一種用于指導(dǎo)5-氟尿嘧啶用藥的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于指導(dǎo)5-氟尿嘧啶用藥的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU)為嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝抗腫瘤藥 物，對(duì)增殖性細(xì)胞均有很強(qiáng)的殺傷作用，是臨床上主要的化療藥物之一，對(duì)胃癌、肝癌等多 種腫瘤均有效。5-FU在體內(nèi)必須轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的核苷酸才能發(fā)揮抑制腫瘤的效果。5-FU在 體內(nèi)先轉(zhuǎn)化為5-氟-2-脫氧尿嘧啶核苷酸，通過(guò)抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TS)而抑制 DNA的生物合成。此外，還能摻入RNA，阻止尿嘧啶摻入RNA而抑制RNA的合成。5-FU代謝 后有兩種主要活性產(chǎn)物：（1)三磷酸氟尿嘧啶（FUTP)，結(jié)合到RNA上，干擾其功能；（2)通過(guò) 尿苷激酶的作用，生成一磷酸氟代脫氧尿苷（FdUMP)，抑制胸苷酸合成成酶而阻止DNA的合 成，后者是抗腫瘤的主要機(jī)制。盡管5-FU在殺傷癌細(xì)胞方面作用明顯，但由于不能進(jìn)行選 擇性殺傷，導(dǎo)致正常細(xì)胞也不能幸免，因此在治療期間往往伴隨嚴(yán)重的副作用，其主要副作 用包括消化道反應(yīng)及骨髓抑制，同時(shí)還會(huì)發(fā)生脫發(fā)、指甲改變、皮炎、皮膚色素增加等現(xiàn)象。 一般來(lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)劑量的5-FU是相對(duì)可以耐受的，但是與其他抗腫瘤藥物一樣。5-FU有相對(duì) 較窄的安全治療范圍，毒性隨劑量的增加而增加，因此，在宿主或腫瘤組織中，編碼關(guān)鍵代 謝酶的基因或5-FU作用位點(diǎn)的基因表達(dá)的輕度改變將改變療效和毒副作用。
[0003] DPYD(dihydropyrimidine dehydrogenase)基因編碼二氧啼陡脫氧酶（DF1D),后者 是負(fù)責(zé)5-FU降解的最關(guān)鍵的酶，體內(nèi)5-FU劑量的85%都是通過(guò)DH)代謝失活，因此該酶的 活性對(duì)5-FU的代謝至關(guān)重要，將影響5-FU的療效和毒副作用。Kuilenburg等研究發(fā)現(xiàn)接 受含5-FU化療的患者中DH)活性高低是影響5-FU毒性的重要因素之一。腫瘤中的DH)活 性越低腫瘤對(duì)5-FU越敏感，5-FU的毒副作用就越明顯，而高DH)可顯著減少5-FU的毒性不 良反應(yīng)。DPYD基因某些位點(diǎn)的多態(tài)性可造成DH)活性的改變，從而引起5-FU的藥代動(dòng)力學(xué) 的異常，造成嚴(yán)重的毒性。DPYD到現(xiàn)在為止至少有20種突變與DH)活性降低和5-FU毒性 反應(yīng)有關(guān)。后來(lái)Kuilenbur的深入研究表明，DPYD基因的IVS14+1G>A點(diǎn)突變（即14內(nèi)含子 57剪切位點(diǎn)處GT突變?yōu)锳T)，導(dǎo)致DH)失活，是最常見(jiàn)的導(dǎo)致5-FU嚴(yán)重毒性反應(yīng)的基因突 變。在該項(xiàng)研究中DH)活性下降的患者中28%為IVS14+1G>A點(diǎn)突變，而正常者中只有4% 的突變率，證明IVS14+1G>A點(diǎn)突變攜帶者具有發(fā)生DH)嚴(yán)重毒性反應(yīng)的高風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] MTHFR基因編碼的亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolatereducta se)是葉酸-甲硫氨酸代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，可催化5, 10-亞甲基四氫葉酸（5, 10-MTHF) 不可逆的還原成5-甲基四氫葉酸（5-MTHF)，成為體內(nèi)葉酸的主要活性形式。5-MTHF通過(guò) 提供一碳單位參與同型半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸，調(diào)節(jié)體內(nèi)同型半胱氨酸的正常水 平，甲硫氨酸活化為S-腺苷甲硫氨酸（SAM)成為體內(nèi)甲基供體，參與許多代謝反應(yīng)。同時(shí)， 5, 10-MTHF作為腺苷酸合成酶的底物參與嘌呤和嘧啶的合成。5-FU進(jìn)入人體后，在胸苷激 酶的催化下轉(zhuǎn)變成5-氟-2-脫氧尿苷-5-單磷酸鹽，再與5, 10-MTHF及胸苷酸合成酶形成 共價(jià)絡(luò)合物，從而干擾DNA的合成和修復(fù)。因此，MTHFR的活性將直接影響體內(nèi)5, 10-MTHF的 濃度，從而影響5-FU的抗瘤作用。MTHFR基因具有多種突變類型，不同的突變類型對(duì)MTHFR 的酶活性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生不同的影響。其中最常見(jiàn)的是其第677位密碼子發(fā)生的由C至 T的變異（又稱665C>T點(diǎn)突變)，該堿基突變使一個(gè)高度保守的丙氨酸（Ala)變成了纈氨酸 (Val)，同時(shí)產(chǎn)生了 1個(gè)Hinf I和Taq I限制性酶切位點(diǎn)。G677T位于MTFR催化區(qū)域，該 突變直接影響亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和耐熱性，表現(xiàn)為不同程度的酶活性降低并伴 有耐熱性降低，導(dǎo)致同型半胱氨酸的轉(zhuǎn)硫基和甲基化過(guò)程出現(xiàn)障礙。Jakobsen等在139名 接受含5-Fu化療的晚期結(jié)直腸癌患者中，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因第667位的密碼子為TT基因型 的對(duì)化療有較高敏感性，T/T基因型和T/C基因型患者對(duì)5-FU化療的敏感性均高于C/C患 者，其疾病進(jìn)展時(shí)間顯著延長(zhǎng)。
