改變型羰基還原酶及其基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種改變型羰基還原酶、其基因、含有該基因的載體、及利用該載體轉(zhuǎn) 化的轉(zhuǎn)化體。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為醫(yī)藥品或農(nóng)藥的合成原料及中間體有用的光學(xué)活性醇的制造方法之一，已知 有將羰基化合物的羰基利用微生物或酶進(jìn)行不對(duì)稱還原的方法。將羰基化合物還原的手性 酶（以下，羰基還原酶）在各種光學(xué)活性醇的制造中是有用的。
[0003] 在使用了羰基還原酶的不對(duì)稱還原反應(yīng)中，根據(jù)基質(zhì)或生成物、pH調(diào)整時(shí)所使用 的酸或堿、為了改善反應(yīng)液性而添加的表面活性劑或有機(jī)溶劑等，有時(shí)酶會(huì)失活或酶反應(yīng) 受到抑制。因此，能夠避免有機(jī)溶劑等導(dǎo)致的酶的失活或反應(yīng)抑制的羰基還原酶有利于縮 短反應(yīng)時(shí)間、提高反應(yīng)收率，在以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)光學(xué)活性醇方面更為有用。
[0004] 例如，嘗試了利用隨機(jī)變異導(dǎo)入的有機(jī)溶劑耐性的獲得，報(bào)導(dǎo)了對(duì)于2-丙醇或二 甲基亞砜具有耐性的還原酶（專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)1)。
[0005] 另一方面，現(xiàn)狀為：對(duì)工業(yè)使用性高的有機(jī)溶劑二甲基甲酰胺具有耐性的酶少，尚 無獲得對(duì)二甲基甲酰胺具有實(shí)用水平耐性的還原酶的報(bào)道。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1:日本2009-225773號(hào)公報(bào)
[0009] 非專利文獻(xiàn)
[0010]非專利文獻(xiàn)l:ChemSusChem，1，431-436(2008)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 發(fā)明所要解決的課題
[0012] 例如ezetimibe或Montelukast等許多醫(yī)藥品中間體與2_丙醇或二甲基亞砜相 比，對(duì)二甲基甲酰胺的溶解度高。如果可以在這種化合物的生產(chǎn)中使用二甲基甲酰胺耐性 酶，則可以改善反應(yīng)液性，可以期待獲得比使用其它有機(jī)溶劑時(shí)高的生產(chǎn)率。
[0013] 因此，本發(fā)明的課題在于，提供一種改變型羰基還原酶和/或生產(chǎn)該酶的轉(zhuǎn)化體， 所述改變型羰基還原酶改變了在二甲基甲酰胺存在下反應(yīng)性低的野生型酶，使其在存在有 機(jī)溶劑下的反應(yīng)性高于野生型酶。
[0014] 用于解決課題的技術(shù)方案
[0015] 本發(fā)明人等從在野生型酶基因中隨機(jī)地導(dǎo)入變異而制作的變異型酶庫中發(fā)現(xiàn)了 在存在有機(jī)溶劑下的反應(yīng)性較野生型酶提高了的改變型羰基還原酶，直至完成本發(fā)明。
[0016]g卩，本發(fā)明涉及一種多肽，其顯示以下（a)~（c)的性質(zhì)：
[0017] (a)與序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列具有78%以上的序列同一性；
[0018] (b)還原2-戊酮而生成2-戊醇；且
[0019] (c)與由序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列構(gòu)成的羰基還原酶相比，在存在 有機(jī)溶劑下對(duì)幾基化合物的反應(yīng)性尚、和/或熱穩(wěn)定性尚。
[0020] 優(yōu)選所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺。
[0021] 在序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列中，優(yōu)選選自下組中的1個(gè)以上氨基酸 導(dǎo)入了氨基酸取代，
