一種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種無血清培養(yǎng)基，屬于生化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞由于具有良好的自我增殖能力和多向分化潛能，在體內(nèi)和體外特定 條件下具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種 成體細(xì)胞分化的能力。已有的研宄表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持作用，而且 易于外源基因?qū)氡磉_(dá)，因此可作為組織工程化骨、軟骨和心肌構(gòu)建中的種子細(xì)胞，基因治 療中重要的載體細(xì)胞，在造血干細(xì)胞移植和器官移植中也具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]由于存在上述需要，如何大規(guī)模的培養(yǎng)和繁殖間充質(zhì)干細(xì)胞是本領(lǐng)域目前關(guān)注的 熱點(diǎn)問題之一。常規(guī)的技術(shù)方案是在實(shí)驗(yàn)室條件下，向培養(yǎng)基中添加胎牛血清使其得到有 效培養(yǎng)。這樣的培養(yǎng)方式會(huì)影響細(xì)胞增殖效率及生物學(xué)性能，而且存在動(dòng)物血清質(zhì)量不佳 導(dǎo)致的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，造成細(xì)胞制品的異種蛋白污染。
[0004] 針對(duì)以上問題，本領(lǐng)域提出的一種解決方案是在將人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)到最后 1~2代時(shí)，將含胎牛血清培養(yǎng)基替換成無血清培養(yǎng)基，但殘留的異種蛋白污染始終存在， 無法徹底去除；另一種解決方案是全程培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基，這就要無血清培養(yǎng)基中具 有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)，導(dǎo)致高品質(zhì)的人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的 成本極高，同時(shí)一旦營養(yǎng)成分配比設(shè)計(jì)不合理就會(huì)使得干細(xì)胞培養(yǎng)失控，使得其難以大規(guī) 模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，也難以調(diào)控人間充質(zhì)干細(xì)胞制品的品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的存在的問題，申請(qǐng)人對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)問題進(jìn)行了深入研 宄，從而發(fā)明了一種無血清培養(yǎng)基，通過改進(jìn)其中的各組分用量和類型，為人間充質(zhì)干細(xì)胞 的生長(zhǎng)培養(yǎng)提供充足的營養(yǎng)，同時(shí)保證其良好的品質(zhì)。
[0006] 具體的說，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以DMEM培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，在DMEM培養(yǎng)液中加入有全營養(yǎng)組分：氨基酸、維生素、蛋白營養(yǎng)素、無機(jī)鹽；調(diào)控組 分：糖代謝激素、生長(zhǎng)因子、抗氧化劑，各成分的用量為在lml的DMEM培養(yǎng)液中，糖類代謝 激素10-20yg、氨基酸120-250yg、生長(zhǎng)因子200-500ng、維生素40-100ng、蛋白營養(yǎng)素 500-1200ng、抗氧化劑 100-180yg、無機(jī)鹽 8-35mg。
[0008] 通過上述組成，利用全營養(yǎng)組分保證人間充質(zhì)干細(xì)胞的良好成長(zhǎng)和繁殖，提供其 培養(yǎng)所需各種元素；同時(shí)，所添加的調(diào)控組分能夠?qū)ε囵B(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度進(jìn)行 調(diào)整，防止過度增長(zhǎng)影響所得人間充質(zhì)干細(xì)胞制品的品質(zhì)。
[0009] 其中，所用的氨基酸包含細(xì)胞生長(zhǎng)所需的氨基酸至少包含一種或幾種必需氨基 酸，和一種或幾種半必需氨基酸，以便為其具有良好的活性，且使干細(xì)胞在營養(yǎng)平衡狀態(tài)下 進(jìn)行多代擴(kuò)增而不發(fā)生分化。優(yōu)選所用氨基酸的組成為必需氨基酸包括蘇氨12-15yg、亮 氨酸24-30yg、異亮氨酸18-22yg、賴氨酸9-14yg、蛋氨酸30-40yg;半必需氨基酸包括 甘氨酸8-14yg、精氨酸9-16yg、絲氨酸30-35yg、酪氨酸28-35yg。
[0010] 其中，所用的維生素在所給定的濃度范圍內(nèi)能夠提高干細(xì)胞的增殖能力，與生長(zhǎng) 因子中間產(chǎn)生協(xié)同作用增加生長(zhǎng)因子對(duì)干細(xì)胞的增殖效應(yīng)。其中，所用維生素優(yōu)選如下：葉 酸 20_55ng、d-泛酸媽 17_23ng、氯化膽堿 3-10ng、維生素B12 3-10ng、肌醇l_5ng。
[0011] 其中，所用的蛋白營養(yǎng)素能夠保持干細(xì)胞增殖過程中的活力，優(yōu)選其組成如下：重 組人轉(zhuǎn)鐵蛋白15-40ng、腐胺20-25ng、重組人血清白蛋白500-1100ng。
[0012] 其中，所用的無機(jī)鹽為干細(xì)胞增殖生長(zhǎng)提供基本的生存環(huán)境，所用無機(jī)鹽提供 干細(xì)胞保持其活性所需的離子環(huán)境。優(yōu)選的，所述無機(jī)鹽包括氯化鈣33-40yg、氯化鉀 70-300yg、氯化鈉10-30mg、檸檬酸鐵0. 8-1yg。在該用量下，提供較為理想的pH環(huán)境。
[0013] 在本發(fā)明中，為了實(shí)現(xiàn)人間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖最優(yōu)化，使用了多種調(diào)節(jié)成分 對(duì)其進(jìn)行微調(diào)。下面就各調(diào)節(jié)成分的作用進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0014] 其中，所用的糖類代謝激素以胰島素為主要成分，輔之以胰島素反調(diào)節(jié)激素，胰島 素的用量為12-15yg，胰島素反調(diào)節(jié)激素的用量為50-600ng。
[0015] 在上述中，使用胰島素能夠促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的增殖；使 用胰島素反調(diào)節(jié)激素用來抑制胰島素的副作用（胰島素的使用會(huì)略微促進(jìn)干細(xì)胞凋亡）。
[0016] 其中，所用的胰島素反調(diào)節(jié)激素可以采用常見的類型，包括但不限于生長(zhǎng)激素、皮 質(zhì)醇。
