一種在培養(yǎng)基中添加蘆丁促進益生菌生長的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種在培養(yǎng)基中添加蘆丁促進益生 菌生長的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 益生菌是一類定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主 微生態(tài)平衡，對人體健康有重要作用的活的微生物的總稱，廣泛應用于食品、保健品和藥品 生產(chǎn)中。LGG (ATCC 53103)是一種鼠李糖乳桿菌，八十年代初由兩位美國教授從健康人體 內(nèi)分離而得，也是目前全球研究最多的益生菌之一。大量的體外實驗、動物實驗、人體實驗 和流行病學調(diào)查研究充分證明了 LGG的安全性。功能性方面，LGG具有顯著的平衡和改善腸 道菌群、預防和治療腹瀉、提高機體免疫力、預防過敏、結(jié)合并排除毒素、預防齲齒等功能。 此外，作為一種益生菌，LGG還具有一些自身的優(yōu)勢：比如耐胃酸、耐膽汁、可定殖于人體腸 道、最終產(chǎn)品(酸奶、牛奶等)保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)保持恒定等（王世賓，劉金杰，喬嵐，程琳. 益生菌LGG的研究.廣州食品工業(yè)科技[J]. 2003，si: 55-58)。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌在人體 腸道內(nèi)的數(shù)量對益生菌發(fā)揮保健和治療功效起到?jīng)Q定性作用。除了益生菌在體內(nèi)增殖，在 加工過程中和貯藏期間保證其存活和保持生物活性等因素外，足量的活菌數(shù)是益生菌補充 劑產(chǎn)品發(fā)揮其有效性的必要前提。
[0003] 當前提高益生菌活菌總數(shù)的研究方向主要集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化和復合菌高密 度發(fā)酵。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有益物質(zhì)不但能提高益生菌的活菌數(shù)，發(fā)酵乳還能兼具有益 物質(zhì)的功能。林瑩等將菊粉、大豆低聚糖和低聚果糖等益生素添加到酸奶中進行發(fā)酵，結(jié) 果表明，益生素對雙歧桿菌的增殖有顯著影響，其中又以大豆低聚糖對雙歧桿菌的增殖最 有效，活菌數(shù)量從0. 49X 10s cfu/ml有效增殖到I. 2X 10s cfu/ml (林瑩，梁世中·益生 菌保健酸奶發(fā)酵劑配制和益生素對菌體數(shù)量影響的研究.廣州食品工業(yè)科技[J]. 2003， Sl:41-43)。有專利文獻報道一種提高益生菌活菌數(shù)的方法，是將北蟲草提取物加入到常規(guī) 的乳酸菌培養(yǎng)基中，能夠使乳酸菌活菌數(shù)從I. 5X 10s cfu/ml提高到I. 3X IO9 cfu/ml (中 國專利【申請?zhí)枴?00910038553. 5)。劉成國等將益生菌菌種接種到添加有紫薯漿的發(fā)酵牛乳 基質(zhì)中進行發(fā)酵，能夠顯著提高益生菌發(fā)酵乳中益生菌的活菌數(shù)，得到的益生菌發(fā)酵乳的 最大活菌數(shù)從IO 9-IOw cfu/ml提高到IOw-IO12 cfu/ml。脫脂乳中添加大豆蛋白水解物和 酵母膏復合劑對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌生長具有顯著的促進作用，添加增殖復合劑 可使乳酸菌數(shù)量比脫脂乳培養(yǎng)基提高1-2個數(shù)量級。（白鳳翎，曲玲童，張柏林等.大 豆蛋白水解物促乳酸菌增殖發(fā)酵的研究.食品工業(yè)科技[J]. 2012，33 (16) :209-212)。 李慧靜等研究了添加黃芪之后嗜酸乳桿菌的生長狀況的變化，她們把制備的黃芪提取液添 加到改良的MRS培養(yǎng)基中，研究不同濃度黃芪提取液對嗜酸乳桿菌生長的影響，結(jié)果表明： 當添加黃芪提取液濃度為0.032 g/mL時，對嗜酸乳桿菌生長有明顯的促進作用，48h OD從 〇. 6提高到0. 8 (李慧靜.嗜酸乳桿菌與黃芪相關(guān)性研究[D]，安徽工程大學，2013)。趙玉 萍等研究不同濃度的甘草多糖和黨參多糖對鼠李糖乳桿菌的影響，發(fā)現(xiàn)I. 5% (m/v)的黨參 多糖對鼠李糖乳桿菌的增殖影響最大，其活菌數(shù)最大可達到3. 29 X IO9 cfu/mL，提高了 3倍 左右，并且能夠使其提前2~3 h達到最大產(chǎn)酸量，縮短發(fā)酵時間，較好地提高其耐酸、耐 膽鹽及耐高溫的能力（趙玉萍，賈建波，中藥多糖對鼠李糖乳桿菌性質(zhì)的影響.