[0022] 第2號(hào)、第22號(hào)、第25號(hào)、第39號(hào)、第42號(hào)、第45號(hào)、第51號(hào)、第56號(hào)、第71號(hào)、 第87號(hào)、第90號(hào)、第102號(hào)、第109號(hào)、第124號(hào)、第135號(hào)、第138號(hào)、第155號(hào)、第159號(hào)、 第175號(hào)、第177號(hào)、第183號(hào)、第190號(hào)、第195號(hào)、第212號(hào)、第220號(hào)、第226號(hào)、第228 號(hào)、第236號(hào)、第238號(hào)、第250號(hào)、第254號(hào)、第257號(hào)、第259號(hào)、第265號(hào)、第267號(hào)、第 270號(hào)、第279號(hào)、第298號(hào)、第300號(hào)、第301號(hào)、及第331號(hào)。
[0023] 優(yōu)選氨基酸取代為序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列中發(fā)生選自下組的氨 基酸取代中的1個(gè)以上氨基酸取代，
[0024] 第2號(hào)被取代為異亮氨酸、第22號(hào)被取代為精氨酸、第25號(hào)被取代為苯基丙氨 酸、第39號(hào)被取代為精氨酸、第42號(hào)被取代為精氨酸、第45號(hào)被取代為天冬氨酸、第51號(hào) 被取代為丙氨酸、第56號(hào)被取代為賴氨酸、第71號(hào)被取代為天冬酰胺或精氨酸、第87號(hào)被 取代為異亮氨酸、第90號(hào)被取代為甘氨酸、第102號(hào)被取代為異亮氨酸、第109號(hào)被取代為 甘氨酸、第124號(hào)被取代為亮氨酸、第135號(hào)被取代為丙氨酸、第138號(hào)被取代為天冬酰胺、 第155號(hào)被取代為亮氨酸或精氨酸、第159號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第175號(hào)被取代為天冬 氨酸、第177號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第183號(hào)被取代為蘇氨酸、第190號(hào)被取代為絲氨酸、 第195號(hào)被取代為亮氨酸、第212號(hào)被取代為苯基丙氨酸、蘇氨酸或酪氨酸、第220號(hào)被取 代為纈氨酸、第226號(hào)被取代為甘氨酸、第228號(hào)被取代為纈氨酸、第236號(hào)被取代為天冬 酰胺、第238號(hào)被取代為異亮氨酸、第250號(hào)被取代為脯氨酸、第254號(hào)被取代為天冬酰胺、 第257號(hào)被取代為絲氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第265號(hào)被取代為賴氨酸、第267號(hào) 被取代為脯氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、第279號(hào)被取代為精氨酸、第298號(hào)被取代為 脯氨酸、第300號(hào)被取代為天冬氨酸、第301號(hào)被取代為半胱氨酸、及第331號(hào)被取代為苯 基丙氨酸。
[0025] 優(yōu)選氨基酸取代為序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列中發(fā)生選自下組的氨 基酸取代中的1個(gè)以上氨基酸取代，
[0026] 第2號(hào)被取代為異亮氨酸、第45號(hào)被取代為天冬氨酸、第71號(hào)被取代為天冬酰胺 或精氨酸、第102號(hào)被取代為異亮氨酸、第124號(hào)被取代為亮氨酸、第175號(hào)被取代為天冬 氨酸、第177號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第183號(hào)被取代為蘇氨酸、第195號(hào)被取代為亮氨酸、 第220號(hào)被取代為纈氨酸、第226號(hào)被取代為甘氨酸、第236號(hào)被取代為天冬酰胺、第238 號(hào)被取代為異亮氨酸、第257號(hào)被取代為絲氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第265號(hào)被取 代為賴氨酸、第267號(hào)被取代為脯氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、第300號(hào)被取代為天冬 氨酸、及第301號(hào)被取代為半胱氨酸，
[0027] 與由序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列構(gòu)成的羰基還原酶相比，優(yōu)選其對(duì)有 機(jī)溶劑的穩(wěn)定性提尚。
[0028] 優(yōu)選氨基酸取代為序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列中導(dǎo)入有選自下述 (1)~（35)的氨基酸取代中的氨基酸取代，
[0029] (1)第71號(hào)被取代為天冬酰胺、第195號(hào)被取代為亮氨酸、