[0017] 在本發(fā)明中，所用的生長(zhǎng)因子用來促進(jìn)干細(xì)胞貼壁，促進(jìn)其增殖純化。優(yōu)選的，生 長(zhǎng)因子包括內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子80-260ng、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子100-150ng、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子 40_75ng〇
[0018] 在本發(fā)明中，所用抗氧化劑能有效抑制干細(xì)胞增殖過程中的凋亡現(xiàn)象。優(yōu)選的，抗 氧化劑包括谷胱甘肽90-130yg、維生素C10-13yg、維生素E10-15yg。
[0019] 在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中，為了防止pH環(huán)境設(shè)置不當(dāng)對(duì)干細(xì)胞增殖的影響，本 發(fā)明的血清培養(yǎng)基中還加入有pH指示劑，其用量為0. 1-0. 5mg。
[0020] 通過添加pH指示劑，能夠確認(rèn)培養(yǎng)基溶液的酸堿性。由于合理的生長(zhǎng)環(huán)境要求偏 中性，因此上述pH指示劑優(yōu)選為酚紅。
[0021] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還公開了一種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血 清懸浮培養(yǎng)基，能夠使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)并良好生長(zhǎng)，消除貼壁生長(zhǎng)的機(jī)械應(yīng)力影響，使人 間充質(zhì)干細(xì)胞制劑能夠獲得更好的活性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，是在前述無血清培養(yǎng)基中加入 表面活性劑和/或微載體作為懸浮載體，懸浮載體的用量為0. 5-5mg。
[0022] 為了最佳化匹配本發(fā)明培養(yǎng)基的組成，上述所用的表面活性劑優(yōu)選聚氧乙烯-聚 氧丙烯共聚物、微載體優(yōu)選Cytodex?。添加上述表面活性劑或微載體的培養(yǎng)基能夠在3D立 體空間內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境更符合其在生物體內(nèi)生理狀態(tài)下的環(huán)境。
[0023] 申請(qǐng)人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基通過合理添加營養(yǎng)物質(zhì)，并復(fù)之 以調(diào)節(jié)組分，在低成本的前提下得到了培養(yǎng)效果極為接近胎牛血清培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng) 基，使用該培養(yǎng)基能夠在間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至2代時(shí)即可換用無血清培養(yǎng)，傳代至4到6代 所得的干細(xì)胞制劑無任何胎牛血清殘留。
【附圖說明】
[0024] 圖1為采用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基增殖人間充質(zhì)干細(xì)胞至5代的干細(xì)胞分布形態(tài)示 意圖；
[0025] 圖2為采用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基增殖人間充質(zhì)干細(xì)胞至5代的干細(xì)胞分布圖中非 均勻區(qū)域所占面積分布；
[0026]圖3為采用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基增殖人間充質(zhì)干細(xì)胞2-6代培養(yǎng)中細(xì)胞倍增時(shí)間 DPT變化趨勢(shì)圖；
[0027] 圖4為采用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基增殖人間充質(zhì)干細(xì)胞早期和晚期的細(xì)胞活性變 化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 在下述實(shí)施例中，申請(qǐng)人提供了本發(fā)明培養(yǎng)基應(yīng)用于人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的若干 具體實(shí)現(xiàn)及其效果。如下所提供的實(shí)施僅是示意性的，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成特別限定。本領(lǐng) 域技術(shù)人員在理解和掌握本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神的基礎(chǔ)上對(duì)各成分類型和用量進(jìn)行的合理調(diào)整 依舊屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 在本實(shí)施中，提供了本發(fā)明無血清培養(yǎng)基的若干具體實(shí)現(xiàn)，并初步以人骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞BM-MSC研宄其在各種組合條件下的干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。
[0031] 組成1 :在每lml的DMEM培養(yǎng)液中含有生長(zhǎng)激素50ng、皮質(zhì)醇20ng、胰島素12yg、 甘氨酸8 y g、精氨酸9 y g、蘇氨酸12 y g、絲氨酸30 y g、亮氨酸25 y g、異亮氨酸18 y g、 L_賴氨酸9 y g、蛋氨酸30 y g、L-酪氨酸28 y g、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子100ng、成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子l〇〇ng、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子40ng、葉酸30ng、d-泛酸媽17ng、氯化膽堿3ng、維生素 B12 3ng、肌醇lng、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白15ng、腐胺20ng、重組人血清白蛋白500ng、谷胱甘肽 95 y g、維生素C 10 y g、維生素E 10 y g、氯化鈣35 y g、氯化鉀70 y g、氯化鈉10mg、檸檬酸 鐵 〇? 8 y g。
[0032] 組成2:在每1ml的DMEM培養(yǎng)液中含有生長(zhǎng)激素200ng、皮質(zhì)醇25ng、胰島素 14 yg、甘氨酸12yg、精氨酸12yg、蘇氨酸12yg、絲氨酸35yg、亮氨酸27yg、異亮氨酸 20yg、L-賴氨酸10yg、蛋氨酸35yg、L-酪氨酸30yg、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子200ng、成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子120ng、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子60ng、葉酸40ng、d-泛酸媽20ng、氯化膽