一種產(chǎn)膽鹽水解酶的基因工程菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種產(chǎn)膽鹽水解酶的基因工程菌及其構建方法與應用，屬于基因工程
技術領域。
【背景技術】
[0002] 膽鹽水解酶能夠將脊椎動物體內(nèi)的結合態(tài)膽鹽水解成游離態(tài)的膽鹽和氨基酸，從 而導致肝臟細胞由膽固醇從頭合成結合膽鹽，起到降低機體內(nèi)的血清中的膽固醇水平的作 用。膽鹽水解酶因其可W降低血清中膽固醇水平，預防屯、血管疾病而成為國內(nèi)外研究的熱 點之一。
[0003] 人體中結合膽汁酸主要有6種，包括甘氨碟脫氧膽酸（26% )、甘氨膽酸（26% )、 甘氨脫氧膽酸（22% )、牛橫膽酸巧％ )、牛橫脫氧膽酸巧％ )和牛橫碟脫氧膽酸巧％ )。 不同來源的膽鹽水解酶對六種膽鹽的親和力不同。例如：人體腸道內(nèi)乳酸菌來源的膽 鹽水解酶通常對甘氨結合膽鹽有較高的親和力，微囊化的植物乳桿菌重組體產(chǎn)生的膽 鹽水解酶對甘氨脫氧膽酸（glycochenodeo巧cholicacid,GDCA)的作用比牛橫脫氧 膽酸（tauroursodeoxycholicacid,TDCA)有效，嗜酸乳桿菌（L.acidophilusNCFM) 的膽鹽水解酶bsM沒有活性，從而降低了菌株降解含有固醇類核基團的碟去氧膽酸 能力，如牛橫碟脫氧膽酸（taurochenodeo巧cholicacid,TCDCA)和甘氨碟脫氧膽酸 (glycochenodeoxycholicacid，GCDCA)。
[0004]目前有關研究膽鹽水解酶國內(nèi)外研究主要集中在篩選高產(chǎn)膽鹽水解酶的優(yōu)良菌 株和膽鹽水解酶基因功能分析。研究報道了多種來源的膽鹽水解酶基因在大腸桿菌、乳酸 菌、雙歧桿菌和酵母細胞中克隆和表達，膽鹽水解酶基因異源表達后酶水解底物的能力和 酶學性質的研究報道較少。 陽〇化]在大腸桿菌中表達植物乳桿菌膽鹽水解酶基因時檢測發(fā)現(xiàn)，重組表達的膽鹽水解 酶表達后形成沒有活性的包涵體。使用融合標簽融合表達，純化后的重組膽鹽水解酶的比 酶活為2. 43U?mg1，因此，重組膽鹽水解酶的溶解性得到了顯著提高。也有研究利用畢赤 酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)植物乳桿菌膽鹽水解酶的胞外可溶性表達。董自星利用雙精氨酸信號膚 將L.plantarumBBE7來源的膽鹽水解酶在大腸桿菌中進行了分泌表達，并且利用信號膚 a-factor將膽鹽水解酶在畢赤酵母中分泌表達，胞外膽鹽水解酶總酶活達到2. 69U'mL1。 [0006] 利用基因工程的手段來研究膽鹽水解酶的過量表達，可W提高膽鹽水解酶的水解 活性W及產(chǎn)量。運為研究膽鹽水解酶的酶學性質提供了一定的基礎。另外，純化后的膽鹽 水解酶可應用于研究酶的動力學性質W及酶與底物的作用機制。

【發(fā)明內(nèi)容】
W07] 為了克服W上問題，本發(fā)明提供了 一種高效表達膽鹽水解酶的基因工 程菌，是將膽鹽水解酶基因導入大腸桿菌得到的基因工程菌Escherichiacoli BL21 〇)E3) -pET-22b(+) -bsh。 W〇8] 所述膽鹽水解酶，在本發(fā)明的一種實施方式中，來源于Bifidobacterium infantisKL412。
[0009] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種產(chǎn)膽鹽水解酶的大腸桿菌基因工程菌，所述基因 工程菌表達氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的膽鹽水解酶。
[0010] 所述膽鹽水解酶，在本發(fā)明的一種實施方式中，其核巧酸序列是SEQIDNO. 2所示 的序列。
[0011] 所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實施方式中，是將SEQIDNO. 2所示的序列 連接到表達載體祀T-22b(+)得到重組質粒，然后將重組質粒轉化到Escherichia coli BL2UDE3)中得到的。