[0030] (2)第71號(hào)被取代為精氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、
[0031] (3)第71號(hào)被取代為精氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、
[0032] (4)第71號(hào)被取代為精氨酸、第300號(hào)被取代為天冬氨酸、
[0033] (5)第102號(hào)被取代為異亮氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、
[0034] (6)第177號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第220號(hào)被取代為纈氨酸、
[0035] (7)第226號(hào)被取代為甘氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、
[0036] (8)第257號(hào)被取代為絲氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、
[0037] (9)第257號(hào)被取代為絲氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、
[0038] (10)第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、
[0039] (11)第259號(hào)被取代為谷氨酸、第300號(hào)被取代為天冬氨酸、
[0040] (12)第267號(hào)被取代為脯氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、
[0041] (13)第270號(hào)被取代為蛋氨酸、第300號(hào)被取代為天冬氨酸、
[0042] (14)第2號(hào)被取代為異亮氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨 酸、
[0043] (15)第45號(hào)被取代為天冬氨酸、第175號(hào)被取代為天冬氨酸、第183號(hào)被取代為 蘇氨酸、
[0044] (16)第102號(hào)被取代為異亮氨酸、第226號(hào)被取代為甘氨酸、第267號(hào)被取代為脯 氨酸、
[0045] (17)第124號(hào)被取代為亮氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨 酸、
[0046] (18)第177號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為 蛋氨酸、
[0047] (19)第220號(hào)被取代為纈氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨 酸、
[0048] (20)第236號(hào)被取代為天冬酰胺、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋 氨酸、
[0049] (21)第238號(hào)被取代為異亮氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋 氨酸、
[0050] (22)第257號(hào)被取代為絲氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨 酸、
[0051] (23)第257號(hào)被取代為絲氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第300號(hào)被取代為天冬 氨酸、
[0052] (24)第259號(hào)被取代為谷氨酸、第265號(hào)被取代為賴氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨 酸、
[0053] (25)第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、第300號(hào)被取代為天冬 氨酸、
[0054] (26)第259號(hào)被取代為谷氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、第301號(hào)被取代為半胱 氨酸、
[0055] (27)第2號(hào)被取代為異亮氨酸、第238號(hào)被取代為異亮氨酸、
[0056] (28)第71號(hào)被取代為天冬酰胺、第195號(hào)被取代為亮氨酸、
[0057] (29)第109號(hào)被取代為甘氨酸、第331號(hào)被取代為苯基丙氨酸、
