一種ssr標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法、小麥ssr標(biāo)記引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法。針對現(xiàn)有SSR標(biāo)記引物多態(tài)性不足的缺陷，本發(fā)明提供了一種基于基因組草圖序列設(shè)計(jì)新SSR標(biāo)記引物的方法。本方法首先選擇一位點(diǎn)已知的SSR標(biāo)記引物作為起始SSR標(biāo)記引物，其次將起始SSR標(biāo)記引物與其所在染色體草圖序列進(jìn)行序列比對查找比對結(jié)果中的片段重疊群，然后搜尋片段重疊群中的SSR序列作為結(jié)果SSR序列，最后根據(jù)結(jié)果SSR序列設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記引物。本發(fā)明還提供了14對新的與小麥條銹病抗性有關(guān)的SSR標(biāo)記引物，其中5對在供試遺傳群體中產(chǎn)生多態(tài)性；以及以L693×L661和L661×L693F2單株作為作圖群體的小麥遺傳圖譜構(gòu)建方法。本發(fā)明方法可快速增加已知位點(diǎn)SSR標(biāo)記引物的數(shù)量，增加SSR標(biāo)記多態(tài)性，與基因初定位相結(jié)合可以快速加密遺傳圖譜。
【專利說明】一種SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法、小麥SSR標(biāo)記引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法及小麥分子標(biāo)記引物，特別是涉及一種SSR分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法及小麥SSR標(biāo)記引物，屬于基因工程、作物遺傳育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]SSR標(biāo)記以PCR技術(shù)為核心的DNA標(biāo)記技術(shù)，其技術(shù)原理是利用SSR序列在基因組中分布廣泛、多態(tài)性高，且SSR序列兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列的特征，根據(jù)檢測基因組區(qū)域SSR序列兩端的單拷貝序 列設(shè)計(jì)一對特異引物，再利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個位點(diǎn)的SSR序列，通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、可靠性高等技術(shù)優(yōu)勢，是目前最為常用的SSR分子標(biāo)記技術(shù)。但由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需確定重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其引物開發(fā)存在困難且費(fèi)用較高。
[0003]輔助育種是目前植物分子標(biāo)記技術(shù)的重要應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】之一。利用分子標(biāo)記輔助育種，前提是用分子標(biāo)記對育種所需要的基因進(jìn)行精確的遺傳學(xué)定位，定位越精細(xì)，利用分子標(biāo)記作為診斷標(biāo)記就越準(zhǔn)確，就越能加快育種進(jìn)程。目前利用SSR標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因精細(xì)定位依然存在如下三方面技術(shù)缺陷:一、SSR標(biāo)記引物開發(fā)成本高、開發(fā)周期長；二、盡管SSR標(biāo)記多態(tài)性出現(xiàn)的幾率相對較高，但是仍然還是有很多位點(diǎn)不會出現(xiàn)多態(tài)性。尤其是針對遺傳背景相近的姐妹系衍生的遺傳作圖群體，已標(biāo)記的位點(diǎn)間遺傳距離依然較大，比如小麥染色體0.lcM，就需要更多的多態(tài)性分子標(biāo)記；三、在利用近等基因系對小麥新基因進(jìn)行作圖時，由于近等基因系本身在遺傳上非常相似，因而也會面臨由于多態(tài)性分子標(biāo)記太少，而不能將基因的位置定位到很精確的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法，該方法基于基因組草圖序列實(shí)現(xiàn)。利用新設(shè)計(jì)引物完成的SSR標(biāo)記方法能夠增加已知位點(diǎn)SSR標(biāo)記多態(tài)性。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于:依照如下步驟實(shí)施:
[0007]步驟S1、選擇一位點(diǎn)已知的SSR標(biāo)記引物作為起始SSR標(biāo)記引物；
[0008]步驟S2、將起始SSR標(biāo)記引物與其所在染色體草圖序列進(jìn)行序列比對，比對精度不低于95%，查找比對結(jié)果中的片段重疊群；
[0009]步驟S3、搜尋步驟S2查找到的片段重疊群中的SSR序列作為結(jié)果SSR序列；
[0010]步驟S4、根據(jù)該結(jié)果SSR序列與其左右兩側(cè)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，得到結(jié)果SSR標(biāo)記引物。
[0011]上述方法的基本技術(shù)原理在于:利用現(xiàn)有位點(diǎn)已知的SSR標(biāo)記引物作為起始SSR標(biāo)記引物，在該起始SSR標(biāo)記引物所在染色體草圖序列進(jìn)行比對,查找包含該起始SSR標(biāo)記引物序列的草圖片段重疊群(Contig);再搜索該片段重疊群中SSR序列得到結(jié)果SSR序列，最后根據(jù)該結(jié)果SSR序列與其左右兩側(cè)序列設(shè)計(jì)出能擴(kuò)增出該結(jié)果SSR序列的引物，即得到新設(shè)計(jì)出的SSR標(biāo)記引物。依照此方法發(fā)現(xiàn)的結(jié)果SSR位點(diǎn)與起始SSR標(biāo)記位點(diǎn)間物理距離很近(<10kb)，在減數(shù)分裂時，該物理距離內(nèi)發(fā)生交換的概率很小(平均概率〈0.01%)， 因此兩標(biāo)記位點(diǎn)在遺傳上可以視為完全連鎖。如果比對查找到的草圖片段重疊群中含有多個SSR位點(diǎn)，那么就可以實(shí)現(xiàn)從一個已知的SSR標(biāo)記位點(diǎn)快速找到多個與其連鎖的SSR標(biāo)記位點(diǎn)。盡管SSR標(biāo)記出現(xiàn)多態(tài)性的概率保持不變，但是由于SSR標(biāo)記絕對數(shù)量增多可以使得標(biāo)記呈現(xiàn)多態(tài)性的數(shù)量也隨之增多，由此使得精細(xì)定位得以進(jìn)行。利用引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)出各新的結(jié)果SSR標(biāo)記位點(diǎn)對應(yīng)的引物，與PCR擴(kuò)增相結(jié)合可以應(yīng)用遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。