[0005] 5-FU對(duì)于腫瘤患者應(yīng)用較為廣泛，且療效顯著，但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作 用甚至死亡。如果在用5-FU之前能夠預(yù)測(cè)病人對(duì)它的反應(yīng)，將減少病人的痛苦和損 失，從根本上改變以往的治療模式，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療。采用常規(guī)測(cè)量二氫嘧啶脫氫酶 (dihydropyrimkline dehydrogenase,DPD)活性的方法來(lái)預(yù)測(cè)5-FU的反應(yīng)，由于其價(jià)格昂 貴、且不易施行，操作復(fù)雜，不適合臨床應(yīng)用或?qū)Υ髽颖静±M(jìn)行篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用于指導(dǎo)5-氟尿嘧啶用藥的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明保護(hù)一種引物組，由引物對(duì)甲和引物對(duì)乙組成；所述引物對(duì)甲由序列表的 序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)乙由 序列表的序列3所不的單鏈DNA分子和序列表的序列4所不的單鏈DNA分子組成。
[0008] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在制備用于鑒定DPYD基因的IVS14+1G>A點(diǎn)突變和 MTHFR基因的665C>T點(diǎn)突變的試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在制備用于指導(dǎo)5-氟尿嘧啶用藥的試劑盒中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還保護(hù)一種用于鑒定DPYD基因的IVS14+1G>A點(diǎn)突變和MTHFR基因的 665C>T點(diǎn)突變的試劑盒，包括所述引物組。所述試劑盒還可包括陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒。所述陽(yáng)性 對(duì)照質(zhì)?？蔀閷⒕哂蠨PYD基因的IVS14+1G>A點(diǎn)突變的DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組 質(zhì)粒甲和將具有MTHFR基因的665C>T點(diǎn)突變的DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒乙。 所述重組質(zhì)粒甲具體可為將序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子插入pMDIS-T質(zhì)粒的多克 隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒乙具體可為將 序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子插入pMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII 酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。所述試劑盒還可包括陰性對(duì)照。所述陰性對(duì)照具體可為 水，如去離子水。所述試劑盒還可包括用于提取基因組DNA的試劑盒或試劑盒。所述試劑 盒還可包括用于進(jìn)行DNA測(cè)序的試劑、試劑盒或儀器。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)一種用于指導(dǎo)5-氟尿嘧啶用藥的試劑盒，包括所述引物組。所述試 劑盒還可包括陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒。所述陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)?？蔀閷⒕哂蠨PYD基因的IVS14+1G>A點(diǎn)突 變的DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒甲和將具有MTHFR基因的665C>T點(diǎn)突變的DNA 分子插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒乙。所述重組質(zhì)粒甲具體可為將序列表的序列5所示的 雙鏈DNA分子插入pMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的 重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒乙具體可為將序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子插入pMDIS-T 質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。所述試劑盒還可 包括陰性對(duì)照。所述陰性對(duì)照具體可為水，如去離子水。所述試劑盒還可包括用于提取基 因組DNA的試劑盒或試劑盒。所述試劑盒還可包括用于進(jìn)行DNA測(cè)序的試劑、試劑盒或儀 器。
[0012] 以上任一所述的DPYD基因的IVS14+1G>A點(diǎn)突變的具體含義為：序列表的序列 5所示DNA分子自5'末端第174位核苷酸由G突變?yōu)锳。以上任一所述的DPYD基因的 IVS14+1G>A點(diǎn)突變的具體含義為：以人的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)甲進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端第174位核苷酸由G突變?yōu)锳。
[0013] 以上任一所述的MTHFR基因的665C>T點(diǎn)突變的具體含義為：序列表的序列6所示 DNA分子自5'末端第268位核苷酸由C突變?yōu)門。以上任一所述的MTHFR基因的665C>T 點(diǎn)突變的具體含義為：以人的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物自5'末端第268位核苷酸由C突變?yōu)門。
[0014] 以人基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)甲或所述引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異性 良好，不會(huì)交叉擴(kuò)增人類基因組其他區(qū)域。
[0015] 本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測(cè)與5-氟尿嘧啶敏感性相關(guān)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)，進(jìn)而 可以用于臨床指導(dǎo)5-氟尿