一種深綠木霉制備耐熱耐酸阿魏酸酯酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種深綠木霉制備耐熱耐酸阿魏酸酯 酶的方法。
【背景技術】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C13. I. L 73, feruloyl esterase，F(xiàn)AE)是近來研宄較熱的一種羧 酸酯酶，它是一種胞外酶，可以水解阿魏酸甲酯、多糖阿魏酸酯等中的酯鍵，將釋放出游離 的阿魏酸單體或二聚體。在食品和醫(yī)藥領域中，利用阿魏酸酯酶來降解植物細胞壁中的阿 魏酸酯鍵，可以得到有藥用價值和保健功能的游離阿魏酸。阿魏酸是桂皮酸的一種衍生物， 其化學名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，也是一種天然的抗氧化劑，對心血管疾病、糖尿 病、老年癡呆癥和腫瘤等疾病有治療作用。
[0003] 在飼料工業(yè)中，農作物秸桿等飼料細胞壁中阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等木 質素分子以醋鍵方式與半纖維素支鏈形成的致密網(wǎng)狀交聯(lián)結構，從空間上限制了瘤胃微生 物對細胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解。經(jīng)阿魏酸酯酶處理后，飼料原料變得較為疏 松，能加快植物細胞壁等成分在瘤胃的降解速度，提高反芻動物對飼料的消化程度。在造紙 工業(yè)中，經(jīng)阿魏酸酯酶處理的原料，木質素更容易脫除，因而可以減少制漿工序中化學藥品 的使用量。
[0004] 作用深綠木霉阿魏酸酯酶作為耐熱性耐酸阿魏酸酯酶，可以彌補阿魏酸酯酶應用 上的不足，其最適PH為6. 5-7. 5,可適用于一些消化道程酸性的家畜。同時，該酶具有良好 的耐熱性，可有效抵御飼料制粒膨化過程中高溫引起的酶失活。因此耐熱性耐酸阿魏酸酯 酶具有重要的應用價值。
[0005] 目前阿魏酸的生產(chǎn)方法主要包括化學合成法和堿解法，但這兩種方法均存在一定 的缺陷。化學合成法反應步驟多、周期長；堿解法的原料谷維素在米糠中含量低，產(chǎn)量受限； 此外，這兩種方法都具有污染性，因此酶法生產(chǎn)阿魏酸成為近年來研宄的熱點。固態(tài)發(fā)酵生 產(chǎn)酶制劑作為酶制劑工業(yè)一個重要發(fā)展方向，以其發(fā)酵周期短、能耗少、水的消耗量較低、 對環(huán)境污染程度低、單位產(chǎn)量大等優(yōu)點受到廣泛的重視。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，以深綠木霉為生產(chǎn)菌株，通過發(fā)酵菌種的 準備、三角瓶固態(tài)發(fā)酵、曲盤固態(tài)發(fā)酵、粗酶制劑制備、粗酶制劑純化的工藝步驟制備耐熱 阿魏酸酯酶，所得酶制劑不僅耐酸性好，而且具有較強的耐熱能力。
[0007] 所述的深綠木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，郵編100101，保藏編號：CGMCC No. 8673。
[0008] 所述深綠木霉制備耐熱耐酸阿魏酸酯酶的方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟1，菌種制備：挑取菌種孢子接種于活化斜面培養(yǎng)基上活化，30-35?培養(yǎng)箱 培養(yǎng)3-5天，用生理鹽水將活化好的深綠木霉稀釋至孢子濃度為IO7個/mL，再接種所得孢 子懸浮液2mL到50g固態(tài)孢子培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4天，用生理鹽水將孢子濃 度稀釋至I. 2-1. 6X 108cfu/mL，然后接種2mL孢子懸液到IOOmL液體種子培養(yǎng)基，置于搖床 30-40°C培養(yǎng) l-2d，搖床轉速 160-250r/min ;
[0010] 步驟2,深綠木霉三角瓶固態(tài)發(fā)酵：將步驟1所得深綠木霉液體種子2mL接種到固 態(tài)培養(yǎng)基50g，35-40°C培養(yǎng)2-3d，將溫度提高至40-45°C繼續(xù)培養(yǎng)2天，添加補料液體營養(yǎng) 液10-20mL，再將溫度降至30-37°C下培養(yǎng)7-8d ;