[0058] (30)第124號(hào)被取代為亮氨酸、第236號(hào)被取代為天冬酰胺、
[0059] (31)第159號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、
[0060] (32)第42號(hào)被取代為精氨酸、第155號(hào)被取代為精氨酸、第279號(hào)被取代為精氨 酸、
[0061] (33)第45號(hào)被取代為天冬氨酸、第175號(hào)被取代為天冬氨酸、第183號(hào)被取代為 蘇氨酸、
[0062] (34)第155號(hào)被取代為亮氨酸、第250號(hào)被取代為脯氨酸、第298號(hào)被取代為脯氨 酸、及
[0063] (35)第56號(hào)被取代為賴氨酸、第138號(hào)被取代為天冬酰胺、第190號(hào)被取代為絲 氨酸、第254號(hào)被取代為天冬酰胺。
[0064] 優(yōu)選氨基酸取代為選自下組的氨基酸取代中的1個(gè)以上氨基酸取代，
[0065]第22號(hào)被取代為精氨酸、第39號(hào)被取代為精氨酸、第51號(hào)被取代為丙氨酸、第87 號(hào)被取代為異亮氨酸、第90號(hào)被取代為甘氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、及第270號(hào)被取 代為蛋氨酸，
[0066] 與由序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列構(gòu)成的羰基還原酶相比，優(yōu)選其對(duì)有 機(jī)溶劑導(dǎo)致的反應(yīng)抑制的抵抗性提高。
[0067] 優(yōu)選氨基酸取代為序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列中發(fā)生選自下述（1)~ (7)的氨基酸取代中的1個(gè)以上的氨基酸取代，
[0068] (1)第22號(hào)被取代為精氨酸、
[0069] (2)第22號(hào)被取代為精氨酸、第87號(hào)被取代為異亮氨酸、
[0070] (3)第39號(hào)被取代為精氨酸、
[0071] (4)第39號(hào)被取代為精氨酸、第51號(hào)被取代為丙氨酸、
[0072] (5)第51號(hào)被取代為丙氨酸、
[0073] (6)第87號(hào)被取代為異亮氨酸、及
[0074] (7)第90號(hào)被取代為甘氨酸。
[0075]另外，本發(fā)明涉及一種編碼所述多肽的多核苷酸。
[0076]另外，本發(fā)明涉及一種含有所述多核苷酸的載體。
[0077] 優(yōu)選還含有編碼具有還原型輔酶再生能力的多肽的多核苷酸。
[0078] 優(yōu)選具有還原型輔酶再生能力的多肽為葡萄糖脫氫酶。
[0079]另外，本發(fā)明涉及一種利用所述載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體。
[0080] 優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0081]另外，本發(fā)明涉及一種醇化合物的制造方法，其特征在于，使所述多肽、或所述轉(zhuǎn) 化體和/或其處理物與羰基化合物作用。
[0082] 優(yōu)選所述羰基化合物為非對(duì)稱酮，所述醇化合物為光學(xué)活性醇。
[0083] 優(yōu)選所述羰基化合物為下述式（1)表示的非對(duì)稱酮，
[0084]
[0085](式中，R1及R2為氫原子、鹵原子、任選被取代的烷基、任選被取代的芳烷基、任選 被取代的芳基、任選被取代的烷氧基、氨基或硝基，或R1和R2可以相互鍵合而成環(huán)。其中， R1和R2的結(jié)構(gòu)不同），
[0086] 所述醇化合物為下述式（2)表示的光學(xué)活性醇，
[0087]
[0088] (式中，R1、R2與上33^日丨〇」，太衣不于T王恢J。
[0089] 發(fā)明的效果
[0090] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種存在有機(jī)溶劑下的反應(yīng)性比野生型高的改變型羰基還 原酶及其基因、含有該基因的載體、利用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的處理物的制造方 法。
【具體實(shí)施方式】
[0091] 本發(fā)明的多肽的特征在于，顯示以下（a)~（c)的性質(zhì)：
[0092] (a)與序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列具有78%以上的序列同一性、（b)還 原2-戊酮而生成2-戊醇、且（c)與由序列表的序列號(hào)1中記載的氨基酸序列構(gòu)成的羰基 還原酶相比，在存在有機(jī)溶劑下對(duì)羰基化合物的反應(yīng)性高、和/或熱穩(wěn)定性高。
