人外周血循環(huán)dna的引物序列及定量檢測試劑盒的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，是一種基于定量核酸擴增的分子生物學方法，特別涉及實時定量多聚酶鏈反應(yīng)（real-timePCR)，通過使用特異性的引物擴增人外周血中循環(huán)DNA的保守基因Alu的不同片段，通過檢測釋放的熒光信號對人外周血中循環(huán)DNA進行定量檢測?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]循環(huán)DNA(circulatingDNA)又稱游離DNA(cell-freeDNA，cf-DNA)是一種存在于動植物和人的體液中的無細胞狀態(tài)的胞外DNA。1977年，Leon等首先發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿DNA含量明顯增高，提出了監(jiān)測外周血游離DNA水平在觀察療效、預(yù)測復發(fā)方面的作用（LeonSA，ShapinoB，SkaaroffDM，etal.FreeDNAintheserumofcancerpatientsandtheeffectoftherapy[J].CancerRes.1977?37(3)：646)〇^SuzukiN?KamatakiA，YamakiJ?etal.CharacterizationofcirculatingDNAinhealthyhumanplasma.ClinChimActa，2008,387(1-2):55-58"研究表明健康人循環(huán)DNA含量極微，約在5ug/L左右。文獻"MulcahyHE，LyauteyJ，LederreyC，etal.AprospectivestudyofK-rasgenemutationintheplasmaofpancreaticcancerpatients[J].ClinCancerRes，1998,4(2):271"、"GeorgG6bel，DorisAuer，IngeGaugg，etal.PrognosticsignificanceofmethylatedRASSF1AandPITX2genesinblood-andbonemarrowplasmaofbreastcancerpatients[J].BreastCancerResTreat，2011，130(8)：109-117"和"ChanSL，ChanAK，HuiEP?etal.QuantitationofcirculatingmethylatedRASSF1AinprognosticationandmonitoringoftreatmentresponseinunresectablehepatocellularcarcinomafHCC).JClinOncOl，2011，29(suppl):abstr4058"記載，當機體處于腫瘤、自身免疫性疾病和炎性反應(yīng)等情況下，體內(nèi)循環(huán)DNA的含量會相應(yīng)的增加，但其產(chǎn)生的機制至今仍不十分明確。目前循環(huán)DNA的血清學檢測還不能直接用于疾病的早期診斷和療效判斷，但它與一些疾病的產(chǎn)生與發(fā)展有著密切的聯(lián)系，因此檢測循環(huán)DNA并對某些已知病種的特異性基因進行確定具有重要的臨床意義，循環(huán)DNA將有可能成為頗具前景的疾病早期診斷和療效判斷的新型分子標志物。[0003]目前，國內(nèi)外應(yīng)用較多的定量檢測方法可分為兩大類：一是以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的擴增方法，如甲基化特異性PCR法（methylationspecificPCR，MSP)和實時焚光定量PCR法（real-timefluorescencequantitativePCR，RTFQ_PCR);二是信號放大技術(shù)檢測方法，如支鏈DNA(branchedDNA，bDNA)檢測技術(shù)。過去幾年中研究循環(huán)DNA濃度的研究者多采用基于定量PCR的分析方法，例如"EllingerLMlillerDaMUllerSC，etal.CirculatingmitochondrialDNAinserum：Auniversaldiagnosticbiomarkerforpatientswithurologicalmalignancies.UrolOncol，2012,30(4):509-515"和"HuangZ，HuaD，HuY，etal.QuantitationofplasmacirculatingDNAusingquantitativePCRforthedetectionofhepatocellularcarcinoma.PatholOncolRes，2012,18(2)：271-276"，高靈敏性的實時PCR方法為僅測量可被特異性擴增的DNA信號提供了條件，可以檢測皮克（pg)級的DNA。當然也有一些改進技術(shù)或聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)可以更加精確地測定循環(huán)DNA的含量，但尚無統(tǒng)一的標準。[0004]隨著分子生物學的飛速發(fā)展，分子檢驗技術(shù)已成為臨床檢驗技術(shù)和病理診斷技術(shù)中最熱門的技術(shù)方法，比如Real-timePCR技術(shù)在乙肝、丙肝和人乳頭瘤病毒（HPV)以及乳腺癌、肺癌中的應(yīng)用，為個體化診治方案提供了堅實的理論基礎(chǔ)。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明利用分子生物學Real-timePCR技術(shù)，基于Alu的可以作為人類DNA片段的特異性標記的基因序列特點（Alu是人類基因組中的一種中等重復序列，長約300bp，大約平均每隔6kb左右就有1個Alu序列，在哺乳動物內(nèi)含量最豐富，同源性最尚，因此其可以作為人類DNA片段的特異性標記），設(shè)計了Alu基因不同長度產(chǎn)物的引物，從中選取特異性高的5對上下游Real-timePCR的引物，采用熒光定量PCR的方法擴增了不同長度的Alu片段，同時建立了Alu的標準品，可以定量檢測不同Alu片段的拷貝數(shù)，從而反映人體循環(huán)DNA的數(shù)量，本方法具有高特異性、高敏感性，能夠建立良好的、統(tǒng)一的分子質(zhì)控標準，能夠彌補不同檢測結(jié)果之間缺乏可比性等缺點，是一個很好的循環(huán)DNA檢測方法。