[0012] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種所述基因工程菌的構建方法，是化學合成或者擴 增得到SEQIDNO. 2所示的基因序列，然后將基因序列連接到表達載體祀T-22M+)上得到 重組質粒祀T-22b(+)-bsh，然后將重組質粒轉化到E.coliBL2UDE3)中得到的。
[0013] 所述構建方法，在本發(fā)明的一種實施方式中，具體是：
[0014] (1)合成如SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列；W合成的序列為模板，使用序列分別 如沈QIDNO. 3、SEQIDNO. 4 所示的引物bsh-F、bsh-R擴增；
[0015] 似用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI、化o1酶切擴增得到的PCR產(chǎn)物和質粒 pET-2化(+)，然后將酶切后的PCR產(chǎn)物祀T-22b(+)連接得到重組載體祀T-22b(+)-bsh;
[0016] (3)將重組載體祀T-22b(+)-bsh轉化Escherichia coli化21 0E3)，經(jīng)篩選、鑒 定獲得重組菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-2化（+)-bsh。
[0017] 3)重組載體轉化Escherichia coli BL2UDE3)。
[0018] 本發(fā)明的第=個目的是提供所述基因工程菌在膽鹽水解酶生產(chǎn)中的應用。
[0019] 所述應用，在本發(fā)明的一種實施方式中，是將基因工程菌種子液W1-3 %的接 種量轉入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于36-38°C下培養(yǎng)至ODe。。值為1. 5-2. 0,然后加入終濃度為 0. 8-1. Ommol?L1的IPTG誘導，在20°C誘導培養(yǎng)26-3化。
[0020] 所述應用，在本發(fā)明的一種實施方式中，是將基因工程菌種子液W2%的接種量 轉入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 °C、200巧m條件下培養(yǎng)至ODe。。值為2. 0,然后加入終濃度為 1. Ommol?L1的IPTG誘導，在20°C誘導培養(yǎng)32小時。
[0021] 所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基，在本發(fā)明的一種實施方式中，為TB培養(yǎng)基，含有：酵母浸 出粉 24g?L1，蛋白腺 10-14g/Lg?L1，甘油 3-4g?L1，KH2PO412-17mmol?L1，K2HPO4 68-72mmol?L1。
[0022] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種所述膽鹽水解酶的酶活測定方法，所述方法是將 取0. 1血待測樣品加入1. 8血0. 1M憐酸鹽緩沖液（pH6. 0)和0. 1血膽鹽（200mmol?L1) 中混合，并置于37°C解育30min，取0. 5血上述反應液加入0. 5血15%S氯乙酸（w/t)終止 反應，混合均勻，離屯、lOmin(離屯、機最大轉速，4°C)取上清。將0. 1血上清液與1. 9血巧 S酬顯色液（包括0. 5血1 %巧S酬（溶解于0. 5M巧樣酸緩沖液（pH5. 5)中）、1. 2血甘 油和0. 2血0. 5M的巧樣酸緩沖液（抑為5. 5))混合，震蕩混勻，沸水浴14min。冷卻3min 后測定570nm下的吸收值。標準曲線用甘氨酸或牛橫酸制作。
[0023] 本發(fā)明還要求保護所述基因工程菌生產(chǎn)得到的膽鹽水解酶，W及所述膽鹽水解酶 在降低膽固醇方面的應用。
