專利名稱：一種純化重組人胰島素原的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種純化重組人胰島素原的方法，特別涉及了一種利用大孔吸附樹脂和陽離子交換樹脂純化重組人胰島素原的方法。
背景技術：
胰島素是至今仍無法替代的針對糖尿病的特效藥，現(xiàn)在全球的糖尿病患者超過 1. 2億，并且每年這個數(shù)字都在遞增，預計到2025年為3億，每個糖尿病患者每天需要使用胰島素1. 5 2. 0毫克，全球每年要消耗胰島素5000公斤左右。因此研發(fā)低成本大規(guī)模制備胰島素的方法勢在必行。胰島素是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、 胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素。目前眾多專利中，公開了大量胰島素衍生物或類似物以及相應的制法(CN1043719A，CN1068501A, CN1126761A, CN1126761A, CN1175106C, CN1247616C)，這些制法分為直接化學合成法和基因重組法，基因重組法包括利用大腸桿菌的包涵體制備方法(CN1059703C，ZL98812757. 1， CN1663960A等)和利用酵母細胞的分泌制備方法(CN100432104C，CN1873006A, CN101029077B 等)。在制備胰島素的過程中，胰島β細胞先合成一個大分子的前胰島素原，然后加工成86肽的胰島素原，再經(jīng)水解而成為胰島素。胰島素原包含組成胰島素的Α、Β鏈和一條在加工成成熟的胰島素過程中被切除的C肽，構(gòu)型如下前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg_A。中國發(fā)明專利申請CN101717442A公開了聚乙二醇化重組人DesB30胰島素及其制備方法和應用的技術方案，該技術方案中重組表達載體的宿主細胞為畢赤酵母，而關于胰島素原的純化方法為發(fā)酵液過濾后經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后用60%的乙醇洗脫，然后經(jīng)強陽離子交換層析進一步純化，純化后再經(jīng)過氯化鋅沉淀，收集胰島素原沉淀重新溶解后用于酶切得到胰島素，該方案制備胰島素原的生產(chǎn)工藝較繁瑣，胰島素原最終以沉淀的形式存在，不利于酶切步驟的直接進行。中國發(fā)明專利說明書CN88102311.6公開了一種人結(jié)晶胰島素原及其生產(chǎn)方法， 該技術方案首先在含有人胰島素原溶液中加入陽離子鹽，再調(diào)節(jié)PH為5. 4 6. 5，使晶體生成，然后回收結(jié)晶的人胰島素原，該方法雖然簡化了生產(chǎn)工藝，但是產(chǎn)品收率低，而且胰島素原仍舊以沉淀形式存在。中國發(fā)明專利說明書ZL98812757. 1公開了人胰島素原的制備方法，該技術方案為包涵體先經(jīng)過溶解和磺化，再經(jīng)過溴化氰處理和離子交換層析純化后復性，重折疊正確的人胰島素原經(jīng)吸附色譜層析，然后經(jīng)氯化鋅沉淀得到以沉淀形式存在的人胰島素原，可以獲得90%的產(chǎn)率，該方法生產(chǎn)工藝復雜，產(chǎn)品仍以沉淀形式存在。以上所公開的方法中操作工藝復雜，胰島素的前體胰島素原最終以沉淀的形式存在，不利于后續(xù)酶切步驟直接操作，工藝銜接性差，而且胰島素原的收率和純度不能同時兼顧。因此，需要開發(fā)一種純化效率高、銜接性好，而且更為簡便有效的工藝來制備胰島素原， 以利于大規(guī)模制備胰島素。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，簡化大腸桿菌發(fā)酵重組人胰島素原純化步驟， 提高胰島素原的收率和純度，增強工藝間的銜接性，發(fā)明人利用重組人胰島素原可以被大孔吸附樹脂吸附濃縮，并且在酸性條件下可被陽離子交換樹脂吸附，而在堿性條件下解吸附的特點。本發(fā)明提供了一種純化重組人胰島素原的方法，包括大孔吸附樹脂層析和陽離子交換樹脂層析。首先，將含有重組人胰島素原基因的大腸桿菌工程菌經(jīng)發(fā)酵、離心、破菌，收集到包涵體后洗滌，溶解后復性得到重組人胰島素原復性液。本發(fā)明中大孔吸附樹脂層析具體步驟為用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0)平衡大孔吸附樹脂，將重組人胰島素原復性液(鹽酸調(diào)pH為3. 0 5. 0)上樣至大孔吸附樹脂層析柱，上樣流速為200 500cm/h， 再用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0)清洗5 10個柱體積，清洗流速為200 500cm/ h，最后用濃度為65% 95%的乙醇(乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0)解吸附洗脫，洗脫流速為 50 200cm/h，收集解吸附洗脫液。本發(fā)明對大孔吸附樹脂類型進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述大孔吸附樹脂為D-101、 D1300、X-5型大孔吸附樹脂，更優(yōu)選為D-101型大孔吸附樹脂。