于中和內(nèi)部酸條件，或可以不與任何運(yùn)載體一起被施用。錠劑核與合適的包衣一起提供。為了該目的可以使用濃縮的糖溶液，其可任選的含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液(lacquersolution)和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或色素可以被添加至片劑或錠劑包衣中用于鑒定或表征活性化合物劑量的不同組合。可口服使用的藥物制劑包括由明膠制成的push-fit膠囊，以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的軟密封膠囊。push-fit膠囊可以含有與填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂和任選的穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可溶于或懸浮于合適的液體中，例如脂肪油、液體石蠟，或液體聚乙二醇中。另外，可以添加穩(wěn)定劑。也可以使用配制用于口施用的微球。這類微球已經(jīng)是本領(lǐng)域確定的。用于口施用的所有配方應(yīng)當(dāng)是適用于這類施用的劑量。對于含服施用而言，組合物可以采取以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。對于通過吸入施用而言，用于本發(fā)明用途的化合物可以以來自增壓包裝或噴霧器的噴霧劑的形式用合適的推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氯四氟乙垸、二氧化碳或其它合適的氣體)便利地被遞送。在加壓氣霧劑的情況下，單位劑量可以通過提供用于遞送測定量的值來確定。用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(例如明膠)可以被配制為含有化合物和合適粉末基礎(chǔ)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。當(dāng)期望全身性遞送化合物時(shí)，其可以被配制為用于通過注射腸胃外施用，例如通過推注(bolusinjection)或連續(xù)輸注。用于注射的配方可以以單位劑型存在，例如安瓿或帶有添加的防腐劑的多劑量容器中。組合物可以采用例如油性或水性媒介中的懸浮液、溶液或乳劑的形式，并可以含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于腸胃外施用的藥物配方包括水溶性形式的活性化合物的水性溶液。另外，活性化合物的懸浮液可以被制備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂溶劑或媒介包括脂肪油(如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯)或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可含有提高懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選的，懸浮液也可以含有合適的穩(wěn)定劑或提高化合物溶解度的試劑，以允許制備高濃度溶液?；蛘?，活性化合物可以是用于在使用前與合適媒介(例如滅菌無熱原水)組合的粉末形式。組合物也可以被配制在直腸或陰道組合物例如栓劑或灌腸劑中，其例如含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)，如可可脂或其它甘油酯。除了前述配方外，化合物也可以被配制為儲存制劑。這類長效配方可以用合適的多聚體或疏水材料(例如可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂配制，或被配制為微溶衍生物(例如微溶鹽)。藥物組合物也可包含合適的固體或凝膠相運(yùn)載體或賦形劑。這類運(yùn)載體或賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和多聚體如聚乙二醇。合適的液體或固體藥物制劑形式為例如用于吸入的水性或鹽水溶液、被微囊包埋、螺旋包埋(encochleated)、包衣在微金顆粒上、包含在脂質(zhì)體中、被噴灑、氣溶膠、用于植入皮膚的小團(tuán)、或干燥在要擦入皮膚中的尖銳物品上。藥物組合物也包括顆粒、粉末、片劑、包衣的片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿、乳劑、懸浮液、霜、滴劑或延長活性化合物釋放的制劑，所述制劑中如上所述常規(guī)地使用賦形劑和添加劑和/或輔料，例如崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、潤滑劑、調(diào)味劑、甜味劑或增溶劑。藥物組合物適用于多種藥物遞送體系。用于藥物遞送的方法的概括綜述參見LangerR(1990)Science249:1527-1533，其通過參考并入本文。核酸和任選的其它治療劑和/或抗原可以自身(純的)被施用或者以可藥用鹽的形式被施用。當(dāng)用于藥物中時(shí)，鹽應(yīng)當(dāng)是可藥用的，但是可以便利地使用非可藥用鹽以制備其可藥用鹽。這些鹽包括，但不限于從以下酸制備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、p-甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。這類鹽也可以被制備為堿金屬或堿土金屬鹽，例如羧酸基團(tuán)的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。