PDH正向引物；5 ' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 '
[0033]GAPDH反向引物：5 ' -GAAGATGGTGATGGGAITTC-3 '
[0034] 2?化學(xué)合成siRNA
[0035] 根據(jù)survivin基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)小分子干擾siRNA:
[0036]正義鏈：5，-GAGACAGAAUAGAGUGAUAtt-3，
[0037]反義鏈：5，-UAUCACUCUAUUCU⑶CUCtt-3，
[0038] 將該序列在人類EST數(shù)據(jù)庫中比對，確定沒有與它相同的其它基因序列。siRNA由 廣州銳博生物科技有限公司合成。
[0039]3.RT-PCR檢測survivin基因mRNA水平
[0040] 3. 1細(xì)胞培養(yǎng)：宮頸癌細(xì)胞Hela和人肺癌細(xì)胞A549分別在含10%FBS的DMEM培 養(yǎng)基中，37°C、5 %C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0041] 3. 2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染：將宮頸癌細(xì)胞Hela和人肺癌細(xì)胞A549按1X105個(gè)/孔 接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，兩種細(xì)胞分別設(shè)置未轉(zhuǎn)染組、siRNA10nM組、siRNA20nM組和 siRNA30nM組，共8組。在37°C、5%C02培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)過夜，在無雙抗含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照RNAiMAX?的說明書轉(zhuǎn)染，將實(shí)施例1步驟2中合成的siRNA分別按 10nM/孔、20nM/孔和30nM/孔加入兩組細(xì)胞對應(yīng)的分組。
[0042] 用基因特異性引物檢測樣本中survivinmRNA表達(dá)水平，同時(shí)擴(kuò)增看家基 因GAPDH作為內(nèi)參對照。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行。建立如下25yL反應(yīng)體系：4yL模板 RNA, 12. 5yL2XSensiMixone-step, 1yL5 '正向引物（6yM)，1yL3 '反向引物 (6yM)0.5yL50XSYBRGreenI，用無RNase水補(bǔ)足體系至25yL。反應(yīng)條件：40°C反轉(zhuǎn) 錄 30min，95°C預(yù)變性 7min，95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環(huán) 45 次。
[0043] 3. 4結(jié)果分析：用實(shí)時(shí)定量PCR分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖1所示，實(shí)驗(yàn)分 為四組，其中"未轉(zhuǎn)染"為未經(jīng)任何處理的細(xì)胞樣品，其他三組為本發(fā)明siRNA，濃度分別為 10nM、20nM、30nM。結(jié)果顯示革E1向survivin基因的siRNA沉默效果顯著，具有一定的濃度依 賴性。在siRNA為30nM時(shí)，survivin基因的沉默效率即可達(dá)到80%以上。
[0044] 實(shí)施例2 :survivin基因沉默對腫瘤細(xì)胞增殖影響
[0045]將宮頸癌細(xì)胞Hela、肝癌IfepG2和人肺癌細(xì)胞A549按5X103個(gè)/孔分別接種到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，三種細(xì)胞分別培養(yǎng)，分別進(jìn)行試驗(yàn)。在37 °C、5 % 0)2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24 小時(shí)，在無雙抗含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，按照RNAiMAX?的說明書轉(zhuǎn)染，實(shí)施例1步驟 2中合成的siRNA按10、20、40nM/孔加入，37°C孵育48小時(shí)后，每孔加入20yLMTT(5mg/ mL)，37°C繼續(xù)孵育4h，吸除培養(yǎng)基，加入200yLDMSO溶解甲瓚結(jié)晶，于490nm處測定吸光 度值。
[0046]MTT法檢測siRNA對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果，siRNA在20nM至50nM對腫瘤肺 癌A549、肝癌IfepG2、宮頸癌Hela和乳腺癌MCF-7的抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制率結(jié)果見表1。 用臨床上常用的抗腫瘤的順鉑作為siRNA的藥效對照藥物，順鉑在10yM至40yM對腫瘤 肺癌A549、肝癌IfepG2、宮頸癌Hela和乳腺癌MCF-7的抑制作用逐漸增強(qiáng)，作用48小時(shí)后， MTT法檢測的對腫瘤細(xì)胞的抑制率結(jié)果，見表2。
[0047] 表1siRNA作用48小時(shí)對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率（％ )
[0050] 表2順鉑作用48小時(shí)對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率（％ )[0051]
