在探針的內(nèi)部區(qū)域中出現(xiàn)。
[0036] _核酸酶測(cè)定 靶核酸的檢測(cè)可以使用"TaqMan? "或" 5 '-核酸酶測(cè)定"來(lái)執(zhí)行，如美國(guó)專利號(hào) 5, 210, 015 ;5, 487, 972;和 5, 804, 375;以及Holland等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci. USA88:7276-7280中所述。在TaqMan?測(cè)定中，在擴(kuò)增區(qū)內(nèi)雜交的標(biāo)記的檢測(cè)探針在擴(kuò)增 反應(yīng)期間存在。這樣修飾探針，以便阻止探針充當(dāng)DNA合成的引物。使用具有5'至3'外 切核酸酶活性的DNA聚合酶執(zhí)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增的每個(gè)合成步驟期間，與待延伸的引物下游 的靶核酸雜交的任何探針被DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性降解。因此，新靶鏈的 合成也導(dǎo)致探針降解，并且降解產(chǎn)物的累積提供了靶序列合成的量度。
[0037] 任何適合于檢測(cè)降解產(chǎn)物的方法均可用于5'核酸酶測(cè)定中。通常，檢測(cè)探針用兩 種熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，所述熒光染料之一能夠猝滅另一染料的熒光。染料附著至探針，通 常報(bào)道或檢測(cè)染料附著至5'末端，并且猝滅染料附著至內(nèi)部位點(diǎn)，使得當(dāng)探針處于非雜交 狀態(tài)時(shí)猝滅發(fā)生，并且使得通過(guò)DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性的探針切割在兩種 染料之間發(fā)生。擴(kuò)增導(dǎo)致探針在染料之間的切割，伴隨猝滅的消除和可由初始猝滅的染料 觀察到的熒光增加。降解產(chǎn)物的累積通過(guò)測(cè)量反應(yīng)熒光中的增加進(jìn)行監(jiān)控。美國(guó)專利號(hào) 5, 491，063和5, 571，673描述了用于檢測(cè)探針降解的替代方法，所述探針降解伴隨擴(kuò)增而 發(fā)生。
[0038] 用于檢測(cè)靶核酸的5'核酸酶測(cè)定可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA 聚合酶。因此，在一些實(shí)施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是熱穩(wěn)定和熱活性的核 酸聚合酶。此類熱穩(wěn)定的聚合酶包括但不限于來(lái)自真細(xì)菌棲熱菌屬（熱袍菌 屬和棲熱腔菌屬（TXerfflosiMo)的多個(gè)物種的天然和重組形式的聚合酶， 以及其嵌合形式。例如，可以用于本發(fā)明方法中的棲熱菌屬物種聚合酶包括水生棲熱菌 iThermusaquaticus)iTaq)觀k聚；槪、鳴熱敏熱魯iThermusthermophilus)iTth) DNA聚合酶、棲熱菌屬物種Z05 (Z05)DNA聚合酶、棲熱菌屬物種spsl7 (spsl7)和棲熱菌 屬物種Z05(例如美國(guó)專利號(hào)5, 405, 774 ;5, 352, 600 ;5, 079, 352 ;4, 889, 818 ;5, 466, 591 ; 5, 618, 711 ;5, 674, 738和5, 795, 762中描述的）。可以用于本發(fā)明的方法中的熱袍菌屬 聚合酶包括例如海棲熱袍菌（DNA聚合酶和新阿波羅棲熱袍菌 (DNA聚合酶，而可以使用的棲熱腔菌聚合酶的例子是非洲棲熱 腔菌（a/rica/ws) DNA聚合酶。海棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌DNA聚合酶的序 列公開于國(guó)際申請(qǐng)棲熱腔菌中。新阿波羅棲熱袍菌的序列可以在國(guó)際申請(qǐng)W0 97/09451中 發(fā)現(xiàn)。
[0039] 在5'核酸酶測(cè)定中，擴(kuò)增檢測(cè)通常與擴(kuò)增同時(shí)（S卩，"實(shí)時(shí)")。在一些實(shí)施方案中， 擴(kuò)增檢測(cè)是定量的，并且擴(kuò)增檢測(cè)是實(shí)時(shí)的。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增檢測(cè)是定性的(例如， 靶核酸的存在或不存在的終點(diǎn)檢測(cè))。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增檢測(cè)在擴(kuò)增之后。在一些實(shí) 施方案中，擴(kuò)增檢測(cè)是定量的，并且擴(kuò)增檢測(cè)在擴(kuò)增之后。
[0040] 探針可以用任何數(shù)目的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，但通常為熒光標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案 中，焚光團(tuán)部分選自焚光素家族染料、聚鹵素焚光素（polyhalofluorescein)家族染料、六 氯熒光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花青素家族染料、噁嗪家族染料、噻 嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染 料和B0DIPY?家族染料。