合適的緩沖劑包括乙酸和鹽(1-2%W/V);檸檬酸和鹽(1-3%W/V);硼酸和鹽(0.5-2.5%w/v);和磷酸和鹽(0.8-2%w/v)。合適的防腐劑包括苯扎氯胺(0.003-0.03%w/v);三氯叔丁醇(0.3-0.9%w/v);對羥基苯甲酸酯(O.Ol-0.25%w/v)和柳硫汞(0.004-0.020/。w/v)。組合物可以以單位劑量形式便利地存在，并可通過制藥領(lǐng)域公知的任何方法制備。所有方法都包括使化合物與運(yùn)載體組合的步驟，所述運(yùn)載體組成一種或多種助劑(accessoryingredients)。通暢，通過將化合物均一地和直接地與液體運(yùn)載體、精細(xì)分散的固體運(yùn)載體或這二者組合，如果需要的話隨后使產(chǎn)物成形來制備組合物。液體劑量單位是管或安瓿。固體劑量單位是片劑、膠囊和栓劑。其它遞送系統(tǒng)可包括即時(shí)釋放(time-release)、延遲釋放或延長釋放遞送體系。這類體系可以避免化合物的重復(fù)施用，增進(jìn)對受試者和醫(yī)師的便利。許多類型的遞送體系是可獲得的，并且是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員已知的。它們包括多聚物基礎(chǔ)系統(tǒng)如多聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸內(nèi)酯、聚酯酰胺、多聚正酯、多聚羥基丁酸和多聚酸酐。含有前述多聚體微膠囊的藥物公開于例如U.S.Pat.No.5，075，109中。遞送體系也包括下述非多聚體體系脂質(zhì)，包括甾醇如膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如甘油單、二和三酯；水凝膠釋放體系；硅膠體系；基于肽的體系；蠟包衣；使用常規(guī)粘合劑和賦形劑的壓縮片劑；部分融合的埋植劑等。特異的例子包括，但不限于(a)侵蝕體系(erosionalsystem),其中本發(fā)明的試劑以基質(zhì)中的形式被包含，例如U.S.Pat.Nos.4，452,775、4,675,189和5,736,152中所公開的那些，和(b)不擴(kuò)散體系(diffusionalsystem),其中活性成分以受控的速率從例如U.S.Pat.Nos.3,854,480、5,133,974和5,407,686中所述的多聚體滲透。另外，可以使用基于泵的硬件遞送體系，其中一些適用于植入。以下的實(shí)施例將進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被認(rèn)為用于進(jìn)一步限制。實(shí)施例實(shí)施例1人PMBC對含N-U-R，-R，的寡核糖核苷酸的應(yīng)答性方法Luminex技術(shù)稱作微球的Luminex色彩代碼小珠分為IOO個(gè)不同的組。每個(gè)小珠組可以用對具體生物測定特異的實(shí)際包被，允許從樣品中捕獲并檢測特異的分析物。在Luminex簡便分析儀中，激光激發(fā)鑒定每個(gè)微球顆粒的內(nèi)部染料，并且任何報(bào)告子染料也在該測定期間被捕獲。對每個(gè)小珠組進(jìn)修許多讀數(shù)，進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果。以此種方式，Luminex技術(shù)允許在單個(gè)樣品中快速并精確地復(fù)合多至ioo個(gè)獨(dú)特的測定。從健康的供體中分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，對其進(jìn)行涂布并用多種測試和對照免疫刺激劑刺激16個(gè)小時(shí)。16小時(shí)后收集上清液，然后通過ELISA測定分析。在與DOTAP復(fù)合和完全滴定曲線(7個(gè)濃度)的條件下測試含N-U-RrR2的寡核糖核苷酸，所述曲線從與25嗎/mlDOTAP復(fù)合的2pMORN開始并具有1/3的稀釋度步驟。還包括某些陰性對照，包括單獨(dú)用培養(yǎng)基和單獨(dú)用DOTAP(25mg/ml培養(yǎng)基孔；"脂質(zhì)體")。對照免疫刺激劑包括咪唑喹啉R-848(2pM，1/3稀釋度步驟和7個(gè)濃度)、報(bào)導(dǎo)的TLR7的配體、具有TLR7基序如AU和AUU序列(SEQIDNO:13-SEQIDNO:15)的ORN、具有TLR8基序如CU、GU和GUU序列(SEQIDNO:19-SEQIDNO:23)的ORN。結(jié)果顯示在圖1和3中。使用經(jīng)分離的pDC、單核細(xì)胞和mDC刺激進(jìn)行用于測試不同ORN序列的類似測定。用與10|ug/mlDOTAP、0.5pMCpGODN復(fù)合的0.5jiMORN，或單獨(dú)用DOTAP或培養(yǎng)基刺激細(xì)胞。16小時(shí)后收集上清液并通過ELISA測量IFN-a、TNF-a和IL-12p40。結(jié)果顯示在圖2中。圖1顯示了用含AU序列的SEQIDNO:12和含GU序列的SEQIDNO:21對PBMC刺激時(shí)TNF-a和IFN-a生產(chǎn)之間的清晰差異。其它的序列分析顯示CUA重復(fù)(SEQIDNO:24)是另一誘導(dǎo)TNF-a而不產(chǎn)生IFN-a的ORN。含有AU和GU重復(fù)(SEQIDNO:29-SEQIDNO:34)的較短ORN顯示與較長ORN(SEQIDNO:12-SEQIDNO:23)相比相似的結(jié)果，但是效率和能力降低。圖2和6顯示了在經(jīng)分離的單核細(xì)胞、pDC和mDC上對AU-ORN(SEQIDNO:13)和GU-ORN(SEQIDNO:21)的分析，反映了對AU-ORN(SEQIDNO:13)而言強(qiáng)烈降低的IFN-a生產(chǎn)，和對兩種ORN而言清晰的TNF-a和IL-12p40生產(chǎn)。