原位雜交檢測鼻咽癌組織中長鏈非編碼rna loc284454試劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及原位雜交檢測鼻咽癌組織中長鏈非編 碼RNAL0C284454試劑用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測制劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類基因組計劃及其后續(xù)的DNA元件百科全書計劃（The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉(zhuǎn)錄的序列為長鏈非編碼RNA化ong non-coding RNA, IncRNAKLncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復(fù)雜程度的升高，基因組中IncRNA 序列的比例也相應(yīng)地增大，提示IncRNA在生物進(jìn)化過程中有重要意義。隨著IncRNA不斷被 發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被i全釋，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動不同層 面的功能調(diào)控中，作為一個嶄新的領(lǐng)域，已經(jīng)成為國際生命科學(xué)研究領(lǐng)域新的前沿與熱點。 [000 3] LncRNA可作為功能蛋白質(zhì)的信號（signal)、誘導(dǎo)（guide)、誘巧（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調(diào)控基 因的表達(dá)，并在包括發(fā)育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達(dá)與功能失調(diào)已經(jīng)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病緊密聯(lián)系在了一 起。因此，深入研究IncRNA的功能，掲示由IncRNA介導(dǎo)的遺傳信息傳遞方式和表達(dá)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)，不僅可W從蛋白編碼基因 W外的角度重新注釋和闡明基因組的結(jié)構(gòu)與功能，深入發(fā)現(xiàn) 生命活動的本質(zhì)和規(guī)律，還有望從一個新的視角認(rèn)識包括腫瘤在內(nèi)的多種人類常見疾病的 發(fā)病機理，并為運些疾病的診斷與治療提供新的分子標(biāo)志物與治療祀點。
[0004]鼻咽癌是常見高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋己結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。研究 表明，運種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，LncRNA在鼻咽癌的 發(fā)生發(fā)展過程中可能也起到了重要的作用。最近我們發(fā)現(xiàn)IncRNA L0C284454(NCBI accession number:NR_036515)在鼻咽癌組織和血清中表達(dá)上調(diào)，針對該IncRNA的檢測制 劑也可W用于鼻咽癌的輔助診斷。我們進(jìn)一步增加樣本，在112例有臨床隨訪資料的鼻咽癌 石蠟存檔標(biāo)本中，通過原位雜交（in situ hybridization)的方法檢測了L0C284454的表達(dá) 水平，發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)L0C284454的鼻咽癌患者比低表達(dá) L0C284454的鼻咽癌患者預(yù)后差，因此針對該IncRNA的檢測制劑也可W用于鼻咽癌的預(yù)后 判斷。
[000引我們通過設(shè)計并合成祀向L0C284454的短發(fā)夾RNA(shod-hai巧in RNA，shRNAs) 序列，構(gòu)建了祀向L0C284454的RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細(xì)胞株中，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)和裸 鼠轉(zhuǎn)移瘤體內(nèi)模型中均證實祀向干擾L0C284454的表達(dá)可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn) 移能力。將L0C284454的RNA干擾載體負(fù)載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米基因 轉(zhuǎn)運體，多聚賴氨酸修飾的娃納米顆?？杀Ｗo(hù)L0C284454的RNA干擾載體免受核酸酶降解， 延長作用時間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供原位雜交檢測鼻咽癌組織中長鏈非編碼 RNAL0C284454試劑用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測制劑的用途。
