（10-12小時(shí)）至菌體濃 度為 1. 5-2. 0 ;
[0140] 2、離心收集菌體（4000rpm，5min)后，用冰預(yù)冷雙蒸水洗三次，重懸至0D600為2 ;
[0141] 3、等梯度稀釋菌夜（10°，KT1，1(T 2, 1(T3, 1(T4, 1(T5);
[0142] 4、將等梯度稀釋的酵母點(diǎn)在以2%麥芽糖為碳源的SC-URA平板中（配方：無(wú)氨基 酵母氮源6. 7g/L，酵母合成缺失培養(yǎng)基補(bǔ)充物1. 4g/L，麥芽糖20g/L，亮氨酸，組氨酸和色 氨酸各20mg/L，2%瓊脂），置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0143] 結(jié)果如圖4所示，相比對(duì)照菌株（E426)，重組酵母（EGLT)快速利用葡萄糖的能 力。說(shuō)明GLT-1的導(dǎo)入，釀酒酵母恢復(fù)了以葡萄糖為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的能力。
[0144] 綜合所述，GLT-1對(duì)葡萄糖具有較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力（30. 75± 1. 34mmol/h/gram DCW) 和親和性（Km為18. 42 ±3. 38mM)，并且GLT-1導(dǎo)入釀酒酵母后，可使其恢復(fù)利用葡萄糖為碳 源的能力。
[0145] 實(shí)施例2. XYT-1是木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使微生物獲得轉(zhuǎn)運(yùn)木糖能力
[0146] 一、XYT-1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0147]利用引物 XYT-F(序列：5' -GGACTAGTATGGITCTGGGGAAAAAGTCAATC-3'）（SEQ ID NO. :13)和 XYT-R(序列：5' -CCCAAGCTTCTAAACCCTATGGITAATAACCTT-3'）（SEQ ID NO. :14) 從粗糙脈孢菌的cDNA中PCR擴(kuò)增XYT-1基因的編碼閱讀框，PCR反應(yīng)體系為：5Xphusion HF buffer 10 y L,lOmM dNTPs 1y L, XYT-F 2. 5 y L, XYT-R 2. 5 y L, cDNA 1y L, Phusion DNA polymerase 0? 5 y L，水 32. 5 y L。PCR 反應(yīng)條件為：先 98 °C 30s ;然后 98 °C 10s， 60°C 30s，72°C 1.5min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 10min，4°C 10min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，使用 限制性?xún)?nèi)切酶Spel和Hindlll將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRS426-PGKl [該質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)參考 文獻(xiàn)(Galazka, J. M.,et al.,2010. Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science. 330, 84-86.)]，進(jìn)行雙酶切，并將兩種雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連 接，將連接產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明XYT-1基因的核 苷酸序列如序列表中序列3所示，表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶XYT-1基因的重 組表達(dá)質(zhì)粒，命名為PRS426-XYT。將質(zhì)粒pRS426-XYT和pRS426-PGKl轉(zhuǎn)入釀酒酵母已8丫. VW4000(ffieczorke, R.,et al.,1999. Concurrent knock-out of at least20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett.464, 123-128.)中，分別命名為 EXYT 和 E426。
[0148] 二、XYT-1對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定
[0149] XYT-1對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力的測(cè)定參見(jiàn)實(shí)施例1，其結(jié)果如圖5所示。由于XYT-1的 導(dǎo)入，重組酵母EXYT具有木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，XYT-1對(duì)木糖的親和力Km為7. 58±0. 60mM，最 大轉(zhuǎn)運(yùn)速率為 49. 61 ± 1. 20 y mol/h/gram DCW。
[0150] 實(shí)施例3. XAT-1是木糖和阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使微生物獲得轉(zhuǎn)運(yùn)木糖和阿拉伯糖 能力
[0151] 一、XAT-1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0152] 利用引物 XAT-F(序列：5' -CGCGGATCCATGAAGCCAITTCTGGGGCTC-3'）（SEQ ID NO. :15)和 XAT-R(序列：5' -CCCAAGCTTCTACGACTCCCGATTACCTCCAT-3'）（SEQ ID NO. :16) 從粗糙脈孢菌的cDNA中PCR擴(kuò)增XAT-1基因的編碼閱讀框，PCR反應(yīng)體系為：5Xphusion HF buffer 10 y L,lOmM dNTPs 1 y L, XAT-F 2.5 y L, XAT-R2. 5 y L, cDNA 1y L, Phusion DNA polymerase 0? 5 y L，水 32. 5 y L。PCR 反應(yīng)條件為：先 98 °C 30s ;然后 98 °C 10s， 65°C 30s，72°C 1.5min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 10min，4°C lOmin。