來自pDC的ORN刺激時(shí)的IFN-a生產(chǎn)似乎是TLR7介導(dǎo)的，而來自經(jīng)分離的單核細(xì)胞和mDC的TNF-a和IL-12p40生產(chǎn)似乎是TLR8介導(dǎo)的。Luminex結(jié)果反映了與ELISA數(shù)據(jù)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，并證明了GU-ORN和AU-ORN之間主要的區(qū)別歸因于IFN-a生產(chǎn)和IFN-a相關(guān)的基因/細(xì)胞因子(圖3和8a)。另外，其它Luminex數(shù)據(jù)顯示與IFN-a和IFN-a相關(guān)的基因/細(xì)胞因子相反，其它細(xì)胞因子/趨化因子不受來自CD123-CD14-細(xì)胞的一個(gè)異常值的影響(圖7和8a-d)。該IL-6生產(chǎn)可能歸因于TLR7介導(dǎo)的B細(xì)胞激活。實(shí)施例2對寡核糖核苷酸的IFN-ce和TNF-a最大活性的比較用與DOATP復(fù)合的ORN來刺激人PBMC。16個(gè)小時(shí)后收集上清液并測量TNF-a和IFN-a水平。測定了3-6個(gè)血供體和兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)在0.6pM處的平均/最大活性。結(jié)果顯示在圖4中。這些數(shù)據(jù)在TLR8和TLR7/8基序間清晰地不同具有基序N-U-R廣R2的ORN顯示在300pg/ml下的IFN-a生產(chǎn)，而TLR7/8ORN顯示在PBMC刺激時(shí)更高的IFN-a生產(chǎn)(圖4a)。TLR8和TLR7/8用紅線分開。相反，TNF-Of水平測量指出具有TLR8的ORN和具有TLR7/8基序的ORN二者均刺激TNF-ce生產(chǎn)。實(shí)施例3對寡核糖核苷酸的IFN-a最大活性與IFN-o;EC50的比較用與DOATP復(fù)合的ORN刺激人PBMC。16個(gè)小時(shí)后收集上清液并測量INF-a水平。測定了3-6個(gè)血供體和兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)在0.6pM處和在完全滴定曲線(范圍2)LiM到0.9nM)的EC50處的平均/最大活性。結(jié)果顯示在圖5中。EC50和最大活性顯示涉及TLR8和TLR7/8基序的可比較的結(jié)果。低EC50/高最大活性表示TLR7/8ORN(圖5a)而高EC50和低最大活性表示TLR80RN(圖5b)。在人PBMC剌激時(shí)對表1所列的ORN序列進(jìn)行IFN-a和TNF-a生產(chǎn)測試。用指定的ORN刺激人PBMC16小時(shí)，收集上清液并通過ELISA測量細(xì)胞因子生產(chǎn)。表2概括了ORN針對IFN-Q!和TNF-a生產(chǎn)的最小/最大活性和EC50。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>+:細(xì)胞因子生產(chǎn)-:無細(xì)胞因子生產(chǎn)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>實(shí)施例4在人PMBC刺激時(shí)，合成的ORN在IFN-a和TNF-o;釋放之間不同用與25嗎/mlDOTAP復(fù)合的lpMORN或單獨(dú)用DOTAP(圖10a)，或指定量的與DOTAP復(fù)合的ORN或單獨(dú)用DOTAP(圖10b-10c)孵育CD123+經(jīng)純化的pDC(圖10a和10b)或經(jīng)分離的單核細(xì)胞(圖10c)。16小時(shí)后收集細(xì)胞并用CD123、CDllc和HLA-DR抗體(圖10a和10b)或CD14和CD19(圖10c)染色。對CD86的FACS分析顯示，富含AU的ORN(SEQIDNO:13)和富含GU的ORN(SEQIDNO:21)在pDC刺激時(shí)在CD86表面標(biāo)記物表達(dá)中顯示差異。用富含AU的ORN(SEQIDNO:13)刺激導(dǎo)致非常少的CD86激活，而用富含GU的ORN(SEQIDNO:21)刺激導(dǎo)致顯著的CD86激活。該激活被確定為是級聯(lián)依賴性的(圖10b)。富含AU的ORN(SEQIDNO:13)和富含GU的ORN(SEQIDNO:21)在人PBMC(數(shù)據(jù)未顯示)禾HCD14-陽性細(xì)胞刺激時(shí)在CD80表面標(biāo)記物表達(dá)中顯示無差異(圖10c)。富含AU的ORN(SEOIDNO:13)和富含GU的ORN(SEOIDNO:21)以齊lJ量依賴的方式刺激特異的人TLR8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)用人TLR3或TLR8表達(dá)質(zhì)粒和NF/cB-螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不應(yīng)答的HEK-293細(xì)胞。用指定的ORN序列(lOpM，與50|LiM/mlDOATP復(fù)合)或?qū)φ沾碳?lO)iMR-848、50pg/mlpolyIC、3,3|iMODN10103或50pg/mlDOTAP)將細(xì)胞孵育16小時(shí)。通過測定螢光素酶活性測量NF/cB-激活。結(jié)果作為高于背景(培養(yǎng)基)的倍數(shù)誘導(dǎo)給出。顯示了6個(gè)獨(dú)立重復(fù)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)(圖9a)。用與DOTAP(50嗎/ml-〉1/3稀釋度)復(fù)合的指定濃度的ORN或單獨(dú)用DOTAP(5(^g/ml->1/3稀釋度)將表達(dá)人TLR8的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞刺激16小時(shí)。