[0048]
[0049]
[0052] 由于細(xì)胞株A549、細(xì)胞株IfepG2、細(xì)胞株Hela和細(xì)胞株MCF-7分別為肺癌細(xì)胞株、 肝癌細(xì)胞株、宮頸癌細(xì)胞株和乳腺癌細(xì)胞株，所以本發(fā)明所述的siRNA可以用于肝癌、宮頸 癌和乳腺癌的治療。
[0053] 實(shí)施例3:WesternBlot檢測siRNA對survivin表達(dá)的抑制情況
[0054] 將人前列腺癌細(xì)胞PC-3、肝癌細(xì)胞IfepG2、乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞 Hela分別按1. 5X105個(gè)/孔接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，四種細(xì)胞分別培養(yǎng)，分別進(jìn)行試 驗(yàn)，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，在無雙抗含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，按照 RNAiMAX?的說明書轉(zhuǎn)染，siRNA按20nM/孔加入，37°C孵育48小時(shí)后，吸除培養(yǎng)基，用PBS洗 兩遍，加入100iiL細(xì)胞裂解液，在冰浴上裂解lOmin，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至1. 5ml離 心管中，lOOOOrpm離心5min后，取上清液測定蛋白濃度。每組取30yg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE， 電泳完成后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后進(jìn)行survivin-抗及羊抗兔二抗處理，然后進(jìn)行化學(xué) 發(fā)光反應(yīng)，顯影。結(jié)果見圖2,加入siRNA后細(xì)胞的suivivin蛋白表達(dá)量明顯低于不經(jīng)過 siRNA處理的陰性對照組。
[0055]在四種細(xì)胞系中，siRNA都能顯著的降低survivin蛋白的表達(dá)，所以本發(fā)明所述 的siRNA可以用于前列腺癌、肝癌、乳腺癌和宮頸癌的治療。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抑制survivin基因表達(dá)的雙鏈siRNA分子，其特征在于，具有如下序列結(jié)構(gòu)： 正義鏈 5 ' -GAGACAGAAUAGAGUGAUA-3 ' SEQ ID N0:1 反義鏈 5 ' -UAUCACUCUAUUCU⑶CUC-3 ' SEQ ID N0:2。2. -種抑制survivin基因表達(dá)的雙鏈siRNA分子，其特征在于，具有如下序列結(jié)構(gòu)： 正義鏈：5 ' -GAGACAGAAUAGAGUGAUA tt-3 ' SEQ ID N0:3 反義鏈：5 ' -UAUCACUCUAUUCU⑶CUC tt-3 ' SEQ ID N0:4。3. -種siRNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述siRNA重組質(zhì)粒包含權(quán)利要求1或2中所述 的雙鏈siRNA分子。4. 一種Survivin基因沉默試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1或2中所 述的雙鏈siRNA分子或權(quán)利要求2所述的siRNA重組質(zhì)粒。5. 權(quán)利要求1中或2所述的雙鏈siRNA分子或權(quán)利3所述的siRNA重組質(zhì)粒在制備抗 腫瘤藥物或抗腫瘤藥物組合物中的應(yīng)用。6. -種抗腫瘤藥物，其特征在于，含有有效量的如權(quán)利要求1或2中所述的雙鏈siRNA 分子或權(quán)利要求3所述的siRNA重組質(zhì)粒。7. 根據(jù)權(quán)利6中所述的抗腫瘤藥物，其中腫瘤是白血病、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宮頸 癌，乳腺癌，肺癌，肝癌中至少一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制survivin基因表達(dá)的siRNA分子及其應(yīng)用。具體涉及一種高效的小分子干擾RNA在制備調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期藥物中的應(yīng)用，這種高效的小分子干擾RNA雙鏈序列通過某種方式進(jìn)入到生物體內(nèi)時(shí)，能夠特異的抑制疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)，使有關(guān)疾病基因發(fā)生沉默，達(dá)到治療目的。該siRNA分子具有光譜的抗癌活性，如白血病、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌，乳腺癌，肺癌，肝癌等有顯著抑制效果，可以用于制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的藥物。
【IPC分類】C12N15/113, A61K31/713, A61P35/02, A61P35/00, C12N15/63
【公開號(hào)】CN105063048
【申請?zhí)枴緾N201510497040
【發(fā)明人】謝晶, 邢高揚(yáng), 李劍光, 滕樂生, 孟慶繁, 逯家輝, 劉艷, 權(quán)宇彤
【申請人】吉林大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月13日