腺激素相關(guān)肽，它們轉(zhuǎn)而又刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生KGF，且因此存在雙旁分泌環(huán)路。此外，單獨培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞的IL-1表達相對較弱，但當(dāng)與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)時，展示出IL-1和c-Jun的表達增加。因此，摻入皮膚底物中的成纖維細(xì)胞對產(chǎn)生ECM和刺激性生長因子起作用，從而提供最佳環(huán)境以支持表皮形成并有利于創(chuàng)傷愈合。
[0039]成纖維細(xì)胞密度是考慮正常表皮形態(tài)的發(fā)展和角質(zhì)細(xì)胞分化的重要因素，并且最佳密度仍需建立。部分地通過產(chǎn)生IV型和VII型膠原蛋白、層粘連蛋白5和巢蛋白，而且還通過分泌刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生基底膜組分的細(xì)胞因子，成纖維細(xì)胞還有助于基底膜形成。由成纖維細(xì)胞分泌的TGF-β誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞合成IV型和VII型膠原蛋白。
[0040]新血管化和淋巴管生成也是用于維持正常皮膚體內(nèi)平衡和創(chuàng)傷愈合的重要過程，成纖維細(xì)胞對此具有重要旁分泌作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族的成員包括VEGF-A、VEGF-B, VEGF-C和VEGF-D，它們由正常人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，并且對通過特異性受體來調(diào)控血管和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖而言十分重要。VEGF-A已知涉及活化能夠進行血管發(fā)生的固有內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞；VEGF-B的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的能力較弱，而VEGF-C和VEGF-D具有相同受體特異性，結(jié)合至VEGF受體2(VEGF-R2)以介導(dǎo)血管生成并且結(jié)合至VEGF-R3以影響淋巴管生成。
[0041]FGF-1促進身體自身粘連組織發(fā)展并有效密封創(chuàng)面，從而阻礙感染和緩解疤痕形成。由于構(gòu)成結(jié)締組織的膠原蛋白的穩(wěn)定性質(zhì)，使用FGF來刺激成纖維細(xì)胞活性是密封組織的有效途徑。為了將組織密封到一起，人身體使用膠原蛋白和彈性蛋白來獲得優(yōu)良剪切強度。I型膠原蛋白具有增加其結(jié)構(gòu)完整性的獨特三螺旋結(jié)構(gòu)，所述I型膠原蛋白包括捆綁成強纖絲的膠原蛋白股束。
[0042]以下實施例旨在說明，而并不限制本發(fā)明。
[0043]實施例1
[0044]用于人皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)增殖的高通量增殖篩選測定
[0045]對于所述增殖測定，將人皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)在DMEM(Gibco) 15 %FBS (HyClone)中以I，000個細(xì)胞/孔，接種到96孔黑色/透明底組織培養(yǎng)物處理板(Corning)中。在第二天，用小分子文庫(Torcris 1120B1logically Active Compounds)在2.5 μΜ最終濃度下處理細(xì)胞。處理3天之后，固定細(xì)胞，用DAPI染色，并且使用RocheCellavista高容量成像系統(tǒng)(參見圖1)分析。
[0046]根據(jù)所述高通量增殖篩選測定，發(fā)現(xiàn)ΑΒΤ702 二鹽酸鹽(腺苷激酶拮抗劑)、非諾班(mGlu5受體拮抗劑)和SX Oil (p38MAPK拮抗劑)在200nM濃度下誘導(dǎo)hDF的最高增殖水平(參見圖2)。
[0047]實施例2
[0048]用于FGF7產(chǎn)生的高通量篩選測定
[0049]對于FGF7 產(chǎn)生測定，將 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 補充物(Invitrogen)中以19，000個細(xì)胞/孔，接種到96孔透明組織培養(yǎng)物處理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文庫(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最終濃度下處理細(xì)胞。處理3天之后，收集上清液并且使用FGF7人ELISA試劑盒(Abcam)并且用B1Tek Synergy2多檢測功能微板讀數(shù)器(參見圖1)分析FGF7含量。
[0050]根據(jù)用于FGF7產(chǎn)生測定的高通量篩選測定，發(fā)現(xiàn)25 μ M濃度的前列腺素&在hDF中誘導(dǎo)FGF7的最高產(chǎn)生水平(參見圖3)。
[0051]實施例3
[0052]用于TGF β I產(chǎn)生的高通量篩選測定
[0053]對于TGF β I 產(chǎn)生測定，將 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 補充物(Invitrogen)中以19，000個細(xì)胞/孔，接種到96孔透明組織培養(yǎng)物處理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文庫(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M最終濃度下處理細(xì)胞。處理3天之后，收集上清液并且使用TGFI3 I人ELISA試劑盒(Abcam)并且用B1TekSynergy 2多檢測功能微板讀數(shù)器(參見圖1)分析TGF β I含量。
[0054]根據(jù)用于TGF β I產(chǎn)生測定的高通量篩選測定，發(fā)現(xiàn)24ηΜ濃度的Proxyfan草酸鹽(組胺H3受體信號傳導(dǎo)激動劑)、24nM濃度的m-3M3FBS (磷脂酶C信號傳導(dǎo))、1.6 μ M濃度的KB-R7943甲磺酸鹽和98ηΜ濃度的LY294002鹽酸鹽在hDF中誘導(dǎo)TGF β I的最高產(chǎn)生水平(參見圖4)。
[0055]實施例4
[0056]用于EGF產(chǎn)生的高通量篩選測定
[0057]對于EGF 產(chǎn)生測定，將 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 補充物(Invitrogen)中以19，000個細(xì)胞/孔，接種到96孔透明組織培養(yǎng)物處理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文庫(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最終濃度下處理細(xì)胞。處理3天之后，收集上清液并且使用EGF人ELISA試劑盒(Abcam)并且用B1Tek Synergy2多檢測功能微板讀數(shù)器(參見圖1)分析EGF含量。