[0006]本發(fā)明的第一個目的是克服現(xiàn)有檢測方法的標準化和質(zhì)控手段不完善等缺點。[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供Alu的保守序列作為檢測人外周血循環(huán)DNA。[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供5對不同長度PCR產(chǎn)物的Alu高特異性引物和Alu標準品。[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供一種簡便的人外周血循環(huán)DNA定量檢測的試劑盒。[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：[0011]一組用于擴增Alu的特異性引物，分別針對Alu保守序列的不同長度片段。5對引物分別是Alul-F(上游）、R(下游），Alu2-F(上游）、R(下游），Alu3-F(上游）、R(下游），Alu4-F(上游）、R(下游），Alu5-F(上游）、R(下游）。提供Alu的基因序列，作為檢測的靶DNA片段，具有高度的保守性，同時提供5對引物的核酸序列。[0012]人外周血循環(huán)DNA的引物序列，為一組用于擴增Alu的特異性引物，分別針對Alu保守序列的不同長度片段；所述的一組包括五對引物分別是：[0013]第一對上游引物Alul-F:5'-agaccatcctggetaacacg_3'，[0014]第一對下游引物Alul-R:5'-agaeggagtetcgetctgtc_3'；[0015]第二對上游引物Alu2_F:5'-etaacaeggtgaaaccccg_3'，[0016]第二對下游引物Alu2_R:5'-egeccaggctggagtg-3'；[0017]第三對上游引物Alu3_F:5'-gtgaaaccccgtetctactaaaaa_3'，[0018]第三對下游引物Alu3_R:5'-gagtgcagtggcgegat_3'；[0019]第四對上游引物Alu4_F:5'-tacaaaaaattageegggcg_3'，[0020]第四對下游引物Alu4-R:5'-gatetcggcteactgcaag-3>;[0021]第五對上游引物Alu5_F:5'-aaaattageegggegtg_3'，[0022]第五對下游引物Alu5_R:5'-gttcacgeeattetcctgc_3'。[0023]-種配套5對引物的標準品，其為含Alu保守基因序列的純化質(zhì)粒，標準品經(jīng)過基因工程技術(shù)將Alu目的基因序列連接到質(zhì)粒上，通過鑒定、擴增、提取和純化獲得，并通過260nm進行吸光度讀取，進行濃度計算分析獲得的DNA準確的拷貝數(shù)目，并通過稀釋制備成不同濃度的標準品。[0024]具體為：[0025]含有Alu基因片段SEQIDNO.13的純化質(zhì)粒；制備過程通過對Alu擴增后獲得目的片段并連接TOC57載體；用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2引物對Alu進行擴增，程序為95°C2min;94°C20sec，55°C30sec，72°C30sec共35個循環(huán)，條件為包含400yMdNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、100mMKCl、4mMMgC12、0.2U/ylTaqDNA聚合酶，通過以上方法獲得Alu目的片段；Alu目的片段和PUC57質(zhì)粒經(jīng)過內(nèi)切酶EcoRI和Hindlll在37°C，2小時以上（AluPCR產(chǎn)物或者PUC57質(zhì)粒10uL、10XRBuffer2uL，EcoRI酶luL，HindIIII酶luL，水6uL)，酶切產(chǎn)物經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化柱純化獲得20uL酶切產(chǎn)物；酶切產(chǎn)物再經(jīng)過T4連接酶22°C反應(yīng)12小時（Alu酶切產(chǎn)物5uL、PUC57質(zhì)粒2uL、T4連接酶luL、10XBufferluL、水luL)，隨后通過標準的基因工程技術(shù)，進行篩選、擴增和純化，并通過對質(zhì)粒進行DNA測序證實Alu已經(jīng)被連接于質(zhì)粒PUC57載體；對純化質(zhì)粒進行260nM的吸光度檢測，計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)。[0026]-種檢測人外周血循環(huán)DNA的試劑盒：[0027]試劑A1-A5:由5對針對Alu不同長度PCR產(chǎn)物的引物組成的5種溶液。A1-A5溶液分別包含5uMAlul-F(上游）、5uMAlul-R(下游），5uMAlu2-F(上游）、5uMAlu2-R(下游），5uMAlu3-F(上游）、5uMAlu3-R(下游），5uMAlu4-F(上游）、5uMAlu4-R(下游），5uMAlu5-F(上游）、5uMAlu5-R(下游）；[0028]其中，[0029]試劑A1:由第一對上游引物Alul-F(5yM)、第一對下游引物Alul-R(5yM)，溶解于水；[0030]試劑A2:由第二對上游引物Alu2-F(5yM)、第二對下游引物Alu2-R(5yM)，溶解于水；[0031]試劑A3:由第三對上游引物Alu3-F(5yM)、第三對下游引物Alu3-R(5yM)，溶解于水；[0032]試劑A4:由第四對上游引物Alu4-F(5yM)、第四對下游引物Alu4-R(5yM)，溶解于水；[0033]試劑A5:由第五對上游引物Alu5-F(5yM)、第五對下游引物Alu5-R(5yM)，溶解于水；[0034]試劑B:2XSYBRGreenqPCRMix，包含包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP的400yMdNTPs、100mMKCl、4mMMgC12、0.2U/y1TaqDNA聚合酶和2XSYBRGreen;[0035]試劑C:R0X(50X)或者ROXII(當前第1頁1 2