通過測定螢光素酶活性測量NF/cB-激活。結(jié)果作為高于背景(培養(yǎng)基)的倍數(shù)誘導(dǎo)給出。顯示了3個(gè)獨(dú)立重復(fù)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)(圖9b)。用人TLR8表達(dá)質(zhì)粒和NF/cB-螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不應(yīng)答的HEK-293細(xì)胞。用指定的ORN序列(15|uM，與75juM/mlDOATP復(fù)合)或?qū)φ沾碳?15|iMR-848或75|ug/mlDOTAP)和用培養(yǎng)基(左)、200nMBafilomycin(Baf.,中)或lmM氯喹(CQ，右)將細(xì)胞孵育16小時(shí)。通過測定螢光素酶活性測量NFkB-激活。結(jié)果作為高于背景(培養(yǎng)基)的倍數(shù)誘導(dǎo)給出。顯示了4個(gè)獨(dú)立重復(fù)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)(圖9c)。將RPMI8226細(xì)胞與1000U/mlIntronA孵育3小時(shí)，用培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用指定濃度的與DOTAP(50嗎/ml->1/3稀釋度)復(fù)合的ORN刺激。通過ELISA測量IP-10的細(xì)胞因子釋放。結(jié)果以pg/ml給出。顯示了3個(gè)獨(dú)立重復(fù)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)(圖9d)。這些數(shù)據(jù)證明SEQIDN0:13和SEQIDN0:21對TLR8的特異性。用高劑量(H.D.，10Atg/ml)和低劑量(L.D.,2.5/^g/ml)的TLR8ORN(SEQIDNO:13)、TLR7/8ORN(SEQIDNO:21)和對照ORN(SEQIDNO:5)(表3)重復(fù)該測定。僅SEQIDNO:21處理導(dǎo)致了顯著的IL-12和TNF-a生產(chǎn)(分別為圖lla和lib)。所有的ORN刺激IFN-7的生產(chǎn)(圖llc)。SEQIDNOORNSEQIDNO:5C*C*G*U*C*U*G*U*U*G*U*G*U*G*A*C*U*CSEQ工DNO:13U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*USEQIDNO:21U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U實(shí)施例6小鼠巨噬細(xì)胞體內(nèi)或體外不對富含AU的ORN(SEOIDNO:13)應(yīng)答Raw264.7細(xì)胞(圖12a)、J774細(xì)胞(圖12b)和經(jīng)純化的CDllc+細(xì)胞(Milteny，磁性小珠標(biāo)記)分離自svl29小鼠脾細(xì)胞(圖12c-12e)并用與DOTAP(50pg/ml并用ORN稀釋)復(fù)合的指定濃度的ORN、單獨(dú)的R-848或DOTAP(50|ig/ml)刺激。16個(gè)小時(shí)(圖12a和12b)或20個(gè)小時(shí)(圖12c-12e)后收集上清液并用于TNF-a(圖12a和12b)、IL-12p40(圖12c)、IFN隱a(圖12d)和IP-10(圖12e)的ELISA。數(shù)據(jù)表示了來自至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)個(gè)體(圖12a和12b)和3只小鼠的均值(圖12c-12e)。為了測量富含AU的ORN體內(nèi)刺激小鼠細(xì)胞的能力，用與DOTAP(60、20或6pg/ml)配制的指定量的ORN注射sv129小鼠(『5/組)并在3小時(shí)后采血。用ELISA在全血中測量IL-12p40(圖12f)、IFN-Q!(圖12g)和IP-10(圖12h)生產(chǎn)。實(shí)施例7經(jīng)純化的大鼠脾細(xì)胞不對富含AU的ORNSEOIDNO:13應(yīng)答將來自3只Sprague-Dawley大鼠的脾細(xì)胞合并并用指定濃度的SEQIDNO:21、SEQIDNO:13(均與62.5嗎/mlDOTAP復(fù)合，1/5稀釋度)、R-848或DOTAP單獨(dú)(62.5嗎/ml->1/5稀釋度)刺激。20小時(shí)后收集上清液并通過ELISA測量TNF-a水平。如圖13中所示，用富含GU的ORNSEQIDNO:21刺激導(dǎo)致TNF-a生產(chǎn)，而用富含AU的ORNSEQIDNO:13生產(chǎn)導(dǎo)致不生產(chǎn)TNF-a。實(shí)施例8嚙齒動物細(xì)胞對富含AU的ORNSEOIDNO:13的失敗應(yīng)答可由物種間的TLR8多態(tài)性導(dǎo)致用富含AU的ORN刺激人和牛細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞因子生產(chǎn)，而刺激小鼠和大鼠細(xì)胞則不導(dǎo)致。進(jìn)行TLR8序列比對和分析。不同脊椎動物(人、猴子、猩猩、犬、牛、豬、小鼠和大鼠)間TLR8的蛋白質(zhì)序列比對顯示結(jié)構(gòu)域1的富含亮氨酸重復(fù)(LRR)3中強(qiáng)烈的差異。盡管人、猩猩和猴子是高度保守的，但是與人相比，大鼠、小鼠和豬被證明在位置106(小鼠)、103(大鼠)或102(豬)刪除4AA，牛被證明具有2AA(105-106)的插入。