23特異性引物一起進(jìn)行第二輪PCR。該P(yáng)CR方法得到了 1271&口的〇0嫩片段$吧0(5￡0 10勵(lì)：15))，該片段與？吧3片段（5￡0 10勵(lì):9)有192匕口 完全重疊，并且含有含終止密碼子的3'末端和相應(yīng)cDNA的3'非編碼序列。
[0197] 為了擴(kuò)增cDNA的5'末端，設(shè)計(jì)了對(duì)FN23(SEQ ID N0:9)有特異性的反義寡核 苷酸：FN23-R1 (SEQ ID N0:16)、FN23-R2 (SEQ ID N0:17)、FN23-R3 (SEQ ID N0:18)。根據(jù) Marathon?cDNA擴(kuò)增試劑盒方案（Clontech, Mountain View, CA)，使用快樂(lè)鼠尾草cDNA文 庫(kù)將這些引物用于5'RACE。熱循環(huán)條件如下：94°C下1分鐘，94°C下30秒和72°C下4分鐘 共5個(gè)循環(huán)，94 °C下30秒和70 °C下4分鐘共5個(gè)循環(huán)，94 °C下30秒和68 °C下4分鐘共20個(gè) 循環(huán)。該5'狀0￡得到了144%?的〇0嫩片段$財(cái)0(5￡0 10勵(lì)：19)，該片段與？吧3(5￡0 10 勵(lì):9)有227匕口完全重疊。與已知二萜合酶序列的比較顯示出^財(cái)0片段（5￡〇10勵(lì):19)含 有翻譯起始密碼子和87bp的非編碼區(qū)。三條cDNA片段（FN23、FN30和FN40(SEQ ID N0:9、 SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 19)的拼接得到了 2655bp的全長(zhǎng)cDNA序列（SaTpsl)，其帶有 編碼具有785個(gè)殘基的蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:21)的2355bp(SEQ ID N0:20)的開(kāi)放閱讀框， 所述蛋白質(zhì)與二萜合酶即與焦磷酸柯巴酯合酶有很強(qiáng)的同源性。參與由質(zhì)子化引發(fā)的環(huán)化 反應(yīng)的DxDD基序存在于氨基酸序列（第372位），而未發(fā)現(xiàn)參與由離子化引發(fā)的環(huán)化反應(yīng) 的DDxD基序。因此，該蛋白質(zhì)序列具有專(zhuān)門(mén)催化依賴(lài)于質(zhì)子化的GGPP的環(huán)化反應(yīng)的II類(lèi) 二萜合酶的典型特征。該蛋白質(zhì)的異源表達(dá)以及酶鑒定詳見(jiàn)后面的實(shí)施例2~4。
[0198] 實(shí)施例2
[0199] 怏樂(lè)鼠尾草LPP合酶在大腸桿菌中的異源表汰
[0200] 使用為在17啟動(dòng)子的控制下表達(dá)而設(shè)計(jì)的pETDuet-1 (Novagen, Madison, WI)以 在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。為構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，使用為在緊鄰起始密碼子之前引入Ndel位點(diǎn)并 在終止密碼子之后引入KpnI位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物SaTps-Nde (SEQ ID N0:22) 和 SaTps-Kpn (SEQ ID NO: 23)，通過(guò) PCR 從 cDNA 文庫(kù)中擴(kuò)增出 SaTpsl (SEQ ID NO: 20)的 開(kāi)放閱讀框。由于該閱讀框在該閱讀框的1614位置處含有Ndel位點(diǎn)，本次擴(kuò)增通過(guò)重疊 延伸PCR(Horton等的Gene 77,61-68, 1989)分兩步操作，其中使用引物SaTps-Nde(SEQ ID NO:22)和 SaTps-Kpn(SEQ ID NO:23)連同引物 Satps-mutlf(SEQ ID NO:24)和 Satps-mutlr (SEQ ID NO: 25)，它們?cè)O(shè)計(jì)用來(lái)移除Ndel位點(diǎn)而不改變氨基酸序列。所得cDNA 首先用T0P0 TA克隆試劑盒（Invitrogen，Carlsbad, CA)連接到PCR2. 1-Topo質(zhì)粒中，在將 Ndel-Kpnl片段亞克隆到pETDuet-1載體之前對(duì)插入物的序列進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0201] 使用SaTpsl特異性引物從cDNA文庫(kù)擴(kuò)增所得幾條克隆的序列分析顯示出在cDNA 序列中幾個(gè)位置處具有一些變異性。鑒定了七個(gè)位置，其中可發(fā)現(xiàn)兩種不同的氨基酸。所 發(fā)現(xiàn)的一個(gè)位置為在某些克隆中出現(xiàn)的絲氨酸殘基的插入。這些位置列于下表：
[0202]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，包括： (a) 將GGPP與至少一條具有LPP合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列； (b) 將步驟（a)中生產(chǎn)的LPP與至少一條具有香紫蘇醇合酶活性的多肽接觸，該多肽包 含與SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列；并且 (c) 非強(qiáng)制性選擇地將步驟（b)中生產(chǎn)的香紫蘇醇分離。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述具有LPP合酶活性的多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少60%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90 %同一性的氨基酸序 列，并且其中所述具有香紫蘇醇合酶活性的多肽包含與SEQ ID N0:3有至少60%，優(yōu)選至少 70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %同一性的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述具有LPP合酶活性的多肽包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2,并且其中所述具有香紫蘇醇合酶活性的多肽包含SEQ ID N0:3。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述具有LPP合酶活性的多肽由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2組成，并且其中所述具有香紫蘇醇合酶活性的多肽由SEQ ID NO:3組成。
5. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中通過(guò)將GGPP與所述至少一條具有LPP合酶活性的 多肽和所述至少一條具有香紫蘇醇合酶活性的多肽一起接觸來(lái)同時(shí)進(jìn)行步驟（a)和步驟 (b) 〇
6. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（a)和步驟（b)通過(guò)將GGPP與至少一條融合多肽接 觸而同時(shí)進(jìn)行，所述融合多肽能催化GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化，并包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列以及與SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸 序列。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述融合多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2有至少 60 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %同一性的氨基酸序列和/或與SEQ ID NO: 3有至少60%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%同一性的氨基酸序列。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3〇
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述融合多肽由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2以及SEQ ID NO:3組成。
10. 權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)的方法，其中步驟（a)和步驟（b)同時(shí)進(jìn)行，并包括在有 助于香紫蘇醇生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)非人宿主生物體或細(xì)胞，該非人宿主生物體或細(xì)胞能生產(chǎn) GGPP，并且經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的至少一條具有LPP合酶活性的多肽 以及前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的至少一條具有香紫蘇醇合酶活性的多肽。
11. 權(quán)利要求10的方法，還包括：在步驟（a)和步驟（b)之前，用編碼所述具有LPP合 酶活性的多肽的至少一種核酸以及編碼所述具有香紫蘇醇合酶活性的多肽的至少一種核 酸來(lái)轉(zhuǎn)化能生產(chǎn)GGPP的非人宿主生物體或細(xì)胞，從而所述生物體表達(dá)所述多肽。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中該編碼具有LPP合酶活性的多肽的核酸包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或它們的補(bǔ)體有至少60%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少 90%同一性的核苷酸序列，并且/或者其中該編碼具有香紫蘇醇合酶活性的多肽的核酸包 含與SEQ ID NO: 6或其補(bǔ)體有至少60%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90% 同一,性的核苷酸序列。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述編碼具有LPP合酶活性的多肽的核酸包含SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它們的補(bǔ)體，并且/或者其中所述編碼具有香紫蘇醇合酶活性的多肽 的核酸包含SEQ ID N0:6或其補(bǔ)體。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述編碼具有LPP合酶活性的多肽的核酸由SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它們的補(bǔ)體組成，并且/或者其中所述編碼具有香紫蘇醇合酶活性的 多肽的核酸由SEQ ID NO:6或其補(bǔ)體組成。
15. 權(quán)利要求10或11的方法，其中所述非人宿主生物體或細(xì)胞用至少一種編碼融合多 肽的核酸轉(zhuǎn)化，從而所述生物體表達(dá)所述多肽，所述融合多肽能催化GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn) 化，并包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列以及與SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中用于轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細(xì)胞的核酸包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或它們的補(bǔ)體有至少60%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少 90%同一性的核苷酸序列以及與SEQ ID NO: 6或其補(bǔ)體有至少60%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選 至少80%，更優(yōu)選至少90%同一,性的核苷酸序列。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述核酸包含SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它們的補(bǔ)體 以及SEQ ID NO:6或其補(bǔ)體。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸由SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它們的補(bǔ)體以 及SEQ ID NO:6或其補(bǔ)體組成。
19. 權(quán)利要求10~18中任一項(xiàng)的方法，其中所述非人宿主生物體是植物、原核生物或 真菌。
20. 權(quán)利要求10~18中任一項(xiàng)的方法，其中所述非人宿主生物體是微生物。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述微生物是細(xì)菌或酵母。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌（E. coli)，所述酵母是釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)〇
23. 權(quán)利要求10~18中任一項(xiàng)的方法，其中所述非人宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
24. -種融合多肽，其能催化GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化，并包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列以及與SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序 列。
25. 權(quán)利要求24的融合多肽，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2有至少60%，優(yōu) 選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%同一性的氨基酸序列和/或與SEQ ID NO: 3 有至少60 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %同一性的氨基酸序列。
26. 權(quán)利要求25的融合多肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。
27. 權(quán)利要求26的融合多肽，其由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3組 成。
28. -種核酸，其編碼權(quán)利要求24~27中任一項(xiàng)的融合多肽。