[0093][變異的記載方法]
[0094] 需要說明的是，在本說明書中，氨基酸、肽、蛋白質(zhì)使用下述所示的IUPAC-IUB生 物化學(xué)命名委員會(huì)（CBN)所采用的簡寫符號(hào)表示。另外，只要沒有特別明示，肽及蛋白質(zhì)的 氨基酸殘基的序列以從左端到右端從N末端至C末端的方式表示。另外，為了易于參照，適 用一般所使用的下述命名法。1個(gè)是記述為"原來的氨基酸；位置；取代的氨基酸"的方法， 例如，位置64上的酪氨酸被天冬氨酸取代表示為"Y64D"。關(guān)于多重變異，通過利用連字符 記號(hào)"一"分開而記載。例如，"S41A-Y64D"表示將位置41的絲氨酸取代為丙氨酸、且將位 置64的酪氨酸取代為天冬氨酸。
[0095][氨基酸的簡寫符號(hào)]
[0096]A=Ala=丙氨酸、C=Cys=半胱氨酸、
[0097] D=Asp=天冬氨酸、E=Glu=谷氨酸、
[0098]F=Phe=苯基丙氨酸、G=Gly=甘氨酸、
[0099]H=His=組氨酸、I=lie=異亮氨酸、
[0100] K=Lys=蓖麻蛋白、L=Leu=亮氨酸、
[0101]M=Met=蛋氨酸、N=Asn=天冬酰胺、
[0102]P=Pro=脯氨酸、Q=Gin=谷氨酰胺、
[0103]R = Arg=精氨酸、S =Ser =絲氨酸、
[0104]T = Thr=蘇氨酸、V =Val =繳氨酸、
[0105] W = Trp=色氨酸、Y =Tyr =酪氨酸
[0106][序列同一性]
[0107]多肽或多核苷酸的"序列同一性"用下述所得的數(shù)值表示：使要對(duì)比的2個(gè)多肽或 多核苷酸適當(dāng)排列，用兩者序列中氨基酸或核酸堿基（例如A、T、C、G、U、或I) 一致的位置 個(gè)數(shù)除以比較堿基總數(shù)，并將該結(jié)果乘以100所得的數(shù)值。
[0108] 序列同一性例如可以使用以下的序列分析用工具算出：GCGWisconsin Package(Wisconsin大學(xué)）、theExPASyWorldWideWeb分子生物學(xué)用服務(wù)器（瑞士生物 信息學(xué)研究所）、BLAST(美國生物工程信息中心）、GENETYX(GENETYX公司）。
[0109] 在本發(fā)明中，導(dǎo)入變異之前的野生型酶由序列表的序列號(hào)1表示的335個(gè)氨基酸 殘基構(gòu)成，為具有將2-戊酮還原而成2-戊醇的能力的多肽。
[0110]多肽的起源沒有限定，優(yōu)選為屬于酵母菌科（Saccharomycetaceae)、更優(yōu)選 Vanderwaltozyma屬的微生物，進(jìn)一步優(yōu)選為屬于Vanderwaltozymapolyspora種的微 生物，特別優(yōu)選為VanderwaltozymapolysporaNBRC0996株來源的羰基還原酶。該微生 物可以由獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物技術(shù)本部生物遺傳資源部門（NBRC: 〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)獲得。
[0111] 本發(fā)明的野生型酶利用序列表的序列號(hào)2所示的多核苷酸進(jìn)行編碼。例如， 可以按照MolecularCloning2ndEdition(JosephSambrook，ColdSpringHarbor LaboratoryPress(1989))等中所記載的通常的基因工程方法從屬于酵母科、優(yōu)選 Vanderwaltozyma屬、更優(yōu)選Vanderwaltozymapolyspora種的微生物、進(jìn)一步優(yōu)選 VanderwaltozymapolysporaNBRC0996 株中取得。
[0112] 即，通過從VanderwaltozymapolysporaNBRC0996 株的基因組DNA中用[參考例 1]中記載的方法進(jìn)行PCR，可以擴(kuò)增編碼序列號(hào)1表示的氨基酸序列的多核苷酸、或序列號(hào) 2表示的多核苷酸而制備野生型酶基因。
[0113] 本發(fā)明的多肽可以為在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中加以改變而得到的多肽。
[0114] 作為加入序列號(hào)1所示的氨基酸序列中的改變，可列舉取代、添加、插入或缺失， 既可以包含僅1種改變（例如取代），也可以含有2種以上的改變（例如取代和插入）。上 述"多個(gè)氨基酸"是指例如40個(gè)、優(yōu)選20個(gè)、更優(yōu)選10個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選8個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、 或2個(gè)氨基酸。