本發(fā)明對大孔吸附樹脂層析柱的徑高比進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述層析柱的徑高比為1 5 20，更優(yōu)選為1 10 15。本發(fā)明對平衡大孔吸附層析所用去離子水的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述去離子水的PH為3. 5 4.0。本發(fā)明對重組人胰島素原復性液的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述重組人胰島素原復性液的pH為3. 5 4. 0。本發(fā)明對大孔吸附樹脂層析的上樣流速進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述上樣流速為 300 400cm/ho本發(fā)明對清洗大孔吸附樹脂層析所用去離子水的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述去離子水的PH為3. 5 4.0。本發(fā)明對大孔吸附樹脂層析的清洗流速進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述清洗流速為 300 400cm/ho本發(fā)明對大孔吸附樹脂層析的洗脫流速進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫流速為 100cm/ho本發(fā)明對解吸附洗脫的乙醇濃度進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述乙醇的濃度為85% 95%。本發(fā)明對解吸附洗脫的乙醇pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述乙醇的pH為3. 5 4.0。本發(fā)明中陽離子交換樹脂層析的具體步驟為大孔吸附樹脂層析得到的解吸附洗脫液與去離子水等體積混合后用鹽酸調(diào)pH為 5. 0 7. 0，室溫靜置1 2小時后出現(xiàn)絮狀沉淀，離心取上清液并用鹽酸復調(diào)pH為3. 0 5. 0。先用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0)平衡陽離子交換樹脂，將pH為3. 0 5. 0的上清液上樣至陽離子交換樹脂層析柱，上樣流速為50 200cm/h，再用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0)清洗5 10個柱體積，清洗流速為50 200cm/h，最后用pH為8. 5 10. 5,0. lmol/L的碳酸氫銨洗脫，洗脫流速為50 200cm/h，收集洗脫液。本發(fā)明對陽離子交換樹脂的填料進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述陽離子交換樹脂的填料為 SP Sepharose Fast Flow。本發(fā)明對解吸附洗脫液與去離子水混合后的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述解吸附洗脫液與去離子水混合后用鹽酸調(diào)pH為5. 0 6. 0。本發(fā)明對用鹽酸復調(diào)所得的上清液的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述上清液的pH為 3. 5 4. O0本發(fā)明對平衡陽離子交換層析所用去離子水的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述去離子水的PH為3. 5 4.0。本發(fā)明對清洗陽離子交換樹脂層析所用去離子水的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述去離子水的PH為3. 5 4.0。本發(fā)明對陽離子交換樹脂層析的上樣流速進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述上樣流速為 100cm/ho本發(fā)明對陽離子交換樹脂層析的清洗流速進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述清洗流速為 100cm/ho本發(fā)明對碳酸氫銨的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述碳酸氫銨的pH為9. 0 10. 0。本發(fā)明對陽離子交換樹脂層析的洗脫流速進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫流速為 100cm/ho本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下突出的優(yōu)點本發(fā)明提供的純化方法利用大孔吸附樹脂層析對重組人胰島素原的高效吸附和解吸附，解決了復性液體積大帶來的純化收率低的問題，同時使用陽離子交換樹脂層析有效地將解吸附緩沖液置換成了下步酶切工藝的緩沖體系，并且通過優(yōu)化清洗和洗脫條件， 有效地去除了雜質(zhì)，通過本發(fā)明的技術方案獲得的胰島素原收率達到90%以上，純度在 95%以上，而且通過本發(fā)明得到的胰島素原可以直接進行酶切工藝操作，保證了工藝銜接性，該工藝操作簡便，降低了生產(chǎn)成本，有利于胰島素的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式以下通過具體實施例進一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實施例。