0097] 修飾（通常不改變一級結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶（如哺乳動 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。
[0098] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成 熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO: 1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如 本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指具有SEQ ID NO. :9、7、5、3、或1所示的編碼區(qū) 序列有差別的核酸序列。
[0099] 編碼SEQ ID NO. :10、8、6、4、或2的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的 編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附 加編碼序列）以及非編碼序列。
[0100] 術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括 附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0101] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或 非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
[0102] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件（或嚴緊條件）下 與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指：（1)在較低離子 強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如〇. 2X SSC，0. 1 % SDS，60°C;或（2)雜交時加有變性劑， 如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的 相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的 多肽與SEQ ID NO. :10、8、6、4、或2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
[0103] 本發(fā)明多肽的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合 成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱 讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的 cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增， 然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0104] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中得到有關(guān)序列。
[0105] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從 文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法（RACE-cDNA末端快速擴增法），用于PCR的 引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī) 方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
[0106] 載體
[0107] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或多肽編碼序 列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0108] 本發(fā)明中，將編碼本發(fā)明多肽多核苷酸序列插入到重組表達載體中。術(shù)語"重組 表達載體"指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒 如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以 用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
[0109] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明多肽編碼DNA序列和合適的 轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重 組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。 這些啟動子的代表性例子有：大腸桿菌的lac或trp啟動子；A噬菌體PL啟動子；真核啟 動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒 的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達 載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0110] 此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0111] 包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
[0112] 本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選為對糖類具有利用能力并能夠進一步產(chǎn)生乙醇等生物基 發(fā)酵產(chǎn)品的宿主細胞。優(yōu)選包括酵母屬（Saccharomyces)的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、摩納酵母（Saccharomyces monacensis)、貝酵母（Saccharomyces bayanus)、 巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus)、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、 裂殖酵母（Saccharomyces pombe)，克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces sp.)的馬克斯 克魯維酵母（Kluyveromyces marxiamus)、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、 脆壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis)，樹干畢赤酵母（Pichia stipites)、嗜熱 側(cè)抱霉（Sporotrichum thermophile)、休哈塔假絲酵母（Candida shehatae)、熱帶假 絲酵母（Candida tropicalis)、粗糖脈抱菌（Neurospora crassa)、運動發(fā)酵單抱菌 (Zymomonas mobilis)、梭狀芽抱桿菌屬（Clostridium sp.)的梭熱桿菌（Clostridium thermocellum)、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)、丙酮丁醇梭桿菌（Clostridium acetobutylicum)、熱乙酸菌(Moorella thermoacetica)、大腸桿菌(Escherichia col i)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)、厭氧桿菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticu)或枯草桿菌（Bacillus subtilis)
