澤瀉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶抗體制備及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及澤瀉原祗燒型=祗類化合物生物合成途徑中關(guān) 鍵酶基因3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶抗體的制備及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 澤瀉（Alismatis化izoma)為澤瀉科植物東方澤瀉的干燥塊莖，具有利水、滲濕、 泄熱之功效，道地產(chǎn)區(qū)為福建。其主要藥效成分為原祗燒型（Protostane)四環(huán)=祗類，該 類成分具有明顯的抗高血脂、降血壓、抗HIV1等作用，尤其抗癌活性顯著，預(yù)示著其廣闊的 應(yīng)用開發(fā)前景，但其資源分布窄，含量低，僅存在澤瀉屬等少數(shù)植物類群中，不能滿足利用 需求，生物工程是提高藥效成分產(chǎn)量的有效途徑之一。
[0003] 生物合成途徑的研究對于改善藥用植物的品質(zhì)至關(guān)重要，其中關(guān)鍵 酶基因的克隆、表達和調(diào)控是目前的研究熱點。徑甲基戊二酷CoA還原酶 (3-hy^ox}f-3-methylgluta巧 1-CoA reductase, HMGR)HMGR 是 MVA 途徑中的重要酶，催化 3-徑基-3-甲基戊二酷 CoA(3-hy化oxy-3-methylgluta巧 1 coenzyme A，HMG-CoA)形成 MVA，是MVA途徑中的第1個限速酶，也是細胞質(zhì)祗類代謝中的重要調(diào)控位點。近年來，對 3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶的研究倍受重視，迄今人們已對14個不同物種中的 3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶進行了研究。有關(guān)澤瀉=祗類成分生物合成關(guān)鍵酶的 研究還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一目的是提供了一種澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶。
[0005] 本發(fā)明的第二目的是提供上述澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶原核表 達、獲得純化蛋白的方法。
[0006] 本發(fā)明的第=目的是提供上述澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶的多克 隆抗體制備和檢測方法。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是在首次克隆了澤瀉AoHMGR基因的全長cDNA，并使用 NCBI Blast 比對，氨基酸序列與 S 屯（Panax notoginseng)，藍麻巧 icinus communis),人 參（Panax ginseng)的同源性分別達到70%，69%，68%的基礎(chǔ)上，提供一種澤瀉原祗燒型 =祗類化合物生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶多克隆抗 體制備及快速檢測方法，W便用于快速合成和檢測3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶抗 體，為快速獲得四環(huán)=祗類化合物提供基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0009] 一、一種澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶，具有序列表SEQIDNo. 2的 氨基酸序列，或由具有序列表SEQIDNo.1的堿基序列的基因所編碼。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：運用同源克隆法和RACE技術(shù)克 隆澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶基因的cDNA全長。
[0011]上述運用同源克隆法和RACE技術(shù)克隆澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶 基因的cDNA全長，在前期獲得AoHMGR基因保守區(qū)片段的基礎(chǔ)下克隆AoHMGR全長。采用試 劑盒法提取澤瀉RNA，W Oligo dT18為引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進行AoHMGR基因保守區(qū) 片段克隆，W及RACE和全長cDNA擴增。
[001引上述AoHMGR基因保守區(qū)片段克隆W及RACE和全長cDNA擴增方法如下，根據(jù) GenBank提供的HMGR同源基因序列，用引物設(shè)計軟件Primer 5. 0設(shè)計簡并引物HF1和 皿2 (見表1)。W反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進行保守區(qū)片段的PCR擴增，25 y L反應(yīng)體系： 10XPCR緩沖液 2. 5yL，25mmol/L MgC121yL，25mmol/L dNTP lyL，10nmol/L 引物各 1 y L，cDNA 模板 1 y L，抓 rTaq 酶 0. 5 y L，d地20 17 y L。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min ; 94°C 30s，58°C 30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。將W上獲得的PCR擴增產(chǎn) 物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳后，割膠，純化回收，克隆測序，測序由上海生工生物工程有限公司完 成。
