專利名稱：：一種長期保藏微生物菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物菌種保藏方法，主要涉及酵母菌、芽胞桿菌、曲霉菌種的長期保藏方法。
背景技術(shù)：
：目前微生物菌種通常采用斜面定期移植保藏法、液體石蠟保藏法、冷凍干燥、液氮超低溫保藏、-8(TC低溫冷凍保藏。低溫條件下保藏可減緩微生物菌種的代謝活動，抑制其繁殖速度，達到減少菌株突變，延長菌種保藏時間的目的。斜面定期移植保藏法通常是釆用在帶棉塞的玻璃試管內(nèi)，用少于l/3管的無菌的固體培養(yǎng)基擺成斜面，中央劃線的接種方法，在28-30。C培養(yǎng)2-3天后，置于冰箱內(nèi)4。C保藏，這種方法是用于微生物菌種的主要保藏方法，優(yōu)點是操作簡單，缺點是斜面培養(yǎng)基與空氣接觸面大，脫水較快，一般在半年內(nèi)就會干縮；棉塞容易吸水變潮，容易導致菌種染菌；保藏溫度較高，酵母菌種仍有一定的代謝活動，可進行繁殖，為了防止菌種死亡，通常3-4個月就應該傳代轉(zhuǎn)管；加大了菌種保藏的工作量；由于菌種傳代頻繁，菌種變異頻率較高，需要對菌種定期的分離復壯，給菌種的保藏帶來較高的技術(shù)要求和較大的工作量。液體石蠟保藏法是定期移植保藏法的輔助方法。在液體石蠟覆蓋下，菌種的生物代謝受到抑制，細胞老化被推遲。此方法可阻止氧氣進入，使好氣菌不能繼續(xù)生長，也可防止因培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)而引起的菌體死亡，達到延長菌種保藏時間的目的。該方法優(yōu)點是菌種保藏時間長，一般2-10年不等。缺點是只適應于不能分解液體石蠟的微生物菌種的保藏；菌種保藏時必須用試管架豎直擺放，保藏占用的空間較大，保藏場所應保持干燥，防止棉塞污染；整個操作比較繁瑣。冷凍干燥法是將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細胞的生理活動趨于停止，從而長期維持存活狀態(tài)。氮超低溫保藏是將菌種保藏在-196C的液態(tài)氮，或在-15(TC的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-13(TC以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。-80。C低溫冷凍保藏是將菌種保藏在-8(TC冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。上述三種方法都能較好地保藏微生物菌種，保藏周期長，變異頻率低，缺點是操作復雜，技術(shù)含量高，設(shè)備投入高，運行成本高，只適合專業(yè)保藏機構(gòu)使用，不適合生產(chǎn)企業(yè)使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是針對上述保藏方法所存在的缺陷，提供一種適用于生產(chǎn)企業(yè)，保藏時間長又操作簡單實用、菌種質(zhì)量穩(wěn)定可靠，保藏成本低的微生物菌種保藏方法。本發(fā)明所述微生物菌種保藏方法如下1、培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的重量配比玉米面40-70%，麩皮5-30%，豆粕粉15_35%,料水配比為1:0.8-1.2。2、培養(yǎng)基分裝與滅菌按上述配量將培養(yǎng)基物料與水混合，分裝于試管中，通常試管中裝量為1/3-2/3，塞好棉塞，高壓滅菌，1.0-1.2atm，30-45min,取出趁熱搖散，冷卻備用；3、接種與培養(yǎng)在無菌條件下接入1-2環(huán)菌種(0.1-0.2ml)，用接種針攪勻，松散水平放入培養(yǎng)箱中26-3(TC培養(yǎng)2-3天。4、干燥與保藏在40-45匸條件下干燥2-3天，使物料水份控制在<6%,用牛皮紙包好，放至冰箱中l(wèi)-4t:冷藏或-16~-2(TC冷凍保存，保藏期達到35年。5、菌種復蘇方法將所保藏試管中的物料顆粒，在無菌條件下轉(zhuǎn)入到新鮮斜面培養(yǎng)基上數(shù)粒,放到培養(yǎng)箱中進行適溫培養(yǎng)即可。