食品科技 [J]，2008，13-15)。徐海燕等研究低聚木糖對乳桿菌、雙歧桿菌及腸道菌群生長的影響。 結(jié)果1%的低聚木糖對植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌和青春雙歧桿菌有明顯的增 殖作用。（徐海燕，辛國芹，曹銀生，武香玉，汪孟娟，谷巍.低聚木糖對益生菌及人 腸道菌群的影響·藥學研究[J]. 2013，9:500-503) 當前益生菌增殖技術(shù)取得了一定成果，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有益物質(zhì)是一種高效、簡 便的提高益生菌的活菌數(shù)的方法。不但能降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，在某些情況甚至能夠縮短發(fā) 酵周期。但是更多的具備特殊功能的添加劑的研究還不是很多。
[0004] 蘆丁，分子式：C27H31A6，分子量：610. 51，別名蕓香甙。蘆丁屬于黃酮類物質(zhì)，具有 多種生理作用，如有降低毛細血管通透性和脆性的作用；保持及恢復毛細血管的正常彈性； 用于防治高血壓腦溢血；糖尿病視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等；也用作食品抗氧劑和色素。 蘆丁對人體安全，早在幾十年前，美國FDA已批準蘆丁為GRAS級（即"公認為安全的")產(chǎn)品， 不僅可供藥用，也可用于保健食品或化妝品等產(chǎn)品中。隨著世界各國患血栓病的人數(shù)在不 斷上升，作為能有效增強毛細血管壁、防止血管破裂和腦出血等癥的藥物蘆丁，需求量在不 斷增加。我國是蘆丁的生產(chǎn)和出口大國，預期蘆丁總產(chǎn)量和出口數(shù)量也會不斷增加。據(jù)統(tǒng) 計，目前全球蘆丁原料藥總產(chǎn)量已達3000~3600噸，而我國蘆丁總產(chǎn)量估計在1200噸左 右，約占全球蘆丁總產(chǎn)量的1/3。近年來，蘆丁及其加工產(chǎn)品在國內(nèi)外市場上十分暢銷，其 營養(yǎng)品質(zhì)與深加工利用己成為國內(nèi)學者們的研究熱點。當前研究的熱點集中在蘆丁在抗氧 化、清除自由基、抗突變、抗癌癥、抗心血管疾病、抗高血糖、改善肝功能等功效方面的研究。 據(jù)悉，美國市場上已有多種以蘆丁為主要原料的保健產(chǎn)品，如蘆丁與維生素的合劑(如蘆丁 +VC，蘆丁 +VE，蘆丁 +VK等等）以及蘆丁與植物性保健原料的合劑如蘆丁與銀杏葉提取物片 劑，蘆丁與沙棘果提取物片劑，蘆丁與山楂果提取物片劑，蘆丁與紫錐菊提取物片劑等等。 蘆丁已成為美國醫(yī)藥保健品市場上的新寵兒。但是，當前關(guān)于蘆丁對益生菌具有增殖作用 的研究尚沒有文獻報道，添加蘆丁的微生態(tài)制劑也未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種提高益生菌活菌數(shù)的方 法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種提高益生菌體外培養(yǎng)活菌數(shù)的方法，所 述方法為：將益生菌菌種接種到添加有蘆丁溶液的MRS培養(yǎng)基中，進行益生菌的增殖。
[0007] 前述方法具體技術(shù)方案包括以下步驟： (1) 蘆丁溶液的制備：準確稱量蘆丁配置成蘆丁濃溶液，攪拌至溶解，115°C滅菌30 min ； (2) 增菌培養(yǎng)基的配置：將步驟（1)制備得到的蘆丁溶液加至滅菌后的改良MRS培養(yǎng)基 中；同時準備一個未添加蘆丁的對照組 (3) 益生菌種子液的制備：將保存到的益生菌菌株，經(jīng)復蘇、擴大后制成種子液； (4) 益生菌的增菌培養(yǎng)：將步驟（3)得到的益生菌種子液接種到步驟（2)得到的增菌培 養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)。
[0008] (5)活菌數(shù)的測定：發(fā)酵的過程從0 h開始，采用常規(guī)10倍稀釋平板厭氧培養(yǎng)計 數(shù)法每間隔一段時間測定一次活菌數(shù)，最終獲得該益生菌的最大活菌數(shù)。
[0009] 較優(yōu)地，所述步驟（1)中，蘆丁單體(純度99%)以100 mg/mL的濃度配置成蘆丁 的DMSO濃溶液。DMSO溶液可以提高蘆丁的溶解性，且按之后的比例加入到增菌培養(yǎng)體系， DMSO并不會抑制益生菌的生長增殖。
[0010] 較優(yōu)地，所述步驟（2)中，步驟（1)中所得蘆丁溶液按一定體積加至改良MRS培養(yǎng) 基中，使蘆丁終濃度為0.1 mg/mL至5 mg/mL。