實施例1、重組人胰島素原復性液的制備含有重組人胰島素原基因的大腸桿菌工程菌，經(jīng)高密度細胞發(fā)酵后離心得菌體約 17. ^g，菌體經(jīng)均質(zhì)后離心得到以包涵體形式存在的重組人胰島素原，包涵體經(jīng)洗滌后在變性條件下溶解，然后復性，得到約500L復性液。實施例2、大孔吸附樹脂層析純化裝填D-101大孔吸附樹脂至玻璃層析柱(徑高比為1 15)，去離子水(乙酸調(diào) PH為3. 5)平衡層析介質(zhì)，按照實施例1得到的復性液(鹽酸調(diào)pH為3. 5)共約500L經(jīng)蠕動泵上樣，保持上樣流速為300cm/h，上樣完畢后用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 5)清洗5 10個柱體積，清洗流速為300cm/h，接著用95%的乙醇(乙酸調(diào)pH為3. 5)進行洗脫，洗脫流速保持為lOOcm/h，收集得到約11. 8L洗脫液。實施例3、大孔吸附樹脂層析純化裝填AB-8大孔吸附樹脂至玻璃層析柱(徑高比為1 20)，去離子水(乙酸調(diào)pH 為5. 0)平衡層析介質(zhì)，按照實施例1得到的復性液(鹽酸調(diào)pH為5. 0)共約500L經(jīng)蠕動泵上樣，保持上樣流速為200cm/h，上樣完畢后用去離子水(乙酸調(diào)pH為5. 0)清洗5 10 個柱體積，清洗流速為200cm/h，接著用65%的乙醇(乙酸調(diào)pH為5. 0)進行洗脫，洗脫流速保持為50cm/h，收集得到約12. 5L洗脫液。實施例4、大孔吸附樹脂層析純化裝填D1300大孔吸附樹脂至玻璃層析柱(徑高比為1:5)，去離子水(乙酸調(diào)pH 為3. 0)平衡層析介質(zhì)，按照實施例1得到的復性液(鹽酸調(diào)pH為3. 0)共約500L經(jīng)蠕動泵上樣，保持上樣流速為400cm/h，上樣完畢后用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 0)清洗5 10 個柱體積，清洗流速為400cm/h，接著用75%的乙醇(乙酸調(diào)pH為3. 0)進行洗脫，洗脫流速保持為200cm/h，收集得到約13. IL洗脫液。實施例5、大孔吸附樹脂層析純化裝填X-5大孔吸附樹脂至玻璃層析柱(徑高比為1 10)，去離子水(乙酸調(diào)pH 為4. 0)平衡層析介質(zhì)，按照實施例1得到的復性液(鹽酸調(diào)pH為4. 0)共約500L經(jīng)蠕動泵上樣，保持上樣流速為500cm/h，上樣完畢后用去離子水(乙酸調(diào)pH為4. 0)清洗5 10 個柱體積，清洗流速為500cm/h，接著用85%的乙醇(乙酸調(diào)pH為4. 0)進行洗脫，洗脫流速保持為lOOcm/h，收集得到約12. IL洗脫液。實施例6、陽離子交換樹脂層析大孔吸附樹脂層析得到的解吸附洗脫液與去離子水等體積混合后用鹽酸調(diào)節(jié)pH 為5. 0，室溫靜置1 2小時后出現(xiàn)絮狀沉淀，以8000rpm，室溫離心后取上清液，并用鹽酸復調(diào)上清液的PH為3. 5。用直徑為10cm，高度為30cm的軸向壓縮玻璃層析柱裝填SP sepharose Fast Flow 樹脂，用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 5)平衡層析介質(zhì)，pH為3. 5的上清液經(jīng)蠕動泵上樣，上樣流速為lOOcm/h，上樣完畢后用去離子水(乙酸調(diào)pH為3. 5)清洗5 10個柱體積，清洗流速為lOOcm/h，接著用0. lmol/L碳酸氫銨(氫氧化鈉調(diào)pH為9. 0)進行洗脫，洗脫流速保持為lOOcm/h，收集得到約13. 2L洗脫液，檢測得重組人胰島素原收率為91. 2%，純度為 96. 9%。實施例7.陽離子交換樹脂層析大孔吸附樹脂層析得到的解吸附洗脫液與去離子水等體積混合后用鹽酸調(diào)pH為 6. 0，室溫靜置1 2小時后出現(xiàn)絮狀沉淀，以8000rpm，室溫離心后取上清液并用鹽酸復調(diào)上清液的PH為4. 0 ；用直徑為10cm，高度為30cm的軸向壓縮玻璃層析柱裝填SP sepharose Fast Flow 樹脂，用乙酸調(diào)pH為4. 0的去離子水平衡陽離子交換樹脂，將pH為4. 0的上清液上樣至陽離子交換樹脂層析柱，上樣流速為50cm/h，上樣完畢后用去離子水(乙酸調(diào)pH為4. 0) 清洗5 10個柱體積，清洗流速為50cm/h，再用0. lmol/L的碳酸氫銨(氫氧化鈉調(diào)pH為 8. 5)洗脫，洗脫流速為50cm/h，收集洗脫液，檢測得重組人胰島素原收率為90. 3%，純度為 95. 8%。