有趣的是，豬和牛顯示出在相同區(qū)域(位置97)中的另一個(gè)2AA刪除。可能結(jié)構(gòu)域1的富含亮氨酸重復(fù)區(qū)域中的刪除可干擾富含AU的ORN結(jié)合。等同物前述書面說明書被認(rèn)為足夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不受提供的實(shí)施例限制，因?yàn)閷?shí)施例僅旨在單獨(dú)闡述本發(fā)明的一個(gè)方面，其它功能等同的實(shí)施方案都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。除了本文所示和所述的之外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)前文描述將顯而易見本發(fā)明的多種修飾，這些都在附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)不一定被本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案包含。本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和專利出版物都一起整體通過引用并入本文。權(quán)利要求1.一種用于刺激前炎性細(xì)胞因子生產(chǎn)的方法，所述方法包括將表達(dá)TLR8的細(xì)胞與下述用量的包含N-U-R1-R2的RNA寡核糖核苷酸(ORN)體外接觸，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中R1和R2至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，并且其中R不是U，除非N-U-R1-R2含有至少兩個(gè)A，其中所述ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQIDNO89)并且不包含TLR7/8基序，并且其中所述ORN長度為4-100，所述用量能有效刺激前炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，并且使得其中應(yīng)答于ORN的IFN-α生產(chǎn)相對于背景而言不被顯著誘導(dǎo)。2.—種用于刺激前炎性細(xì)胞因子的方法，包括將表達(dá)TLR8的細(xì)胞與下述用量的包含N-U-RpR2的RNA寡核糖核苷酸(ORN)體外接觸，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中Rt和R2至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，其中R不是U，除非N-U-RrR2含有至少兩個(gè)A，其中所述ORN不包含TLR7/8基序并且不與N-[l-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)復(fù)合，并且其中所述ORN長度為4-100，所述用量能有效刺激前炎性細(xì)胞因子生產(chǎn)并且其中應(yīng)答于ORN的IFN-ce生產(chǎn)相對于背景而言不被顯著誘導(dǎo)。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中應(yīng)答于所述ORN的IFN-o;生產(chǎn)少于300pg/ml。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ORN與N-[l-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N，N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)或聚陽離子肽復(fù)合。5.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中N為腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。6.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中N為腺苷或胞嘧啶。7.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中U為尿嘧啶。8.權(quán)利要求l或2所述的方法，其中所述ORN包含至少一個(gè)AU。9.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述ORN包含至少一個(gè)CU。10.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中表達(dá)TLR8的細(xì)胞是單核細(xì)胞或單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞。11.權(quán)利要求l或2所述的方法，其中表達(dá)TLR8的細(xì)胞是mDC。12.權(quán)利要求l或2所述的方法，其中所述ORN含有至少兩個(gè)AU。13.權(quán)利要求l或2所述的方法，其中所述ORN含有至少三個(gè)AU。14.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中N-U-R!-R2含有至少3個(gè)As。15.權(quán)利要求l或2所述的方法，其中N-U-RrR2含有至少2個(gè)Cs。16.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中N-U-R廣R2含有至少一個(gè)G或C。17.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述ORN含有至少一處主鏈修飾。