[0024] 本發(fā)明將來源于BifidobacteriuminfantisKL412的產(chǎn)膽鹽水解酶基因，W 祀T-22b(+)為載體，在大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)中進行表達，所得重組 菌發(fā)酵的到的酶，對甘氨脫氧膽酸鋼和牛橫酸脫氧膽酸鋼的酶活分別為135. 2U?mL1和 121.抓?mL1。同時本發(fā)明得到的重組酶，對人體中六種膽鹽都有較好的特異性，對GCA酶 活為220. 1U?mg1，對TCA的相對酶活為154. 1U?mg1，對TCA的相對酶活70. 3%高于文獻 報道的其他來源的膽鹽水解酶。本發(fā)明為膽鹽水解酶的大規(guī)模生產(chǎn)W及其作為功能食品來 降低血清膽固醇奠定了良好的基礎。
【附圖說明】 陽02引 圖1 :目的基因的擴增；M:DL1，OOODNAMarker;泳道1 :bsh基因的PCR擴增條帶；
[0026] 圖2 :蛋白電泳（SDS-PA(iE)結果；M:蛋白質分子量標準（Protein MolecularWei曲tMarker) ;1 :含有祀T28a(+)的E.coliBL2UDE3) ;2 :含有祀T 28a(+)的E.coliBL2UDE3)經(jīng)過1.Ommol?L4PTG誘導；3 :重組菌；4 :重組菌經(jīng)過 1.Ommol?LilPTG誘導；5 :重組菌經(jīng)過1.Ommol?LilPTG誘導后細胞破碎液沉淀；6 :重組 菌經(jīng)過1.Ommol?LilPTG誘導后細胞破碎液上清；
[0027] 圖3 :誘導ODe。。對重組膽鹽水解酶酶活的影響；
[0028] 圖4 :接種量對重組膽鹽水解酶酶活的影響；
[0029] 圖5 :溫度對重組膽鹽水解酶活力（A)和穩(wěn)定性度）影響；
[0030] 圖6 :抑對重組膽鹽水解酶活力（A)和穩(wěn)定性做影響；
[0031] 圖7 :重組膽鹽水解酶底物特異性；其中：GCA，甘氨膽酸鋼；GDCA，甘氨脫氧膽酸 鋼；GCDCA，甘氨碟脫氧膽酸鋼；TCA，牛橫膽酸鋼；TDCA，牛橫脫氧膽酸鋼；TCDCA，牛橫碟脫 氧膽酸鋼。
【具體實施方式】
[0032] 膽鹽水解酶酶活測定方法：將發(fā)酵液離屯、5min (10000 X g，4°C)收集菌體，用0.1M 憐酸鹽緩沖液（pH 7. 0)洗涂離屯、2次，調整菌濃在600nm下吸光度為1。取1血上述細胞 懸濁液，超聲破碎Imin(工作時間：間歇時間=1:2)，離屯、lOmin (10, 000 X g，4°C)去除細 胞碎片，得到無細胞提取物（cell化ee ex化act, C陽）。取0.1血上清液加入1.8血O.IM 憐酸鹽緩沖液（pH 6. 0)和0. 1血膽鹽（200mmol?L1)中混合，并置于37°C解育30min，取 0. 5血上述反應液加入0. 5血15%S氯乙酸（w/t)終止反應，混合均勻，離屯、lOmin(離屯、機 最大轉速，4°C)取上清。將0. 1血上清液與1. 9血巧S酬顯色液（包括0. 5血1%巧S酬 (溶解于0. 5M巧樣酸緩沖液（pH 5. 5)中）、1. 2mL甘油和0. 2mL 0. 5M的巧樣酸緩沖液（pH 為5. 5))混合，震蕩混勻，沸水浴14min。冷卻3min后測定570nm下的吸收值。膽鹽水解 酶酶活定義為：單位時間內(nèi)、單位體積的酶使結合型膽鹽水解產(chǎn)生氨基酸的物質的量，單位 y mol ? (min ? mL)i。
[0033] 實施例1 :重組菌的構建及鑒定
[0034] 1)合成如SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列；W合成的序列為模板，設計引物進行 PCR：
[0035] bsh-F: 5' -GGGAATTCCATATGATGTGCACTGCAGTACGTTTCGATG-3 '
[0036]bsh-R:5' -CCGCTCGAGTTTGGACTGCAGCTGGTTGCTAGACG-3"
[0037] 0. 2 血PCR管中按順序加入W下試劑：l〇XLAPCRbufferII(Mg2+plus)5yl; DNTPMixUire8y1 ;模板DM1y1 ;上下游引物各2y1 ;Taq酶0. 5y1 ;加雙蒸水至終體 積為50y1。PCR反應程序為為：95°C下預變性5m