實施例8.陽離子交換樹脂層析大孔吸附樹脂層析得到的解吸附洗脫液與去離子水等體積混合后用鹽酸調(diào)pH為 7. 0，室溫靜置1 2小時后出現(xiàn)絮狀沉淀，以8000rpm，室溫離心后取上清液并用鹽酸復調(diào)上清液的PH為5. 0 ；用直徑為10cm，高度為30cm的軸向壓縮玻璃層析柱裝填SP Sepharose Fast Flow 樹脂，用乙酸調(diào)PH為5. 0的去離子水平衡陽離子交換樹脂，將pH為5. 0的上清液上樣至陽離子交換樹脂層析柱，上樣流速為200cm/h，再用乙酸調(diào)pH為5. 0的去離子水清洗5 10個柱體積，清洗流速為200cm/h，最后用0. lmol/L的碳酸氫銨(氫氧化鈉調(diào)pH為10. 5)洗脫， 洗脫流速為200cm/h，收集洗脫液，檢測得重組人胰島素原收率為90. 5%，純度為97. 0%。實施例9.陽離子交換樹脂層析大孔吸附樹脂層析得到的解吸附洗脫液與去離子水等體積混合后用鹽酸調(diào)pH為 5. 0，室溫靜置1 2小時后出現(xiàn)絮狀沉淀，以8000rpm，室溫離心后取上清液并用鹽酸復調(diào)上清液的PH為3. 0 ；用直徑為10cm，高度為30cm的軸向壓縮玻璃層析柱裝填SP Sepharose Fast Flow 樹脂，用乙酸調(diào)PH為3. 0的去離子水平衡陽離子交換樹脂，將pH為3. 0的上清液上樣至陽離子交換樹脂層析柱，上樣流速為lOOcm/h，再用乙酸調(diào)pH為3. 0的去離子水清洗5 10 個柱體積，清洗流速為lOOcm/h，最后用0. lmol/L的碳酸氫銨(氫氧化鈉調(diào)pH為10)洗脫， 洗脫流速為lOOcm/h，收集洗脫液，檢測得重組人胰島素原收率為91. 5%，純度為96. 3%。
權(quán)利要求
1.一種純化重組人胰島素原的方法，其特征在于包含以下步驟，a.大孔吸附樹脂層析用乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0的去離子水平衡大孔吸附樹脂，將鹽酸調(diào)pH為3. 0 5. 0的重組人胰島素原復性液上樣至大孔吸附樹脂層析柱，上樣流速為200 500cm/h，再用乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0的去離子水清洗5 10個柱體積，清洗流速為200 500cm/h，最后用乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0、濃度為65% 95%的乙醇解吸附洗脫，洗脫流速為50 200cm/ h，收集解吸附洗脫液；b.陽離子交換樹脂層析大孔吸附樹脂層析得到的解吸附洗脫液與去離子水等體積混合后用鹽酸調(diào)PH為 5. 0 7. 0，室溫靜置1 2小時后出現(xiàn)絮狀沉淀，離心取上清液并用鹽酸復調(diào)pH為3. 0 5. 0 ；先用乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0的去離子水平衡陽離子交換樹脂，將pH為3. 0 5. 0的上清液上樣至陽離子交換樹脂層析柱，上樣流速為50 200cm/h，再用乙酸調(diào)pH為3. 0 5. 0的去離子水清洗5 10個柱體積，清洗流速為50 200cm/h，最后用pH為8. 5 10. 5、 0. lmol/L的碳酸氫銨洗脫，洗脫流速為50 200cm/h，收集洗脫液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述大孔吸附樹脂為D-101、 AB-8、D1300、X-5型大孔吸附樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述大孔吸附樹脂層析柱的徑高比為1 5 20。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中大孔吸附樹脂層析上樣、清洗過程中的流速為300 400cm/h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中大孔吸附樹脂層析洗脫過程中的流速為100cm/h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中從大孔吸附樹脂上解吸附洗脫的乙醇濃度為85% 95%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中層析柱填料為SPSepharose FastFlow0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中的上樣、清洗、洗脫過程中的流速為 100cm/h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中洗脫過程中碳酸氫銨的pH為 9. 0 10. O0
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種重組人胰島素原的純化方法，特別涉及一種利用大孔吸附樹脂和陽離子交換樹脂純化重組人胰島素原的方法。本發(fā)明將重組人胰島素原復性液通過大孔吸附樹脂吸附濃縮，后上樣至陽離子交換樹脂進一步純化，收集的胰島素原不僅收率和純度高，而且可直接用于酶切從而得到胰島素。本方法操作簡便，工藝銜接性好，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/36GK102532257SQ20101058436
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者熊繼元, 趙志全 申請人:魯南制藥集團股份有限公司