[0113] 本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
[0114] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行?？蛇x用如下 的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0115] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
[0116] 本發(fā)明方法獲得的重組多肽可以在細胞膜上跨膜表達。
[0117] 應(yīng)用
[0118] 利用編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸可以制備一種新的重組菌株，所述的菌株可 以利用原先具有或不具有戊糖或己糖轉(zhuǎn)運能力的出發(fā)菌株，通過導(dǎo)入本發(fā)明載體，賦予出 發(fā)菌株新的或更強的戊糖或己糖轉(zhuǎn)運能力，從而提高碳源的利用率。
[0119] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J. ,Russell,David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0120] 所出現(xiàn)的百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量百分濃度。
[0121] 實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達 到具體公開的目的，不應(yīng)成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的 來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提 示替換使用。
[0122] 所用引物均由金唯智生物科技有限公司合成。
[0123] 本發(fā)明中，葡萄糖，木糖和阿拉伯糖購自sigma試劑公司；
[0124] 間苯腙氯羰氰（CCCP)購自sigma公司；
[0125] 同位素標記的葡萄糖，木糖和阿拉伯糖均購自美國Radiolabeled化工有限公司。
[0126] 實施例1. GLT-1是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，使微生物獲得轉(zhuǎn)運和利用葡萄糖能力
[0127] -、GLT-1基因表達載體的構(gòu)建
[0128] 利用引物 GLT-F(序列：5' -CGCGGATCCATGGGTCTCTTCTCGAAAAAGTC-3'）（SEQ ID NO. :11)和GLT-R(序列：5'-CCGGAAITCCTAAACCTCTCCATGGCTTGAGG-3'）（SEQ ID NO. :12)從 粗糙脈孢菌的cDNA中PCR擴增GLT-1基因的編碼閱讀框，PCR反應(yīng)體系為：5Xphusion HF buffer 10 y L, lOmM dNTPs 1 y L, GLT-F 2. 5 y L, GLT-R 2. 5 y L, cDNA 1 y L, Phusion DNA polymerase0.5yL，水 32.5yL。PCR 反應(yīng)條件為：先 98°C 30s ;然后 98°C 10s，65°C 30s， 72°C 1.5min，35個循環(huán)；最后72°C 10min，4°C lOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用限制性內(nèi)切酶 BamHI和EcoRI將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRS426-PGKl [該質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)參考文獻（Galazka，J. M. , et al., 2010. Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science. 330, 84-86.)]，進行雙酶切，并將兩種雙酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物用限制 性內(nèi)切酶進行酶切鑒定，再進行測序，測序結(jié)果表明GLT-1基因的核苷酸序列如序列表中 序列1所示，表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶GLT-1基因的重組表達質(zhì)粒，命名為 PRS426-GLT,其物理圖譜如圖2。將質(zhì)粒pRS426-GLT和pRS426-PGKl轉(zhuǎn)入釀酒酵母已8丫. VW4000(ffieczorke, R. , et al. , 1999. Concurrent knock-out of at least 20transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 464, 123-128.)中，分別命名為 EGLT 和 E426。
[0129] 二、GLT-1對葡萄糖的轉(zhuǎn)運的測定
[0130] 1、分別挑取EGLT和對照菌株E426單克隆，將其接種在10mL以2%麥芽糖為碳源 的SC-URA培養(yǎng)基（配方：無氨基酵母氮源6. 7g/L，酵母合成缺失培養(yǎng)基補充物1. 4g/L，麥 芽糖20g/L，亮氨酸，組氨酸和色氨酸各20mg/L)中30°C培養(yǎng)過夜（10-12小時）至菌體濃 度為 1. 5-2. 0(0D600);
[0131] 2、離心收集菌體（4000rpm, 5min)后，用冰預(yù)冷 assay buffer (100mM Tris-Citrate buffer pH 5. 0)洗三次，重懸至 0D600 為 20 ;
[0132] 3、將菌體分裝至1.5mL離心管（lOOul/管）中，其中三個用于烘干稱其干重，其余 置于冰上，以備使用。
[0133] 4、反應(yīng)前將菌體于30攝氏度，放置5min。
[0134] 5、100ul細胞懸液加入50ul不同濃度同位素標記的葡萄糖溶液（糖濃度：400mM， 250mM，100mM，50mM，10mM，5mM)，反應(yīng) 120s 后加入 lmL 冰水終止反應(yīng)，
[0135] 6、10000rpm離心lmin來收集細胞，冰水洗滌兩次，離心，去上清。
[0136] 7、用 500mL，0? ImM NaOH重選菌體，轉(zhuǎn)移至裝有3mL Ultima Gold scintillatioin fluid小瓶中，測定其放射量，并計算單位細胞干重單位時間的轉(zhuǎn)運量。
[0137] 最終結(jié)果如圖3所示。釀酒酵母EBY. VW4000缺失17個己糖轉(zhuǎn)運蛋白和3個麥芽 糖/葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，而失去了轉(zhuǎn)運葡萄糖的能力。由于GLT-1的導(dǎo)入，重組酵母EGLT恢 復(fù)了對葡萄糖的轉(zhuǎn)運能力，其中如圖3, GLT對葡萄糖的親和力Km為18.42±3.38mM，最大 轉(zhuǎn)運速率為 30. 75 ± 1. 34mmol/h/gram DCW。
[0138] 三、GLT-1使微生物具有利用葡萄糖的能力
[0139] 1、分別挑取EGLT和對照菌株E426單克隆，將其接種在10mL以2%麥芽糖為碳源 的SC-URA培養(yǎng)基（配方：無氨基酵母氮源6. 7g/L，酵母合成缺失培養(yǎng)基補充物1. 4g/L，麥 芽糖20g/L，亮氨酸，組氨酸和色氨酸各20mg/L)中30°C培養(yǎng)過夜