[0058]根據(jù)用于EGF產(chǎn)生測定的高通量篩選測定，發(fā)現(xiàn)25 μ M和12，5 μ M濃度的⑶437和CD 1530 (類視黃醇RAR信號傳導(dǎo)激動劑)、12.5 μ M濃度的CY 208-243 (多巴胺Dl受體激動劑)和12.5 μ M濃度的PSB 06126 (NTPDase 3拮抗劑)在hDF中誘導(dǎo)EGF的最高產(chǎn)生水平(參見圖5)。
[0059]實施例5
[0060]用于I型膠原蛋白產(chǎn)生的高通量篩選測定
[0061]對于I型膠原蛋白產(chǎn)生測定，將hDF在DMEM(Gibco) IX N2補充物(Invitrogen)中以5，000個細(xì)胞/孔，接種到96孔透明組織培養(yǎng)物處理板(Falcon)。在第二天，用小分子文庫(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最終濃度下處理細(xì)胞。處理3天之后，收集上清液并且使用IC型原膠原蛋白-肽EIA試劑盒(Takara)并且用B1Tek Synergy 2多檢測功能微板讀數(shù)器分析I型膠原蛋白含量(參見圖1)。
[0062]根據(jù)用于I型膠原蛋白測定的高通量篩選測定，發(fā)現(xiàn)390nM濃度的雙嘧達莫(腺苷轉(zhuǎn)運抑制劑)、390nM濃度的甲基牛扁亭檸檬酸鹽(α 7神經(jīng)元煙堿酸受體拮抗劑)、
6.25 μ M濃度的西洛他唑(PDE3A拮抗劑)、780ηΜ濃度的克立馬丁延胡索酸鹽(Η4受體拮抗劑)和97.5ηΜ濃度的WIN 64338 (緩激肽Β2受體拮抗劑)在hDF中誘導(dǎo)最高產(chǎn)生水平(參見圖1)。
[0063]雖然已參考上述實例描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解修改和變型涵蓋在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受以上權(quán)利要求書限制。
【主權(quán)項】
1.一種誘導(dǎo)受試者的體外或體內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將有效量的誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的小分子施用于受試者。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者為人。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述成纖維細(xì)胞為人皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述小分子選自由SL327、ABT 702、非諾班、SX011、毒扁豆堿半硫酸鹽和NBQX組成的組。5.一種增加受試者的蛋白質(zhì)分泌的方法，所述方法包括將有效量的增加蛋白質(zhì)分泌的小分子施用于受試者。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述受試者為人。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述成纖維細(xì)胞為人皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自由EGF、FGF7、KGF、TGFβ和膠原蛋白組成的組。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述小分子選自由以下組成的組:CY208-243,CD439、T 0156 鹽酸鹽、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 鹽酸鹽、KB-R7943 甲磺酸鹽、proxyfan草酸鹽、m_3M3FBS、雙嘧達莫、甲基牛扁亭檸檬酸鹽、WIN 64338、克立馬丁延胡索酸鹽和西洛他唑。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為EGF并且所述小分子選自由CY208-243、CD 439、T 0156 鹽酸鹽、CD 1530 和 PSB 06126 組成的組。11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為FGF7/KGF并且所述小分子為前列腺素E2。12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為TGFI3并且所述小分子選自由LY294002鹽酸鹽、KB-R7943甲磺酸鹽、proxyfan草酸鹽和m_3M3FBS013.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為膠原蛋白I并且所述小分子選自由雙嘧達莫、甲基牛扁亭檸檬酸鹽、WIN 64338、克立馬丁延胡索酸鹽和西洛他唑組成的組。14.一種促進皮膚再生的方法，所述方法包括將有效量的誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的化合物施用于受試者。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受試者為人。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述成纖維細(xì)胞為皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述小分子選自由SL327、ABT702、非諾班、SX011、毒扁豆堿半硫酸鹽和NBQX組成的組。18.—種促進皮膚再生的方法，所述方法包括將有效量的增加蛋白質(zhì)分泌的化合物施用于受試者。19.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自由EGF、FGF7/KGF、TGFβ和膠原蛋白組成的組。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自由以下組成的組:CY208-243、CD 439、T 0156 鹽酸鹽、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 鹽酸鹽、KB-R7943 甲磺酸鹽、proxyfan草酸鹽、m_3M3FBS、雙嘧達莫、甲基牛扁亭檸檬酸鹽、WIN 64338、克立馬丁延胡索酸鹽和西洛他唑。
【專利摘要】本文提供小分子，所述小分子用于誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)分泌或產(chǎn)生增加。本文所述的小分子可用于促進皮膚再生。本文還提供促進皮膚再生和創(chuàng)傷愈合的方法。本發(fā)明大體涉及皮膚再生和創(chuàng)傷愈合，并且更具體地說涉及皮膚人成纖維細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生增加的小分子介導(dǎo)的誘導(dǎo)。
【IPC分類】C12N5/07
【公開號】CN104903439
【申請?zhí)枴緾N201480004046
【發(fā)明人】R·岡薩雷斯, M·帕斯特沃伊托夫, R·斯莫茨肯
【申請人】國際干細(xì)胞公司
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2014年1月8日
【公告號】EP2943564A2, US20140309195, WO2014110177A2, WO2014110177A3