:重組SGNH家族酯酶EstDl的pH穩(wěn)定性示意圖。
[0029] 圖6 :lmM金屬離子及部分化學(xué)試劑對重組SGNH家族酯酶EstDl活性的影響。
[0030] 圖7 :重組SGNH家族酯酶EstDl以PNPC2為底物時，1/[S]與1/V的關(guān)系。
[0031] 圖8 :重組SGNH家族酯酶EstDl以PNPC4為底物時，1/[S]與1/V的關(guān)系。
[0032] 圖9 :重組SGNH家族酯酶EstDl以α -乙酸萘酯為底物時，1/[S]與1/V的關(guān)系。
[0033] 圖10 :重組SGNH家族酯酶EstDl以β-乙酸萘酯為底物時，1/[S]與1/V的關(guān)系。
[0034] 圖11 :重組SGNH家族酯酶EstDl對7-ACA降解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，其中，（a)為實(shí)驗(yàn) 組；(b)為對照組。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0036] 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
[0037] 1、菌株及載體：
[0038] 嗜熱脂環(huán)芽抱桿菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)為實(shí)驗(yàn)室篩選菌株；（該菌株與授權(quán)公告號為CN102787107B中涉及的嗜熱脂環(huán) 酸芽孢桿菌為同一菌株）。
[0039] 大腸桿菌 Escherichia coli BL21 (DE3)購于 Novagen 公司；
[0040] 表達(dá)載體pEASYTM-E2購于全式金生物有限（TransGen)公司。
[0041] 2、酶類及其它生化試劑：DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；其它試劑均購自國 藥集團(tuán)。堅(jiān)固藍(lán)Β、α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、丁酸-4-硝基 苯酯（pNPC4)、7-氨基頭孢烷酸（7-ACA)購自Sigma公司；其它試劑均購自國藥集團(tuán)。
[0042] 3、培養(yǎng)基：
[0043] LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 %，酵母粉0. 5%，氯化鈉1 %，pH自然（約為7. 0)。固體培 養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0044] 說明：以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。
[0045] 實(shí)施例1 :SGNH家族酯酶基因 EstDl的克隆
[0046] 提取嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I基因組DNA :CTAB裂解法，具體步驟為：將液體培養(yǎng) 12h的新鮮菌液離心取菌體，加入800 μ L溶液I (20mM Tris, ρΗ8· 0, 2mM Na2-EDTA,終濃度 20mg/mL溶菌酶），37°C保溫30min，加100 μ L 10% SDS上下顛倒混勾，再加10 μ L 10mg/mL 的蛋白酶K，37°C保溫30min，加150 yL 5M NaCl和150 yL 10% CTAB溶液上下顛倒混勻， 65°〇保溫201^11，分裝成600以1^每管，再加入600以1^酚/氯仿/異丙醇（體積比25 :24:1) 進(jìn)行抽提，在4°C下12000rpm離心10min，取上清300 μ L于300 μ L氯仿/異丙醇（體積比 24 :1)中再次抽提除去雜蛋白，4°C下12000rpm離心10min，再取上清并加入2倍體積無水 乙醇和1/10體積的ρΗ5· 23M NaAc，_70°C沉淀lh，4°C下13500rpm離心20min，棄上清，再 用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。
[0047] 根據(jù)嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I全基因組測序及基因注釋分析SGNH家族酯酶基因 EstDl并設(shè)計(jì)表達(dá)引物EstF和EstR :
[0048] 上游引物 EstF: 5 ' -CGCTTAGAAGCAAACAGCAAAC-3 ' ；
[0049] 下游引物EstR:5'-GCATTGCGAGCCAATTTCGC-3'；
[0050] 上游引物 T7:5 ' -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ' ；
[0051] 下游引物 T7ter:5' -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' ；為 PCR 檢測陽性克隆子引物。