[0041] 測(cè)定通常包含由熒光標(biāo)記物和猝滅劑部分標(biāo)記的探針。在一些實(shí)施方案中，猝滅 劑部分選自熒光素家族染料、聚鹵素?zé)晒馑丶易迦玖稀⒘葻晒馑丶易迦玖?、香豆素家族?料、羅丹明家族染料、花青素家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯 合的鑭系元素家族染料、B0DIPY?家族染料、偶氮家族染料；三苯甲烷家族染料、低熒光猝 滅劑部分（即"低暗供體（dimdonors)"）和非熒光猝滅劑部分(例如所謂的"黑暗猝滅劑"， 包括BlackHoleQuenchers?(BHQ))〇
[0042] 羅丹明衍生的染料 羅丹明是含有如圖1A中所示的核心結(jié)構(gòu)的熒光染料。幾種羅丹明衍生物，例如羧基 四甲基羅丹明（TAMRA)和磺酰羅丹明101酰基氯(德克薩斯紅）也是熒光染料，通常用于 成像目的。其熒光發(fā)射最大值在600nm范圍內(nèi)的新型羅丹明衍生物已公開于美國(guó)專利號(hào) 6, 184, 379，（'379)。這些衍生物具有可以由下式表示的結(jié)構(gòu)：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備用作PCR反應(yīng)中的雜交探針的標(biāo)記的寡核苷酸的方法，其包括： (a) 提供羅丹明衍生物熒光染料，其中所述熒光染料附著有雙功能接頭分子； (b) 經(jīng)由雙功能接頭分子使反應(yīng)基團(tuán)與熒光染料鍵合，用于將所述熒光染料摻入寡核 苷酸內(nèi)； (c) 將所述熒光染料摻入所述寡核苷酸的兩個(gè)內(nèi)部核苷酸之間，前提是所述熒光染料 不摻入所述寡核苷酸的5'末端處。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光染料是具有通式的化合物：
其中Ca、Cb、Cc和Cd各自指示C原子，Ca和Cb通過(guò)單鍵或雙鍵連接在一起，并且Cc 和Cd通過(guò)單鍵或雙鍵連接在一起； 父1、父2、父3、父4、父7和父10是氫，并且父5、父6、父8、父9、父10、父11和父12是甲基； Rl和R2是相同的或不同的，并且選自氫和具有1-20個(gè)C原子的烷基，其中烷基殘基任 選由至少一個(gè)羥基、鹵素、磺酸、氨基、羧基或烷氧基羰基基團(tuán)取代，并且至少Rl含有可活 化基團(tuán)； A1、A2、A3、B1是氯或氟，并且B2是氯、氟或氫。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述熒光染料是：
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述雙功能接頭分子包含L-蘇糖醇。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)一步包含在所述標(biāo)記的寡核苷酸的 5'末端處附著的猝滅劑分子。
6. -種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的靶核酸或核酸的靶等位基因的存在或不存在的方法，其 包括： 使用與靶核酸雜交的標(biāo)記的探針寡核苷酸執(zhí)行PCR反應(yīng)，其中所述標(biāo)記的探針寡核苷 酸的特征在于具有： 羅丹明衍生物熒光染料，所述羅丹明衍生物附著有雙功能接頭分子；和 與所述雙功能接頭分子鍵合的反應(yīng)基團(tuán)，用于將所述熒光染料摻入所述寡核苷酸的兩 個(gè)內(nèi)部核苷酸之間，前提是所述熒光染料不摻入所述寡核苷酸的5'末端處； 檢測(cè)來(lái)自所述熒光染料的信號(hào)，其中所述信號(hào)的強(qiáng)度代表所述靶核酸的存在或不存 在。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述熒光染料是具有通式的化合物：
其中Ca、Cb、Cc和Cd各自指示C原子，Ca和Cb通過(guò)單鍵或雙鍵連接在一起，并且Cc 和Cd通過(guò)單鍵或雙鍵連接在一起； 父1、父2、父3、父4、父7和父10是氫，并且父5、父6、父8、父9、父10、父11和父12是甲基； Rl和R2是相同的或不同的，并且選自氫和具有1-20個(gè)C原子的烷基，其中烷基殘基任 選由至少一個(gè)羥基、鹵素、磺酸、氨基、羧基或烷氧基羰基基團(tuán)取代，并且至少Rl含有可活 化基團(tuán)； A1、A2、A3、B1是氯或氟，并且B2是氯、氟或氫。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述熒光染料是：
9. 權(quán)利要求6的方法，其中所述雙功能接頭分子包含L-蘇糖醇。
10. 權(quán)利要求6的方法，其中所述標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)一步包含在所述標(biāo)記的寡核苷酸 的5'末端處附著的猝滅劑分子。
11. 權(quán)利要求6的方法，其中所述靶核酸是載脂蛋白E基因。
12. 權(quán)利要求6的方法，其中核酸的靶等位基因是載脂蛋白E基因的334T/C等位基因 或472 T/C等位基因。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于生成用于PCR反應(yīng)中以檢測(cè)靶核酸的標(biāo)記的寡核苷酸探針的方法，所述標(biāo)記的寡核苷酸探針含有熒光羅丹明衍生的染料。
【IPC分類】C12Q1-68, C07H21-00
【公開號(hào)】CN104854121
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380066880
【發(fā)明人】C.阿納克萊托, T.布加萬(wàn), N.肖恩布倫納
【申請(qǐng)人】霍夫曼-拉羅奇有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2013年12月18日
【公告號(hào)】CA2894932A1, US20140178877, WO2014095952A1