[0007] 原位雜交檢測鼻咽癌組織中長鏈非編碼RNA L0C284454試劑的應(yīng)用，所述的試劑 用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測制劑；該長鏈非編碼RNA L0C284454的序列如SEQ NO: 1所示。
[0008] 所述的原位雜交檢測鼻咽癌組織中長鏈非編碼RNA L0C284454試劑包括W下用于 原位雜交檢測L0C284454表達(dá)的寡核巧酸探針中的一種或幾種：
[0009] L0C284454探針 1:5 ' -GACCGGAAAATAACAAACAAAAACTCTGCCTCAG-3 ' ；
[0010] L0C284454探針2:5 ' -GTGATAGAACTTTAGTCTACCCTCCTCCGAAAAA-3 ' ；
[0011] L0C284454探針3:5 ' -GTACAGACAACAAGTTCATTTATTTTCAACGGGAC-3 '。
[0012] 所述的原位雜交檢測鼻咽癌組織中長鏈非編碼RNA L0C284454試劑包括W下陽性 對照探針中的一種或幾種：
[0013] GAPDH探針1:5 ' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3 ' ；
[0014] GAPDH探針2:5 ' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3 ' ；
[0015] GAPDH探針3:5 ' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3 '。
[0016] 本發(fā)明通過原位雜交技術(shù)證實L0C284454在正常鼻咽上皮(NPE)中表達(dá)水平較低， 40例正常鼻咽上皮中僅有6例（15%)中檢測到有L0C284454的低表達(dá)，在其余34例中檢測不 到;而在112例鼻咽癌組織中有89例鼻咽癌（79.5%)中檢測到有L0C284454的表達(dá)，其中71 例為高表達(dá)，18例為低表達(dá)，其余的23例鼻咽癌組織中未檢測到L0C284454的表達(dá);高表達(dá) L0C284454的鼻咽癌患者總的生存時間和無病生存時間均明顯短于L0C284454表達(dá)低或不 表達(dá)的患者。本發(fā)明為鼻咽癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為巧光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)情況；
[001引實時巧光定量PCR技術(shù)驗證IncRNA L0C284454在鼻咽癌(27例)和慢性炎癥鼻咽上 皮組織(9例）中的表達(dá)情況，L0C284454表達(dá)顯著上調(diào)(P = 0.0056);
[0019] 圖2為L0C284454在鼻咽癌患者血清中同樣表達(dá)上調(diào)情況；
[0020] 實時巧光定量PCR技術(shù)檢測IncRNA L0C284454在鼻咽癌患者血清(77例)和正常人 血清（14例）中的表達(dá)情況;L0C284454在鼻咽癌患者血清中的表達(dá)比正常人血清中顯著提 局。
[0021 ]圖3為原位雜交檢測L0C284454在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達(dá)情況；
[0022] L0C284454在正常鼻咽上皮(NPE)中表達(dá)水平較低，40例正常鼻咽上皮中僅有6例 (15%)中檢測到有L0C284454的低表達(dá)，在其余34例中檢測不到；而在112例鼻咽癌組織中 有89例鼻咽癌（79.5%)中檢測到有L0C284454的表達(dá)，其中71例為高表達(dá)，18例為低表達(dá)， 其余的23例鼻咽癌組織中未檢測到L0C284454的表達(dá);P<0.001。
[0023] 圖4為鼻咽癌組織中L0C284454高表達(dá)患者預(yù)后差，更易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；
[0024] 鼻咽癌中L0C284454的高表達(dá)與鼻咽癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，旨化0C284454高表達(dá) 的患者總的生存時間（Over-all survival，0S)和無病生存時間（Deases-打ee sruvival， DFS)要明顯低于LOC284454低表達(dá)或不表達(dá)的患者。LOC284454在鼻咽癌(NPC)中的表達(dá)與 患者復(fù)發(fā)(C)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(D)密切相關(guān)，LOC284454表達(dá)高的患者更容易復(fù)發(fā)，LOC284454遠(yuǎn) 處轉(zhuǎn)移的能力更強。
[00巧]圖5為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入L0C284454的干擾載體，可顯著抑制L0C284454在鼻咽 癌細(xì)胞中的表達(dá)；
[0026] 在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HNE2和HK1中導(dǎo)入祀向L0C284454的干擾載體（sh-l，sh-2， sh-3)后，實時巧光定量PCR方法檢測了鼻咽癌細(xì)胞中L0C284454的表達(dá)情況，L0C284454的 表達(dá)均受到明顯的抑制。陰性對照(NC)為Scramble干擾載體。