[0052] 以嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為： 95°C預(yù)變性5min ;然后95°C變性30sec ;57°C退火（每個循環(huán)降0.5°C )30sec ;72°C延伸 Imin ;30個循環(huán)后95°C變性30sec ;43°C退火30sec ;72°C延伸Imin ;7個循環(huán)后72°C保溫 10min。取4μLPCR產(chǎn)物與lμL表達(dá)載體pEASYTM-E2進(jìn)行T-A連接，25°C連接10min，連接 產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入Trans-I感受態(tài)細(xì)胞中，37 °C溫箱過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，使 用引物EstF和T7ter進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增篩選正向連接的陽性克隆子。對菌落PCR驗(yàn)證正確 的克隆子采用T7和T7ter引物測序，由北京華大基因測序完成。測序正確的陽性克隆子接 種提取質(zhì)粒 pEASY?-E2-EstDl，取 0· IuL pEASY?-E2-EstDl 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 IOOyL BL21(DE3) 表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amplr的LB固體平板上，37°C溫箱過夜培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化板上挑取 幾株單菌落，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3) / EstDl0
[0053] 實(shí)施例2 :重組SGNH家族酯酶EstDl的制備
[0054] 取含有重組質(zhì)粒pEASY?-E2-EstDl的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?-E2的空 質(zhì)粒BL21 (DE3)菌株，以0. 1 %的接種量接種于LB (含100 μ g/mL Amp1O培養(yǎng)液中，37°C快 速振蕩16h。然后將此活化的菌液以1 %接種量接種到新鮮的LB(含100 μ g/mL Amp1O培 養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2 - 3h (OD6c?達(dá)到0. 4-0. 6)后，加入終濃度0. 7mM的IPTG進(jìn)行誘 導(dǎo)，于20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h。12000rpm離心10min，收集菌體。用適量的pH7. 0檸檬 酸-Na2HPO4緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液經(jīng) 12, OOOrpm離心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結(jié) 果（圖1)表明，重組SGNH家族酯酶在大腸桿菌中得到了表達(dá)，經(jīng)Nickel-NTA Agarose純 化后為單一條帶。
[0055] 實(shí)施例3 :純化的重組SGNH家族酯酶EstDl的性質(zhì)測定
[0056] (1)重組SGNH家族酯酶EstDl的活性分析
[0057] 純化的重組SGNH家族醋酶EstDl采用對硝基苯酷法（p-nitrophenol)進(jìn)行活性 測定：取4只1.5mL離心管，分別編號1、2、3、4,其中1、2、3號試管為實(shí)驗(yàn)組（3個重復(fù)），4 號為對照組。向四只離心管中分別加入420 μ L pH8. 0的50mM Tris-HCL緩沖液和30 μ L 1〇禮底物口即(：2,37°〇預(yù)熱51^11后，每隔1〇8分別向1、2和3號管中加入5(^1^稀釋適當(dāng) 倍數(shù)的酶液，4號對照管加等量水，37°〇反應(yīng)511^11后每隔10 8向1、2、3實(shí)驗(yàn)管中加入501^ 0.1 M Na2CO3終止反應(yīng)，4號對照管同樣加入等體積終止液后立即將4只離心管插到冰上，酶 標(biāo)儀405nm讀取OD值。1個酶活單位（U/mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物卩即(： 2生 成I μ m〇L對硝基苯酚所需要的酶量。以PNPC4為底物測定方法及酶活力計(jì)算同pNPC 2。
[0058] (2)重組SGNH家族酯酶EstDl的最適溫度和熱穩(wěn)定性的測定
[0059] 酶的最適溫度測定：將SGNH家族酯酶EstDl在50mM pH8. 5的Tris-HCL緩沖液 條件下，分別在 20°〇、30°〇、37°〇、40°〇、50°〇、60°〇、65°〇、70°〇、80°〇、90°〇下進(jìn)行酶促反應(yīng)。 溫度穩(wěn)定性的測定：將SGNH家族酯酶EstDl在50mM pH8. 5的Tris-HCL緩沖液條件下，在 37°C、50°C和65°C三個溫度下分別保溫5min、10min、20min、30min和60min后進(jìn)行酶促反 應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以PNPC 2為底物，反應(yīng)5min，測定純化SGNH家族酯酶EstDl 的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：EstDl的最適溫度65°C (圖2);在37°C下保溫60min，基本保持穩(wěn) 定，在50°C和65°C下保溫60min后，酶活均保持在50%以上（圖3)，說