[0013] 根據(jù)AoHMGR基因保守區(qū)片段的測序結(jié)果，在其序列內(nèi)部設(shè)計5' RACE和3' RACE特 異引物 HF2 和皿 2(見表 1)，利用Clontech 公司 SMARTer TMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒擴增該基因的cDNA5'端和3'端。根據(jù)5'RACE和3'RACE測序結(jié)果拼接得到的全長 cDNA設(shè)計引物HF3和皿3(見表1)，進行全長cDNA擴增。RACE和全長cDNA引物由南京 金思特公司合成。在50yL反應(yīng)體系中加入cDNA模板2yL上下游引物各lOnmol ? kl， 10XPCR緩沖液5.0yL，2.5mmol?レldNTP1.6yL，25mmol?レlMgC121.2yL，2Url'a姐NA 聚合酶燈aKaRa 公司）進行 RT-PCR 擴增。95°C，3min ;95°(：，3〇3,56°(：，6〇3,72°(：，12〇3，循 環(huán)30次，再72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物克隆及測序等過程同上。
[0014] 表1實驗中引物序列表
[0015]
[0017]將5' RACE和3' RACE擴增片段測序結(jié)果與已有保守區(qū)片段拼接得到全長cDNA。為 了驗證全長結(jié)果，根據(jù)拼接得到的全長序列設(shè)計引物，WcDNA為模板，擴增澤瀉AoHMGR 全長序列并測序，測序結(jié)果與拼接結(jié)果一致，澤瀉AoHMGR基因保守區(qū)片段（a)，3'RACE化）， 5' RACE(c)和基因全長（d)擴增結(jié)果見圖1。
[0018] 3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶蛋白具有序列表SEQ ID No. 1的氨基酸序 列，或由具有序列表SEQ ID No. 2的堿基序列的基因所編碼。
[0019] 二、一種上述澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶原核表達、獲得純化蛋 白的方法，根據(jù)前期獲得的AoHMGR基因序列結(jié)果，在獲得克隆載體pGHn-HMGR的基礎(chǔ)上， 重新設(shè)計引物HF4,皿4(見表1)。50yl反應(yīng)體系含：10XPCR緩沖液5.0iil，25mmol/ L MgClzA. 0yl，10mmol/L dNTP 4. 0yl，10nmol/L 引物各 1.0yl，cDNA 模板 5. 0yl，5U rTaq 酶 0. 5y 1，(1地2〇28. 5y 1。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min ;94°C 30s，54°C 30s，72°C延 伸lmin，30個循環(huán)；72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，純化回收，克隆測序。將 AoHMGR克隆進pCznl表達載體的化nl和EcoRI之間，目標基因融合了 6X his標簽蛋白，獲 得pCznl-AoHMGR質(zhì)粒。結(jié)果見圖2,3。
[0020] 進一步的，重組質(zhì)粒pCznl-AoHMGR的誘導(dǎo)表達，具體的為將經(jīng)測序無突變的重 組質(zhì)粒pCznl-AoHMGR轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21 (Roseta)受體菌，篩選陽性重組克隆，置于含有 50 y g/mL Amp的3ml LB培養(yǎng)基中，37°C振搖過夜，次日稀釋100倍，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600皿為 0. 6-0. 8時，取出1血留作誘導(dǎo)前的對照，向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0. 2mM， irC 220rpm培養(yǎng)12h，誘導(dǎo)表達，離屯、，收集菌體沉淀。分別取誘導(dǎo)前菌液，誘導(dǎo)后菌液，誘 導(dǎo)后菌液的上清及沉淀作為樣品，進行10% SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果見圖4。
[0021] 進一步的，目的蛋白的純化方法具體為將誘導(dǎo)表達的培養(yǎng)菌液低溫離屯、lOmin，菌 體沉淀重懸，與20血細菌裂解緩沖液（20mM Tris-肥1，含ImM苯甲基橫酷氣PMSF，抑8. 0) 超聲破碎20min，4°C離屯、20min，收集沉淀，使用包涵體洗涂液（20mM Tris，lmM邸TA，2M尿 素，1M化Cl，l% Triton X-100, P冊.0)洗涂包涵體3次，然后用溶解緩沖液（20mM Tris， 5mM DTT，8M尿素抑8. 0)溶解包涵體，4°C放置過夜后，室溫離屯、15min，將包涵體溶解液滴 加到20mM Tris，P冊.0緩沖液逐步成倍梯度稀釋，緩慢攬拌，至尿素濃度達到0. 5M時，將蛋 白溶液裝入透析袋，于4°C在20mM PBS，pH7. 4中透析過夜。目的蛋白進行10% SDS-PAGE 分析。結(jié)果見圖5。
[0022] =、一種上述的澤瀉3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶的多克隆抗體制備和檢 測方法，原核表達純化3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶蛋白并于用免疫家兔制備多克 隆抗體。通過化ISA檢測純化抗體的效價，蛋白免疫印跡Western Blot檢測純化抗體的純 度觀察。
[0023] 進一步的，具體的為取純化后的3-徑基-3-甲基戊二酷輔酶A還原酶蛋白，采用 皮下注射法免疫2-2. 5Kg的新西蘭白兔，400 y g/次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采