18.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述ORN是單鏈的。19.包含N-U-R,-R2的RNA寡核苷酸(ORN)，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中R,和R2至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，其中R不是U，除非N-U-RrR2含有至少兩個(gè)A，并且其中所述ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQIDNO:89)并且不包含TLR7/8基序，并且其中所述ORN長度為4-100并包含至少一處主鏈修飾。20.權(quán)利要求19所述的ORN，其還包含可藥用的運(yùn)載體。21.權(quán)利要求19所述的ORN，其中所述ORN與N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)復(fù)合。22.權(quán)利要求19所述的ORN，其中所述ORN是單鏈的。23.包含N-U-RrR2的RNA寡核苷酸(ORN)，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中Ri和R2至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，其中R不是U，除非N-U-RrR2含有至少兩個(gè)A，其中所述ORN不包含TLR7/8基序并且不與N-[l-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)復(fù)合，并且，其中所述ORN長度為4-100，并包含至少一處主鏈修飾，并被配制在可藥用的運(yùn)載體中。24.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中N為腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。25.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中N為腺苷或胞嘧啶。26.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中U為尿嘧啶。27.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中ORN包含至少兩個(gè)AU。28.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中ORN包含至少兩個(gè)CU。29.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中N-U-RrR2包含至少3個(gè)Aso30.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中N-U-RrR2包含至少2個(gè)Cs。31.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中N-U-RrR2包含至少一個(gè)G或C。32.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN是單鏈的。33.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN是以下之一U*U*A*G*G*C*A*C(SEQIDNO:2)、A*U*A*G*G*C*A*C(SEQIDNO:4)、G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C(SEQIDNO:11)、A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U(SEQIDNO:12)、U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U(SEQIDNO:13)、A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A(SEQIDNO:16)、A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U(SEQIDNO:17)、A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U(SEQIDNO:18)、C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U(SEQIDNO:24)、U*U*A*U*U*A*U(SEQIDNO:30)或U*A*U*A*U*A*U(SEQIDNO:33)。34.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其還包含噴霧器。35.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其還包含吸入器。36.權(quán)利要求35所述的ORN，其中所述吸入器是計(jì)量吸入器。37.權(quán)利要求35所述的ORN，其中所述吸入器是粉末吸入器。38.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其還包含化學(xué)治療劑。39.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其還包含抗病毒劑。40.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其還包含抗原。41.權(quán)利要求20或23所述的ORN，其中可藥用的運(yùn)載體被配制用于注射。42.