[0011] 步驟3,深綠木霉曲盤固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶固態(tài)發(fā)酵的基礎上進行曲盤放大試驗， 曲盤大小為36cmX20cmX6cm，裝料量為180克培養(yǎng)基/曲盤，固液比1.2:1，初始？冊.5， 33-35 °C下靜止培養(yǎng)72h，期間翻曲3-4次，然后添加補料液體營養(yǎng)液20mL，溫度調至 35-40°C，繼續(xù)培養(yǎng)24h，中間翻曲2次，最后將溫度降至28-32°C，再培養(yǎng)24h，得粗酶液；
[0012] 步驟4,阿魏酸酯酶粗酶制劑制備：將步驟3所得粗酶液依次經(jīng)過浸提、超濾、旋轉 蒸發(fā)，得粗酶濃縮液；
[0013] 步驟5,粗酶制劑純化：將步驟4所得粗酶濃縮液依次經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、脫鹽、 脫色、超濾、離子交換層析、疏水柱層析和凝膠過濾層析后，冷凍干燥，得純品。
[0014] 作為上述發(fā)明的進一步改進，步驟1中活化斜面培養(yǎng)基配方：土豆浸出液100mL， 麩皮浸出液100mL，無機鹽液lmL，鹿糖lg，瓊脂粉3g，pH5. 0-6. 0,121°C滅菌15min ;固態(tài)孢 子培養(yǎng)基配方：麩皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆餅粉2g，無機鹽溶液lmL，土豆浸出液8mL， 121°C滅菌15min ;液體種子培養(yǎng)基配方：麩皮浸出液100mL，土豆浸出液100mL，蔗糖lg，無 機鹽溶液 lmL，ρΗ5· 0,121°C 滅菌 20min。
[0015] 作為上述發(fā)明的進一步改進，步驟2中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：玉米秸桿粉lg，大豆 秸桿粉2g，地瓜秧草粉lg，麩皮4g，玉米粉lg，豆餅粉2g，蛹蟲草栽培后廢棄培養(yǎng)基2g，無 機鹽液 10mL，121°C 滅菌 20min。
[0016] 作為上述發(fā)明的進一步改進，步驟3中曲盤固態(tài)培養(yǎng)基配方為：大豆秸桿粉2g，地 瓜秧草粉lg，麩皮4g，玉米粉lg，豆餅粉2g，蛹蟲草栽培后廢棄培養(yǎng)基2g，無機鹽液10mL， 121°C 滅菌 20min。
[0017] 作為上述發(fā)明的進一步改進，步驟3中所述補料液體營養(yǎng)液的制備方法為：玉米 秸桿、黃豆秸桿、地瓜秧均粉碎至40目，按照質量比1:1:1混合，然后向固體混合物中加入 去離子水至濃度為1〇?七％，煮沸3〇!1^11，過濾去除深褐色濾液，向濾渣中加入濃度為1 ￥八％ 的稀硫酸，固體混合物和稀硫酸的質量體積比為1:10,于121°C水解2h，冷卻至60°C并在該 溫度下用Ca (OH) 2調節(jié)水解液至pH10. 0,60°C水浴保溫30-40min，冷卻至室溫，過濾除去濾 渣并保留水解液，再用HCl調節(jié)pH至6. 0,即得到補料液體營養(yǎng)液。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其顯著優(yōu)點在于：第一，本發(fā)明采用營養(yǎng)液補料法，在原 發(fā)酵的基礎上，進一步發(fā)酵產(chǎn)酶，顯著提高了單位培養(yǎng)基產(chǎn)酶量，酶活高達：17. 92U/g ;第 二，該方法所得阿魏酸酯酶，不僅耐酸性好，而且具有較強的耐熱能力，特別適合用作飼用 酶制劑；第三，粗酶制劑經(jīng)過硫酸銨沉淀、陰離子交換層析、疏水柱層析以及凝膠過濾層析 等純化步驟后，阿魏酸酯酶純化了 219倍，活性回收率為27% ;第四，發(fā)酵周期短、能耗少、 水的消耗量低、對環(huán)境污染程度低、單位產(chǎn)量大。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實施例2中阿魏酸酯酶離子交換層析后洗脫圖譜；
[0020] 圖2為實施例2中阿魏酸酯酶分子篩凝膠過濾層析后洗脫圖譜；
[0021] 圖3為實施例2中阿魏酸酯酶純化電泳圖。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1
[0023] 本實施例說明深綠木霉AWS26的篩選方法，具體步驟如下：
[0024] 步驟1，采樣及樣品處理：
[0025] 從江蘇省徐州市云龍區(qū)大韓村正處于高溫發(fā)酵的堆肥中取土樣10份。稱取固體 土樣5g，放入裝有玻璃珠及50mL已滅菌生理鹽水的三角瓶中，160r/min振蕩30min，制成懸 液，然后將此三角瓶放入60-70°C恒溫震蕩水浴鍋中，lOOr/min震蕩處理20-30min，得土樣 渾濁液。
[0026] 步驟2,富集培養(yǎng)