本發(fā)明優(yōu)選的培養(yǎng)基重量配比為玉米面50~60%,麩皮15~20%，豆粕粉25~30°/。，料水配比1:0.g~1.0。本發(fā)明首先選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基及培養(yǎng)條件讓微生物在培養(yǎng)物中生長，然后在較溫和的條件下將菌種脫水干燥，由于菌種細胞中含水量很低，可放入冰箱中冷藏或冷凍保藏。此方法是將斜面試管保藏、冷凍干燥保藏、和低溫保藏結(jié)合起來的一種保藏方法。本法保藏微生物菌種，4'C冷藏可保藏3-4年，-18°C冷凍可保藏4-5年。此方法設(shè)備投入少，在普通的冰箱就能實現(xiàn)菌種長期保藏，實用性強，具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、成本低廉、保藏期長的特點。具體實施方式實施例1培養(yǎng)基的配制玉米面60%，麩皮15%，豆粕粉25%，料水比1:0.85。將原料按上述比例混合，加入定量的水，分裝于試管中，通常試管中裝量為1/3,塞好棉塞，高壓滅菌，1.2atm，3045min，取出趁熱搖散，冷卻備用。在無菌條件下接入1-2環(huán)菌種(0.l-0.2ml),所保藏的菌種如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>用接種針攪勻，松散水平放入培養(yǎng)箱中28-3(TC培養(yǎng)2-3天。在40-45。C條件下干燥2-3天，檢測試管中菌種的細胞數(shù)。用牛皮紙包好,放至冰箱中4'C冷藏保存和-18'C冷凍保存。菌種保藏初始細胞數(shù)測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>-18'C冷凍保藏結(jié)果-181:條件下不同年限菌種保藏存活率(％)單位年<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種長期保藏微生物菌種的方法，其特征在于該保藏方法如下a)培養(yǎng)基的重量配比玉米面40~70%，麩皮5~30%,豆粕粉15~35%,料水配比1:0.8-1.2;b)培養(yǎng)基分裝滅菌按上述配量培養(yǎng)基物料與水混合，分裝入試管，高壓蒸汽滅菌l,2atm，3045min，冷卻備用；c)接種培養(yǎng)于無菌條件下接入1~2環(huán)菌種(0.1~0.2ml)，于培養(yǎng)箱中2630。C培養(yǎng)23天；d)干燥保藏在4045。C條件下干燥2~3天，使水份控制在<6%，包裝置于冰箱中于14'C或-16'C-20'C保藏期達到3~5年。2、按照權(quán)利要求l所述的長期保藏微生物菌種的方法，其特征是用該方法保藏的菌種有酵母菌、芽胞桿菌、曲霉菌種。3、按照樹種要求l所述的長期保藏微生物菌種的方法，其特征是培養(yǎng)基的重量配比選擇為玉米面50~60%，麩皮15~20%，豆粕粉25~30%，料水配比1:0.g~1.0。全文摘要本發(fā)明涉及微生物菌種保藏方法，主要涉及酵母菌、芽胞桿菌、曲霉菌種的長期保藏方法。培養(yǎng)基的重量配比玉米面40～70％，麩皮5～30％，豆粕粉15～35％，料水配比1∶0.8～1.2；培養(yǎng)基分裝滅菌按上述配量培養(yǎng)基物料與水混合，分裝入試管，高壓蒸汽滅菌1.2atm，30～45min，冷卻備用；接種培養(yǎng)于無菌條件下接入1～2環(huán)菌種(0.1～0.2ml)，于培養(yǎng)箱中26～30℃培養(yǎng)2～3天；干燥保藏在40～45℃條件下干燥2～3天，使水份控制在≤6％，包裝置于冰箱中于1～4℃或-16℃～-20℃保藏期達到3～5年。此方法設(shè)備投入少，在普通的冰箱就能實現(xiàn)菌種長期保藏，實用性強，具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、成本低廉、保藏期長的特點。文檔編號C12N1/00GK101121919SQ20071001230公開日2008年2月13日申請日期2007年7月27日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者張慶華,王艷華,趙新海申請人:遼寧省微生物科學研究院