權(quán)利要求20或23所述的ORN，其中可藥用的運(yùn)載體被配制用于粘膜施用。43.—種用于治療癌癥的方法，其包括對需要的受試者以有效治療癌癥的量施用權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的ORN。44.權(quán)利要求43所述的方法，其還包括對受試者施用化療。45.權(quán)利要求43所述的方法，其還包括對受試者施用輻射。46.—種用于治療哮喘的方法，其包括對需要的受試者以有效治療哮喘的量施用權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的ORN。47.—種用于治療變態(tài)反應(yīng)的方法，其包括對需要的受試者以有效治療哮喘的量施用權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的ORN。48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述受試者患有變應(yīng)性鼻炎。49.一種用于在受試者中調(diào)控免疫應(yīng)答的方法，其包括對需要的受試者以有效調(diào)控免疫應(yīng)答的量施用權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的ORN。50.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述ORN被遞送給所述受試者以在受試者中治療自身免疫疾病。51.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述ORN被遞送給所述受試者以在受試者中治療氣道重建。52.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述ORN被遞送給所述受試者而不遞送抗原。53.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述ORN以選自以下的途徑被遞送給所述受試者口、鼻、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和經(jīng)皮。54.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述ORN以有效誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)的量被遞送給所述受試者。55.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自TNFa、IL-IO、IL-6、IFN-7、MCP1和IL-12構(gòu)成的組。56.—種用于治療被病毒感染加重的哮喘的方法，包括對需要的受試者以下述用量施用權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的ORN，所述用量有效治療被病毒感染加重的哮喘。57.—種用于傳染病的方法，其包括對需要的受試者以有效治療所述傳染病的量施用權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的ORN。58.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述受試者患有病毒感染。59.權(quán)利要求58所述的方法，其中所述病毒感染為乙型肝炎。60.權(quán)利要求58所述的方法，其中所述病毒感染為丙型肝炎。61.權(quán)利要求58所述的方法，其還包括對受試者施用抗病毒劑。62.權(quán)利要求61所述的方法，其中所述抗病毒劑與ORN連接。63.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述ORN通過選自以下的途徑被遞送口、鼻、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和經(jīng)皮。64.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN基序被非核苷酸接頭與5'核糖核苷酸分隔。65.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN基序被非核苷酸接頭與3'核糖核苷酸分隔。66.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN基序被非核苷酸接頭與5'和3'核糖核苷酸分隔。67.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN被配制在多聚陽離子運(yùn)載體中。68.權(quán)利要求43所述的方法，其還包括對受試者施用免疫刺激性的CpG核酸。69.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸被獨(dú)立地施用。70.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸被配制為綴合物。71.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸被配制為混合物。72.—種用于下調(diào)免疫抑制性CD4+調(diào)節(jié)(Treg)細(xì)胞的方法，所述方法包括將CD4+Treg細(xì)胞與下述用量的下述組合物接觸，所述用量有效降低CD4+Treg細(xì)胞的抑制作用，所述組合物包含權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)所述的ORN。73.權(quán)利要求72所述的方法，其中所述組合物還含有免疫刺激性CpG核酸。74.