一種基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來源的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于短序列高通量測序檢測肉制 品材料來源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，肉類和肉制品的消費發(fā)展極為迅猛，由 于不同品種肉類的價值差異巨大，錯誤標(biāo)簽和以次充好的現(xiàn)象越來越多。確定產(chǎn)品所用的 肉類、進(jìn)行產(chǎn)品標(biāo)簽信息的驗證，能夠起到保護(hù)消費者權(quán)益、打擊造假和錯誤標(biāo)簽，保障進(jìn) 出口產(chǎn)品質(zhì)量的作用。而確定產(chǎn)品所用肉類必須要有可靠而準(zhǔn)確的肉類物種鑒別方法。
[0003] 肉類的物種鑒定，主要有形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法 是在演化的背景下依據(jù)形態(tài)和結(jié)構(gòu)、生理和生化特征、行為習(xí)性表現(xiàn)以及少量的化石資料 來構(gòu)建生物物種之間的關(guān)系。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法只適用于完整形態(tài)的肉的樣品，一旦 進(jìn)行了加工，如魚肉片、肉糜等，那些用于鑒定的特征就可能被破壞，形態(tài)學(xué)鑒定就會變得 困難，也會導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。
[0004] 但無論如何加工，該動物的DNA始終存在和不可改變，因此采用DNA信息對肉制品 原料來源進(jìn)行鑒定，是一個不錯的選擇。2003年，加拿大動物學(xué)家Paul Hebert等提出線 粒體細(xì)胞色素 C氧化酶亞基（COI)基因序列中堿基序列的差異能很好地區(qū)分所有的研究物 種。該種基于DNA信息鑒定區(qū)分物種的方法，具有較高的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種借助分子生物學(xué)手段，對肉制品進(jìn)行DNA信息采 集后，基于短序列高通量測序的方法，以待測肉制品的COI序列信息對肉制品原料來源進(jìn) 行檢測鑒定的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實施方式提供了一種基于短序列高通量測序檢測 肉制品材料來源的方法，包含下述步驟：
[0007] (1)提取待測肉制品的基因組DNA ;
[0008] (2)設(shè)計并合成COI通用引物序列，其中，正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反向引物 如 SEQ ID NO:2 所示：
[0009] SEQ ID N0:1 :5, -GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3,；
[0010] SEQ ID N0:2 :5, -TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3,；
[0011] 其中，W 代表 A/T、Y 代表 C/T、N 代表 A/G/C/T、R 代表 A/G。
[0012] (3)采用步驟⑵中所述的正向引物和反向引物，以步驟⑴中所提取的基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0013] (4)對步驟（3)中純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并等量混樣，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)文庫，然后進(jìn)行 高通量測序；
[0014] (5)根據(jù)步驟（4)中測序的結(jié)果，得到待測肉制品的COI序列信息，由此得出待測 肉制品的材料來源。
[0015] 本發(fā)明的實施方式采用短序列高通量測序的方法，對待測肉制品的DNA信息進(jìn)行 采集，并通過COI本地數(shù)據(jù)庫，對樣品材料來源及比例進(jìn)行檢測。在以所提取的待測肉制品 基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時，本發(fā)明在對COI保守序列進(jìn)行充分分析后，選取保 守序列設(shè)計引物，并在這些引物對中挑選適合Illumia Miseq測序平臺讀長的引物對，最終 確定SEQ ID NO: 1所示的正向引物和SEQ ID NO: 2所示的反向引物。上述引物是適用于多 種脊椎動物和無脊椎動物的COI廣譜通用引物，由于一些深加工的肉制品中材料來源多樣 化，因此本發(fā)明所設(shè)計的廣譜通用引物確保了后續(xù)擴(kuò)增的效率及鑒定的準(zhǔn)確性。在通過短 序列高通量測序得到待測肉制品基因組DNA的COI序列信息后，對得到的COI序列信息在 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，進(jìn)而得到物種信息。利用本發(fā)明的實施方式所提供的鑒定方法，可對各 種肉制品的材料組成和來源進(jìn)行鑒定，由于COI基因序列中堿基序列的差異能很好地區(qū)分 物種，因此利用該方法對肉制品材料來源進(jìn)行檢測鑒定具有較高的準(zhǔn)確性。
[0016] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來源 的方法，分別在SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示序列的5'端連接7堿基條形碼，作為 正向引物和反向引物。本發(fā)明的實施方式為基于短序列高通量測序技術(shù)對肉制品材料來 源的檢測鑒定方法，而高通量測序平臺一個run的數(shù)據(jù)量很大，比如MiSeq Reagent Kit v3, 600-cycles單個run可以產(chǎn)生25M reads，而單個樣品測序1000~30000條reads足 夠分析，所以一般情況下需要幾百甚至上千個樣品混合后上機(jī)。為了能夠很好地區(qū)分樣品， 我們設(shè)計了 7堿基的條形碼（barcode)加在通用引物前面，得到條形碼通用引物，用于對基 因組DNA的PCR擴(kuò)增，所述7堿基條形碼的序列可以為ACACAGT或CAGAGTC。
[0017] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來源 的方法，所述步驟（3)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為：基因組DNA模板2yl、5U/ul的 Q5 聚合酶 0.25 μ l、Q5Reaction Buffer (5X)、Q5GC high Enhancer (5Χ)、2· 5 μΜ dNTP 2 μ 1、10 μ M的正向引物I μ 1、10 μ M的反向引物I μ 1，加 ddH20至25 μ 1。該PCR擴(kuò)增的反 應(yīng)程序為：98°C預(yù)變性30s，然后以98°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸30s為一個循環(huán)， 進(jìn)行27個循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C至無窮。本發(fā)明的實施方式在針對待測肉制品的 基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，在擴(kuò)增體系的組成和在擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序上，都進(jìn)行了實驗 條件的優(yōu)化，所采用的均為最適實驗條件。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來源 的方法，所述步驟（3)中采用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。