[0115] 另外，加入了改變之后的氨基酸序列與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的序列同一性 為85%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選92%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、97%以上、98%以上、 98. 5%以上、99%以上。
[0116] 在序列表的序列號(hào)1所示的氨基酸序列中，氨基酸發(fā)生了取代、插入、缺失、添加 的位置沒有特別限制，優(yōu)選為導(dǎo)入了下述氨基酸取代的多肽：序列表的序列號(hào)1所示的氨 基酸序列中選自 2、22、25、39、42、45、51、56、71、87、90、102、109、124、135、138、155、159、 175、177、183、190、195、212、220、226、228、236、238、250、254、257、259、265、267、270、279、 298、300、301、及第331號(hào)中的1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生取代。
[0117] 進(jìn)一步優(yōu)選在序列表的序列號(hào)1所示的氨基酸序列中選自下組中的1個(gè)以上的氨 基酸導(dǎo)入了氨基酸取代的多肽：第2號(hào)被取代為異亮氨酸、第22號(hào)被取代為精氨酸、第25 號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第39號(hào)被取代為精氨酸、第42號(hào)被取代為精氨酸、第45號(hào)被取代 為天冬氨酸、第51號(hào)被取代為丙氨酸、第56號(hào)被取代為賴氨酸、第71號(hào)被取代為天冬酰胺 或精氨酸、第87號(hào)被取代為異亮氨酸、第90號(hào)被取代為甘氨酸、第102號(hào)被取代為異亮氨 酸、第109號(hào)被取代為甘氨酸、第124號(hào)被取代為亮氨酸、第135號(hào)被取代為丙氨酸、第138 號(hào)被取代為天冬酰胺、第155號(hào)被取代為亮氨酸或精氨酸、第159號(hào)被取代為苯基丙氨酸、 第175號(hào)被取代為天冬氨酸、第177號(hào)被取代為苯基丙氨酸、第183號(hào)被取代為蘇氨酸、第 190號(hào)被取代為絲氨酸、第195號(hào)被取代為亮氨酸、第212號(hào)被取代為苯基丙氨酸、蘇氨酸或 酪氨酸、第220號(hào)被取代為纈氨酸、第226號(hào)被取代為甘氨酸、第228號(hào)被取代為纈氨酸、第 236號(hào)被取代為天冬酰胺、第238號(hào)被取代為異亮氨酸、第250號(hào)被取代為脯氨酸、第254號(hào) 被取代為天冬酰胺、第257號(hào)被取代為絲氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第265號(hào)被取代 為賴氨酸、第267號(hào)被取代為脯氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、第279號(hào)被取代為精氨酸、 第298號(hào)被取代為脯氨酸、第300號(hào)被取代為天冬氨酸、第301號(hào)被取代為半胱氨酸、及第 331號(hào)被取代為苯基丙氨酸。
[0118] 另外，從對(duì)有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性提尚的觀點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明的多妝優(yōu)選在序列表的序 列號(hào)1所示的氨基酸序列中導(dǎo)入了選自下組中的1個(gè)以上氨基酸取代：第2號(hào)被取代為異 亮氨酸、第45號(hào)被取代為天冬氨酸、第71號(hào)被取代為天冬酰胺或精氨酸、第102號(hào)被取代 為異亮氨酸、第124號(hào)被取代為亮氨酸、第175號(hào)被取代為天冬氨酸、第177號(hào)被取代為苯 基丙氨酸、第183號(hào)被取代為蘇氨酸、第195號(hào)被取代為亮氨酸、第220號(hào)被取代為纈氨酸、 第226號(hào)被取代為甘氨酸、第236號(hào)被取代為天冬酰胺、第238號(hào)被取代為異亮氨酸、第257 號(hào)被取代為絲氨酸、第259號(hào)被取代為谷氨酸、第265號(hào)被取代為賴氨酸、第267號(hào)被取代 為脯氨酸、第270號(hào)被取代為蛋氨酸、第300號(hào)被取代為天冬氨酸、及第301號(hào)被取代