權(quán)利要求73所述的方法，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸是連接的。75.權(quán)利要求73所述的方法，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸作為綴合物存在。76.權(quán)利要求19-42中任一項(xiàng)的ORN組合物在用于治療癌癥的藥劑制造中的用途。77.權(quán)利要求76所述的用途，其中所述藥劑與化學(xué)療法一起使用。78.權(quán)利要求76所述的用途，其中所述藥劑與輻射一起使用。79.權(quán)利要求19-42中任一項(xiàng)的ORN組合物在用于制造治療哮喘的藥劑中的用途。80.權(quán)利要求19-42中任一項(xiàng)的ORN組合物在用于制造治療變態(tài)反應(yīng)的藥劑中的用途。81.權(quán)利要求80所述的用途，其中所述變態(tài)反應(yīng)是變應(yīng)性鼻炎。82.權(quán)利要求19-42中任一項(xiàng)的ORN組合物在用于制造調(diào)控免疫應(yīng)答的藥劑中的用途。83.權(quán)利要求82所述的用途，其中所述藥劑用于治療自身免疫疾病。84.權(quán)利要求82所述的用途，其中所述藥劑用于治療氣道重建。85.權(quán)利要求82所述的用途，其中所述藥劑用于與抗原一起使用。86.權(quán)利要求82所述的用途，其中所述藥劑用于通過選自以下的途徑使用口、鼻、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和經(jīng)皮。87.權(quán)利要求82所述的用途，其中所述免疫應(yīng)答包含細(xì)胞因子誘導(dǎo)。88.權(quán)利要求87所述的用途，其中所述細(xì)胞因子選自TNFce、IL-IO、IL隱6、IFN-7、MCP1和IL-12。89.權(quán)利要求19-42中任一項(xiàng)的ORN組合物在用于治療被病毒感染加重的哮喘的藥劑制造中的用途。90.權(quán)利要求19-42中任一項(xiàng)的ORN組合物在用于治療傳染病的藥劑制造中的用途。91.權(quán)利要求90所述的用途，其中所述藥劑用于治療病毒感染。92.權(quán)利要求91所述的用途，其中所述病毒感染為乙型肝炎。93.權(quán)利要求91所述的用途，其中所述病毒感染為丙型肝炎。94.權(quán)利要求91所述的用途，其中所述藥劑用于與抗病毒劑一起使用。95.權(quán)利要求94所述的用途，其中所述抗病毒劑與所述ORN連接。96.權(quán)利要求90所述的用途，其中所述藥劑用于通過選自以下的途徑遞送口、鼻、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和經(jīng)皮。97.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN基序被非核苷酸接頭與5'核糖核苷酸分隔。98.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN基序被非核苷酸接頭與3'核糖核苷酸分隔。99.權(quán)利要求19或23所述的ORN，其中所述ORN基序被非核苷酸接頭與5'和3'核糖核苷酸分隔。100.權(quán)利要求76所述的用途，其中所述藥劑用于和免疫刺激性CpG核酸一起使用。101.權(quán)利要求100所述的用途，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸用于獨(dú)立施用。102.權(quán)利要求100所述的用途，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸被配制為綴合物。103.權(quán)利要求100所述的用途，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸被配制為混合物。104.—種用于下調(diào)免疫抑制性CD4+調(diào)節(jié)(Treg)細(xì)胞的方法，所述方法包括將CD4+Treg細(xì)胞與下述用量的下述組合物接觸，所述用量有效降低CD4+Treg細(xì)胞的抑制作用，所述組合物包含權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)所述的ORN。105.權(quán)利要求104所述的方法，其中所述組合物還含有免疫刺激性CpG核酸。106.權(quán)利要求105所述的方法，其中所述ORN和所述免疫刺激性CpG核酸是連接的。107.權(quán)利要求105所述的方法，其中所述ORN和所述免疫剌激性CpG核酸作為綴合物存在。全文摘要本發(fā)明提供了免疫刺激性組合物以及這些化合物在藥物制備以及體外用途中的用途，所述藥物用于治療疾病。本發(fā)明的組合物尤其包括加入了序列依賴性免疫刺激性序列基序的免疫刺激性寡核糖核苷酸。本發(fā)明提供了涉及磷酸聯(lián)接、核苷酸類似物、加合物及其組合的特定修飾。可以任選地含有抗原的本發(fā)明組合物能夠單獨(dú)使用，或與其它治療一起用于刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了適用于治療下述受試者的方法，所述受試者患有感染、癌癥、變應(yīng)性病癥、哮喘、氣道再造或免疫缺陷。本發(fā)明的免疫刺激性寡核糖核苷酸被認(rèn)為能刺激Toll樣受體8(TLR8)。文檔編號A61P31/00GK101331229SQ200680044030公開日2008年12月24日申請日期2006年11月22日優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日發(fā)明者亞歷山大·福斯巴赫,格雷森·B·利浦福德,約爾格·沃爾梅爾申請人:科勒制藥股份公司;科勒制藥集團(tuán)公司