[0019] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式中所提供的基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來 源的方法，所述步驟（4)中采用美國Biotek FLX800熒光分析儀進(jìn)行定量。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式中所提供的基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來 源的方法，所述步驟（4)中采用Illumina文庫構(gòu)建試劑盒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)文庫的構(gòu)建。
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來 源的方法，其特征在于，所述步驟（4)中采用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行高通量測序。 MiSeq測序平臺具有讀長較長、數(shù)據(jù)產(chǎn)出量高的特點，因此較適合用于本發(fā)明的實施方式 中。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的基于短序列高通量測序檢測肉制品材料來源 的方法，述步驟（4)中根據(jù)待測肉制品的COI序列信息得出待測肉制品的材料來源的方法 是：將待測肉制品的COI序列信息，與已知物種的COI基因序列進(jìn)行比對，從而得出待測肉 制品的材料來源。
【附圖說明】
[0023] 圖1是實施例1中提取得到的待測肉制品基因組DNA的電泳檢測圖；
[0024] 圖2是實施例1中待測肉制品基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0025] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的各實 施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基 于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方 案。
[0026] 實施例1罐頭肉制品的材料來源鑒定
[0027] 1、取肉制品罐頭，對罐頭內(nèi)的肉制品進(jìn)行DNA提取，提取時采用美國Axygen生物 科技有限公司的DNA提取試劑盒進(jìn)行，提取操作步驟為：
[0028] 1)取20mg肉制品，移入冰水浴預(yù)冷的研缽中，快速、用力研磨成勻漿。
[0029] 2)加入 350 μ I Buffer PBS 和 0· 9 μ I RNase A 后溫和地研磨 30s。
[0030] 3)收集350 μ 1研磨好的組織勻漿并轉(zhuǎn)入2ml離心管。如勻漿體積不足350 μ 1， 補(bǔ)充PBS至350 μ 1。
[0031] 4)加入150 μ I Buffer C-L和20 μ 1蛋白酶Κ。立即漩渦振蕩Imin混合均勻。短 暫離心后，將離心管置56°C水浴IOmin。（不要將蛋白酶K直接加到Buffer C-L中）。
[0032] 5)加入 350 μ I Buffer P-D，漩渦振蕩 30s 混合均勻，12, OOOXg 離心 lOmin。
[0033] 6)將DNA制備管置于2ml離心管中，將步驟5中的混合液移至制備管中， 12, OOO Xg 離心 Imin0
[0034] 7)棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入500 μ I Buf fer Wl， 12, OOO Xg 離心 Imin0
[0035] 8)棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入700 μ I Buffer W2， 12, OOOXg離心lmin，以同樣的方法，用700 μ I Buffer W2再洗滌一次。
[0036] 9)棄濾液，將制備管置回原來的2ml離心管中，12, OOOXg離心lmin。
[0037] 10)將DNA制備管置于另一潔凈的I. 5ml離心管中，在制備管膜中央加100-200 μ 1 Eluent或去離子水，室溫靜置lmin，12, OOO X g離心Imin洗脫DNA。
[0038] 對上述提取得到的基因組DNA做電泳檢測，電泳結(jié)果如附圖1所示。
[0039] 2、設(shè)計并合成廣譜通用引物序列（SEQ ID N0:3所示的正向引物和SEQ ID N0:4 所示的反向引物）如下：
[0040] SEQ ID N0:3 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ；
[0041] SEQ ID N0:4 :5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0042] 3、采用上述的正向引物和反向引物，以所提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的組成為：
[0043] DNA 模板 2 μ 1、Q5Polymerase (5U/ul) 0· 25 μ 1、Q5Reaction Buffer (5 X)、Q5GC high Enhancer(5X)、2.5yM dNTP 2μ1、10μΜ 的上、下游引物各 ΙμL、加 ddH20 至 25μ1〇
[0044] PCR擴(kuò)增的條件為：98°C預(yù)變性30s，然后98°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸 30s，共27個循環(huán)，最后72°C延伸5min, 4°C至無窮。
[0045] PCR產(chǎn)物采用美國AxyPrep生物科技有限公司的DNA膠回收試劑盒純化，PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物的電泳圖如附圖2所示。
[0046] 4、使用美國Biotek FLX800熒光分析儀進(jìn)行定量，并等量混樣，用illumina TruSeq DNA PCR-Free LT Sample Preparation Kit進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)文庫構(gòu)建，并在miseq平臺上 機(jī)測序。
[0047] 由高通量測序結(jié)果可得到待測肉制品的以下COI序列（SEQ ID NO:5)信息：
[0048] GGCCGGTATAGTGGGCACTGCCCTCAGACTCTTAATTCGAGCTGAACTAGGCCAACCAGGTAGATTAAT TGGAAACGACCAAATTTATAATGTGATCGTCACAGCCCATGCATTTGTCATAATTTTCTTCATAGTGATACCGATCA TGATCGGGGGGTTTGGGAATTGACTACTGCCCCTAATGTTAGGAGCCCCAGACATAGCATTCCCCCGAATGAATAAC ATAAGCTTCTGGCTTTTACCCCCATCCCTAACTCTTCTGCTATCAAGGGGGTTAGTTGAAAGAGGTGTTGGGACAGG ATGAACTGTATATCCCCCCCTCTCTGCAGGAATTGCCCACGCAGGAGCCTCAGTAGACCTTGGAATCTTTTCTCTAC ACCTAGCAGGTGTATCATC