[0027] 圖6為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入L0C284454的干擾載體抑制L0C284454表達(dá)后，細(xì)胞侵 襲能力降低；
[002引細(xì)胞穿膜（transwell)實驗證實，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、H肥2和服1中轉(zhuǎn)入祀向 L0C284454的干擾載體，抑制L0C284454的表達(dá)后，能穿過基質(zhì)膠膜的鼻咽癌細(xì)胞數(shù)目顯著 減少，表明細(xì)胞侵襲能力降低。
[0029] 圖7為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入L0C284454的干擾載體抑制L0C284454表達(dá)后，細(xì)胞遷 移能力降低；
[0030] 細(xì)胞劃痕實驗證實，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HNE2和皿1中轉(zhuǎn)入祀向L0C284454的干 擾載體，抑制L0C284454的表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞從劃痕兩邊往劃痕中央遷移速度明顯減慢， 劃痕愈合的時間延長，表明細(xì)胞運動遷移能力降低。
[0031 ]圖8為動物實驗進(jìn)一步證實干擾L0C284454的表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；
[0032] 在鼻咽癌細(xì)胞5-8F中轉(zhuǎn)入shRNA干擾載體抑制L0C284454表達(dá)后，經(jīng)尾靜脈將鼻咽 癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)與對照組(NC)相比，shRNA敲低L0C284454表 達(dá)的5-8F細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目變少（圖8A、C)，轉(zhuǎn)移灶的體積變?。▓D8B、D)，P<0.05，表明鼻 咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制。
【具體實施方式】
[0033] W下結(jié)合【具體實施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0034] 實施例1，實時巧光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào) [00 3引1.材料與方法：
[0036] 收集9例慢性鼻咽上皮組織和27例鼻咽癌組織，抽提總RNA，lyg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA后，進(jìn)行實時巧光定量PCRdL0C284454正向引物為5'-TTCCTAGCAGCCAGTTACCC-3' 如SEQ NO: 2所示，和反向引物5 ' -CTCCCGGCAAGTTAGAAAGC-3 ' 如沈Q NO: 3所示。
[0037] 用于對照的GAPDH正向引物為5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '如沈Q NO: 4所示，和 反向引物5'-了〇：4〇：4〔〇：了6176(：了6了4-3'，如沈0備:5所示。
[0038] 實時巧光定量PCR反應(yīng)體系 SYBR嚴(yán) Prcmix Ex Taq;、' C2x》 ΙΟμΙ PCR Forward Primer UOyni) 0.4μ 1 PCEL Rev既se Primer (Ι,Ομηι) 0.4μΙ
[0039] cDNA 巧扳 2.0μ1 dH：0 7.2μ1 Total 20μ1
[0040] 實時巧光定量PCR反應(yīng)步驟 1 94 C 5 min 2 95 C 10 see
[0041] 3魏巧 ％潑C 4 72'? 20 sec 5 PIaU; read 6 82 ? 30 sec
[0042] 7 Plate read 8 Go lo step 2 for more 39 times 9 Peffortn nie陽ng 切比V:己 from 55 ,(TG t? 鐵5.0 °C :，.'read ?very '0J °C :，技知.d fbr 1 飯e.
[0043] 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實時巧光定量PCR的擴增曲線和烙解曲線，各基因的表達(dá)強度根 據(jù)CT值（t虹eshold cycle values)、內(nèi)參基因（GAPDH)標(biāo)化后，采用group t-test檢驗計算 P值。
[0044] 2.結(jié)果
[004引 L0C284454在正常對照組織中不表達(dá)或者表達(dá)很低，而在鼻咽癌組織中高表達(dá)P< 0.001(圖 1)
[0046] 實施例2,實時巧光定量PCR法檢測證實L0C284454在鼻咽癌患者血清中表達(dá)上調(diào)
[0047] 1.材料與方法：