29. 權(quán)利要求28的核酸，其包含與SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它們的補(bǔ)體有至少 50 %，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %同一性的核苷酸序 列，并包含與SEQ ID NO: 6或其補(bǔ)體有至少50 %，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少 80%，更優(yōu)選至少90%同一,性的核苷酸序列。
30. 權(quán)利要求29的核酸，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它們的補(bǔ)體和/或SEQ ID N0:6或其補(bǔ)體。
31. 權(quán)利要求30的核酸，其由SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它們的補(bǔ)體以及SEQ ID NO:6或其補(bǔ)體組成。
32. -種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求28~31中任一項(xiàng)的核酸。
33. 權(quán)利要求32的表達(dá)載體，其形式為病毒載體、噬菌體或質(zhì)粒。
34. 權(quán)利要求32或33的表達(dá)載體，其包括本發(fā)明的核酸，該核酸可操作地連接至至 少一條控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、起始或終止的調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操作子或增強(qiáng)子，或mRNA 核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并非強(qiáng)制性選擇地包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。
35. -種非人宿主生物體或細(xì)胞，其經(jīng)轉(zhuǎn)化以包藏至少一種編碼具有LPP合酶活性并 包含與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸以及至 少一種編碼具有香紫蘇醇合酶活性并包含與SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列 的多肽的核酸，從而異源表達(dá)或過(guò)表達(dá)所述多肽。
36. 權(quán)利要求35的非人宿主生物體或細(xì)胞，其經(jīng)轉(zhuǎn)化以包藏至少一種編碼融合多肽的 核酸，所述融合多肽能催化GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化，并包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2 有至少50%同一性并具有LPP合酶活性的多肽的氨基酸序列以及與SEQ ID NO: 3有至少 50%同一性并具有香紫蘇醇合酶活性的多肽的氨基酸序列。
37. 權(quán)利要求35或36的非人宿主生物體，其中所述非人宿主生物體是植物、原核生物 或真菌。
38. 權(quán)利要求35或36的非人宿主生物體，其中所述非人宿主生物體是微生物。
39. 權(quán)利要求38的非人宿主生物體，其中所述微生物是細(xì)菌或酵母。
40. 權(quán)利要求39的非人宿主生物體，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌，所述酵母是釀酒酵母。
41. 權(quán)利要求35或36的高等真核細(xì)胞，其中所述高等真核細(xì)胞是植物細(xì)胞。
42. -種生產(chǎn)能催化GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化的至少一條融合多肽的方法，包括： (a) 培養(yǎng)用權(quán)利要求32~34中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的非人宿主生物體或細(xì)胞，從而 使其包藏權(quán)利要求28~31中任一項(xiàng)的核酸并表達(dá)或過(guò)表達(dá)由所述核酸編碼并能催化GGPP 至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化的多肽； (b) 將該能催化GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化的多肽從步驟（a)中培養(yǎng)的非人宿主生物體或 細(xì)胞中分離。
43. 權(quán)利要求42的方法，還包括：在步驟（a)之前，用權(quán)利要求32~34中任一項(xiàng)的表 達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細(xì)胞，從而使其包藏權(quán)利要求28~31中任一項(xiàng)的核酸并 表達(dá)或過(guò)表達(dá)由所述核酸編碼的多肽。
44. 一種制備能催化GGPP至香紫蘇醇的轉(zhuǎn)化的變體融合多肽的方法，包括步驟： (a) 選擇權(quán)利要求28~31中任一項(xiàng)的核酸； (b) 修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸； (c) 用該突變核酸序列來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或單細(xì)胞生物體以表達(dá)由該突變核酸序列編碼 的多肽； (d) 對(duì)該多肽進(jìn)行至少一種修飾特性的篩選；并且 (e) 非強(qiáng)制性選擇地，如果該多肽不具備想要的變體活性，則重復(fù)步驟（a)至（d)直至 獲得具有所需變體香紫蘇醇合酶活性的多肽； (f) 非強(qiáng)制性選擇地，如果在步驟（d)中鑒別出具有所需變體活性的多肽，則分離在步 驟（c)中獲得的相應(yīng)突變核酸。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，所述方法包括(a)使一條具有LPP合酶活性的特定多肽與GGPP接觸，以及(b)使一條具有香紫蘇醇合酶活性的多肽與步驟(a)中生產(chǎn)的焦磷酸賴(lài)百當(dāng)烯二醇酯(LPP)接觸。具體而言，所述方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行以生產(chǎn)香紫蘇醇，這是一種在香料和調(diào)味料領(lǐng)域非常有用的化合物。本發(fā)明還提供在該方法中使用的多肽的氨基酸序列。源自快樂(lè)鼠尾草并編碼本發(fā)明多肽的核酸，含所述核酸的表達(dá)載體，以及經(jīng)轉(zhuǎn)化以包藏所述核酸的非人宿主生物體或細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分。
【IPC分類(lèi)】C12N9-88, C12N9-16, C12P7-02, C12N15-62
【公開(kāi)號(hào)】CN104846020
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510132253
【發(fā)明人】M·沙爾克
【申請(qǐng)人】弗門(mén)尼舍有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2009年2月12日
【公告號(hào)】CN101939430A, CN101939430B, EP2245161A1, EP2245161B1, US8586328, US20110041218, WO2009101126A1, WO2009101126A9