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，使用 限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和Hindlll將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRS426-PGKl [該質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)參考 文獻(xiàn)(Galazka, J. M. , et al. , 2010. Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science. 330, 84-86.)]，進(jìn)行雙酶切，并將兩種雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連 接，將連接產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明XAT-1基因的核 苷酸序列如序列表中序列5所示，表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶XAT-1基因的重 組表達(dá)質(zhì)粒，命名為PRS426-XAT。將質(zhì)粒pRS426-XAT和pRS426-PGKl轉(zhuǎn)入釀酒酵母已8丫. VW4000(ffieczorke, R. , et al. , 1999. Concurrent knock-out of at least20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett.464, 123-128.)中，分別命名為 EXAT 和 E426。
[0153] 二、XAT-1對(duì)木糖和阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定
[0154] XAT-1對(duì)木糖和阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力的測(cè)定參見(jiàn)實(shí)施例1，其結(jié)果如圖6所示。由 于XAT-1的導(dǎo)入，重組酵母EXAT具有木糖和阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，其中，XAT-1對(duì)木糖的 親和力1(111為18.17±3.231111，最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率為54.11±3.83 11111〇1/11/^四111〇(^(圖6八）； XAT-1對(duì)阿拉伯糖的親和力Km為61. 93±17. 68mM，大轉(zhuǎn)運(yùn)速率為65. 84±11. 76ymol/h/ gram DCW (圖 6B)。
[0155] 實(shí)施例4. LAT-1是阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使微生物獲得轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力
[0156] 一、LAT-1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0157]利用引物 ELAT-F(序列：5' -CGCGGATCCATGGGGCTCGGGCTTAAGCTAC-3'）（SEQ ID NO. :17)和 ELAT-R(序列：5' -CGGAATTCCTAAACCTTCTCATGCTCATGCAC-3'）（SEQ ID NO. :18) 從粗糙脈孢菌的cDNA中PCR擴(kuò)增LAT-1基因的編碼閱讀框，PCR反應(yīng)體系為：5Xphusion HF buffer 10 y L, 10mM dNTPs 1 y L, ELAT-F 2. 5 y L, ELAT-R 2. 5 y L, cDNA lyL,Phusion DNA polymerase 0? 5 y L，水 32. 5 y L。PCR 反應(yīng)條件為：先 98 °C 30s ;然后 98 °C 10s， 65°C 30s，72°C 1.5min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 10min，4°C 10min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，使用 限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和Hindlll將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRS426-PGKl [該質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)參考 文獻(xiàn)(Galazka, J. M. , et al. , 2010. Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science. 330, 84-86.)]，進(jìn)行雙酶切，并將兩種雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連 接，將連接產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明LAT-1基因的核 苷酸序列如序列表中序列7所示，表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶LAT-1基因的重 組表達(dá)質(zhì)粒，命名為PRS426-LAT。將質(zhì)粒pRS426-LAT和pRS426-PGKl轉(zhuǎn)入釀酒酵母已8丫. VW4000(ffieczorke, R. , et al. , 1999. Concurrent knock-out of at least20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 464, 123-128.)中，分別命名為 ELAT 和 E426。
[0158] 二、LAT-1對(duì)阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定
[0159] LAT-1對(duì)木糖和阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力的測(cè)定參見(jiàn)實(shí)施例1，其結(jié)果如圖7所示。由 于LAT-1的導(dǎo)入，重組酵母ELAT具有阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，LAT-1對(duì)阿拉伯糖的親和力Km 為 25. 12±2. 98mM，最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率為 116. 7±4. 06mmol/h/gram DCW。
[0160] 三、LAT-1轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型的測(cè)定