[0012]上述方法，步驟S3中，一般選擇5個核苷酸為重復(fù)元件的最大值。這是因?yàn)镾SR 是指重復(fù)元件為2~5個核苷酸的重復(fù)序列，其重復(fù)元件越長，發(fā)生變異導(dǎo)致多態(tài)性的概率就越低。
[0013]上述方法，可做如下優(yōu)化:優(yōu)化一，步驟S4的引物設(shè)計(jì)中，在保證能將目的SSR序列擴(kuò)增的前提下，引物設(shè)計(jì)長度19bp~25bp ;優(yōu)化二，步驟S4的引物設(shè)計(jì)中，在保證能將目的SSR序列擴(kuò)增的前提下，退火溫度Tm值60°C，且上游和下游引物的Tm值相差不大于 2V ;優(yōu)化三，步驟S4的引物設(shè)計(jì)中，以結(jié)果SSR序列與其左右兩側(cè)各150bp序列進(jìn)行擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)；優(yōu)化四，在上述優(yōu)化基礎(chǔ)上，進(jìn)一步地，步驟S4的引物設(shè)計(jì)中，(G+C)含量控制在 40%~60%，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度150bp~250bp，盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。更進(jìn)一步的是，(G+C)含量控制在55%。
[0014]上述SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法的一種優(yōu)化方法是:步驟SI中首先進(jìn)行目的基因的初定位，并在初定位確定的染色體區(qū)域內(nèi)和/或附近尋找位點(diǎn)已知的SSR標(biāo)記引物作為起始 SSR標(biāo)記引物。優(yōu)化后的方案可應(yīng)用于遺傳圖譜的加密，獲得高密度的分子標(biāo)記遺傳圖譜。
[0015]本發(fā)明提供14對小麥SSR標(biāo)記引物(表1、表2),該小麥SSR標(biāo)記引物是以8對已知的小麥SSR標(biāo)記引物作為起始SSR標(biāo)記引物利用本發(fā)明公開的標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)得到的結(jié)果SSR標(biāo)記引物。
[0016]表1小麥SSR標(biāo)記引物
[0017]
【權(quán)利要求】
1.一種SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于:依照如下步驟實(shí)施: 步驟S1、選擇一位點(diǎn)已知的SSR標(biāo)記引物作為起始SSR標(biāo)記引物； 步驟S2、將起始SSR標(biāo)記引物與其所在染色體草圖序列進(jìn)行序列比對，比對精度不低于95%，查找比對結(jié)果中的片段重疊群； 步驟S3、搜尋步驟S2查找到的片段重疊群中的SSR序列作為結(jié)果SSR序列； 步驟S4、根據(jù)該結(jié)果SSR序列與其左右兩側(cè)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，得到結(jié)果SSR標(biāo)記引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟S4擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)中，退火溫度Tm = 60°C，且上游與下游引物的Tm值相差不大于2°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟S4引物設(shè)計(jì)長度19bp~25bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟S4中，(G+C)含量控制在40%~60%, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度150bp~250bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟S3結(jié)果SSR序列搜尋中，選擇5個核苷酸作為重復(fù)元件的最大值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟SI中首先進(jìn)行目的基因的初定位，然后在初定位確定的染色體區(qū)域內(nèi)和/或附近尋找位點(diǎn)已知的SSR標(biāo)記引物作為起始SSR標(biāo)記引物。
7.利用權(quán)利要求1~6任一所述的SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法實(shí)現(xiàn)的SSR分子標(biāo)記方法。
8.利用權(quán)利要求1~6任一所述的SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)得到的小麥SSR標(biāo)記引物，其特征在于:所述起始SSR標(biāo)記引物與所述結(jié)果SSR標(biāo)記引物分別如表1所示: 表1小麥SSR標(biāo)記引物
9.一種利用權(quán)利要求8所述的小麥SSR標(biāo)記引物實(shí)現(xiàn)的小麥遺傳圖譜構(gòu)建方法:其特征在于:依照如下步驟實(shí)施:步驟S1、以L693XL661與L661XL693的F2單株作為作圖群體；步驟S2、提取作圖群體植株的總DNA ；步驟S3、分別利用所述設(shè)計(jì)結(jié)果SSR標(biāo)記引物以步驟S2所得總DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟S4、利用生物學(xué)軟件分析步驟S3所得PCR擴(kuò)增結(jié)果，構(gòu)建小麥遺傳圖譜。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述步驟S3中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為0.3XTBE,2000V電壓電泳40min，經(jīng)過銀染后成像。
【文檔編號】C12N15/10GK103571833SQ201310579379
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】羅培高, 李鑫, 陳萬權(quán), 張敏, 任正隆, 張懷渝 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)