[0161] 真菌中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要是Uniporter和Symporter/H+類(lèi)型，Uniporter，依靠底 物濃度梯度驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要起著協(xié)助運(yùn)輸?shù)淖饔?。Symporter/H+，向同一個(gè)方向同 時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)糖類(lèi)及H+，并以H+的電化學(xué)梯度作為推動(dòng)力。為了鑒定LAT-1的轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型設(shè)計(jì)了如 下實(shí)驗(yàn)：
[0162] 其中，CCCP(間苯腙氯羰氰）具有破壞細(xì)胞質(zhì)子梯度的作用，因此不同CCCP濃度 下，測(cè)定LAT-1對(duì)阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而鑒定LAT-1的轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型。
[0163] 1、挑取ELAT單克隆，將其接種在10mL以2%麥芽糖為碳源的SC-URA培養(yǎng)基（配 方：無(wú)氨基酵母氮源6. 7g/L，酵母合成缺失培養(yǎng)基補(bǔ)充物1. 4g/L，麥芽糖20g/L，亮氨酸，組 氨酸和色氨酸各20mg/L)中30°C培養(yǎng)過(guò)夜（10-12小時(shí)）至菌體濃度為1. 5-2. 0(0D600);
[0164] 2、離心收集菌體（4000rpm, 5min)后，用冰預(yù)冷 assay buffer (100mM Tris-Citrate buffer pH 5. 0)洗三次，重懸至 0D600 為 20 ;
[0165] 3、將菌體分裝至1.5mL離心管（100ul/管）中，每管50yL，其中三個(gè)用于烘干稱(chēng) 其干重，其余置于冰上，以備使用。
[0166] 4、反應(yīng)前加入1 yL不同濃度的CCCP(終濃度分別為：0yM，0. 5yM，1.0yM， 25 1^，5〇1^)，于30°〇培養(yǎng)箱中，放置1〇1^11。
[0167] 5、50ul細(xì)胞懸液加入50ul 50mM同位素標(biāo)記的阿拉伯糖溶液，于30°C下反應(yīng)120s 后，加入lmL冰水終止反應(yīng)，
[0168] 6、10000rpm離心lmin來(lái)收集細(xì)胞，冰水洗滌兩次，離心，去上清。
[0169] 7、用 500mL0?ImM NaOH重選菌體，轉(zhuǎn)移至裝有3mL Ultima Gold scintillatioin fluid小瓶中，測(cè)定其放射量，并計(jì)算其單位干重單位時(shí)間的轉(zhuǎn)運(yùn)量。
[0170] 其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，隨著CCCP濃度的增高，ELAT對(duì)阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力逐漸 下降，說(shuō)明LAT-1的轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型為Symp 〇rter/H+，當(dāng)CCCP濃度分別25 y M時(shí)，其對(duì)阿拉伯糖的 轉(zhuǎn)運(yùn)速率降到了最低，此時(shí)LAT-1依靠細(xì)胞內(nèi)外的阿拉伯糖濃度梯度為動(dòng)力，轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯 糖。有實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型為Symporter/H+時(shí)，會(huì)有較大的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，具有更 好的應(yīng)用前景。
[0171] 實(shí)施例5. MtLAT-1是阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使微生物獲得轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖能力
[0172] -、MtLAT-1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0173]利用引物 MtLAT-F(序列：5'-CGCGGATCCATGAAGCTGCCCACGAITTAC-3'）（SEQ ID NO. :19)和 MtLAT-R(序列：5' -CCGGAAITCTTAAACCTTCTCCTGCTCGCC-3'）（SEQ ID NO. : 20)從嗜熱毀絲霉的cDNA中PCR擴(kuò)增MtLAT-1基因的編碼閱讀框，PCR反應(yīng)體系為： 5Xphusion HF buffer 10 y L, 10mM dNTPs 1 y L, MtLAT-F 2. 5 y L, MtLAT-R 2. 5 y L, cDNA lyL，Phusion DNA polymerase 0.5 yL，水 32.5 yL。PCR 反應(yīng)條件為：先 98°C 30s;然后 98°C 10s，67°C30s，72°C 1. 5min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 10min，4°C lOmiruPCR反應(yīng)結(jié)束后，使 用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和EcoRI將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRS426-PGKl [該質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)參考文獻(xiàn) (Galazka, J. M. , et al. , 2010. Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science. 330, 84-86.)]，進(jìn)行雙酶切，并將這兩種雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連 接產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明MtLAT-1基因的核苷酸 序列如序列表中序列9所示，表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶MtLAT-1基因的重組 表達(dá)質(zhì)粒，命名為pRS426-MtLAT。將質(zhì)粒pRS426-MtLAT和pRS426-PGKl轉(zhuǎn)入釀酒酵母EBY. V